多重聚合酶链式反应-毛细管电泳技术检测5种食源性致病菌

目的利用多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)-毛细管电泳技术,构建一种快速检测沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的方法。方法针对5种食源性致病菌,选择保守性较好的致病基因设计特异性多重PCR引物,利用毛细管电泳成像分析多重PCR产物。通过对PCR及电泳条件进行优化,建立5种食源性致病菌的多重PCR-毛细管电泳检测方法,并对其特异性、灵敏度进行研究。结果5对引物特异性良好,均未出现非特异性扩增,多重PCR最佳引物浓度为0.2μmol/L,最佳退火温度为56.0℃,毛细管电泳最佳分离模式为AM900,灵敏度较高,检测灵敏度可达到5×10^(-3) ng/μL。结论本研究建立的多重PCR-毛细管电泳方法用于检测5种食源性致病菌,操作简便、特异性和灵敏度高,在食源性致病菌检验中具有较好的实用价值。

应用多重聚合酶链式反应检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的研究

根据鸡毒支原体 (MG)、禽衣阿华支原体 (MI)、鸡滑液囊支原体 (MS)的基因文库 ,设计了 3对分别与MG、MI、MS某段基因序列互补的引物。用这 3对引物对同一样品中的MG、MI、MSDNA模板进行多重聚合酶链式反应 (PCR)扩增 ,结果均同时得到了 3条特异性的大小与实验设计相符的 732bp (MG)、 2 99bp (MI)、 2 0 7bp (MS)多重的PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果能同时检出 1pg的MG。

16S rRNA基因及多重聚合酶链式反应在新生儿败血症早期诊断中的应用研究

目的分析16S rRNA基因聚合酶链式反应(PCR)检测方法及血培养方法检测疑似新生儿败血症患儿血标本中潜在病原菌的病原学特点,并以此为基础建立一套适用于临床的可检测新生儿败血症常见菌株的特异性引物多重PCR体系。方法建立16S rRNA通用引物PCR检测方法并检测534例疑似新生儿败血症患儿血标本,分析其病原学感染及特点,与常规血培养检测结果进行比较。建立适用于临床的可检测新生儿败血症常见菌株的特异性引物多重PCR体系。结果 534例血标本的血培养阳性率为26%,经鉴定为凝固酶阴性葡萄球菌(44.6%)、大肠埃希菌(14.4%)、无乳链球菌(8.6%)、金黄色葡萄球菌(7.9%)、肺炎克雷伯菌(5.8%)、屎肠球菌(4.3%)、其他菌株(14.4%)。16S rRNA通用引物PCR检测阳性率为37.6%,显著高于血培养检测(P<0.05)。经优化的多重PCR体系可快速准确检测败血症常见菌种。结论 16S rRNA基因PCR方法用于新生儿败血症的检测具有较高的检出率,可用于临床新生儿败血症的快速诊断。本研究初步建立的败血症常见致病菌特异性引物多重PCR体系具有一定的临床应用价值。

反转录巢式多重聚合酶链式反应体系检测单细胞中时钟基因表达

目的建立一种高度灵敏的能够在单细胞水平检测时钟基因表达的反转录巢式多重聚合酶链式反应(multiplex nestedreverse transcription-polymerase chain reaction,multiplex nested RT-PCR)体系。方法选取核心时钟基因bmal1,clock,per1,per2,cry1和cry2,以及看家基因β-actin,分别设计和优化巢式引物对。以基因质粒为模板,检测巢式多重PCR体系的灵敏度。体外转录得到各个基因的RNA模板,并检测反转录巢式多重PCR体系的灵敏度。使用手动微操作器,显微镜下负压获取悬浮单个NIH/3T3细胞,使用反转录巢式多重PCR体系检测其中目的时钟基因。应用实时定量PCR检测整体水平时钟基因表达情况,与单细胞水平进行比较。结果巢式多重PCR检测体系可以检测出单拷贝质粒DNA。反转录巢式多重PCR能够检测出4拷贝RNA模板。利用上述体系发现,NIH/3T3单细胞中时钟基因环路表达存在很大差异,同时发现群体水平per1和per2表达的高峰和低谷间差异有统计学意义,而单细胞水平per1表达则差异无统计学意义。结论建立了高度灵敏的用于检测时钟基因表达的反转录巢式多重PCR体系,揭示了单细胞水平时钟基因表达的异质性,也验证了整体水平与单细胞水平时钟基因表达的差异。

基于多重聚合酶链式反应和表面增强拉曼光谱技术的食源性病原菌检测模型的建立与比较

建立基于多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman scattering,SERS)的沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌检测模型,优化检测方案,提高食源性病原菌检测效率。以病原菌hil A、uid A和clf A的基因序列设计特异性引物,优化多重PCR反应的扩增条件,检测多重PCR的特异性和灵敏性。通过SERS技术检测3种细菌并确定检测限,对3种病原菌进行主成分分析,然后对2种方法的检测限进行比较。结果显示,建立的多重PCR和SERS技术均可特异性地检测出沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,三重PCR反应的最低检测限为104 CFU/mL,最低检出DNA量为50 pg/μL,而SERS检测沙门氏菌最低检出量为103 CFU/mL,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低检出量为104 CFU/mL。PCA分析的前2个主成分的累积贡献率达93.8%。与多重PCR相比,研究建立的SERS方法提高了沙门氏菌的检测限,敏感度更高,并且缩短了检测时间,对食品中食源性病原菌的监测起到指导作用。

多重聚合酶链式反应技术检测罗非鱼5种常见食源性致病菌

目的 建立一种可同时检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门菌(Salmonella) 5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法 根据5种致病菌特异性基因片段设计并合成引物,优化多重PCR体系条件,并对多重PCR体系的特异性、灵敏度以及人工模拟样品进行检测。结果 建立的多重PCR方法可同时扩增5种目的菌株的特异性条带,且不与非靶标细菌发生交叉反应。敏感性实验结果显示,该方法对无乳链球菌、嗜水气单胞菌、沙门菌、霍乱弧菌、大肠杆菌纯培养物基因组DNA的检出限均为0.4 ng/μL。人工模拟样品检测结果显示,该方法可以快速且准确地检测上述5种食源性致病菌,且检出限可达到2×10^(1)CFU/g。结论 本研究建立了一种可同时检测无乳链球菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和沙门菌5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重PCR检测方法。该方法的建立为罗非鱼常见食源性致病菌的快速检测提供了重要的技术手段。

黄曲霉素产毒真菌多重聚合酶链式反应体系的建立

目的探讨黄曲霉素产毒真菌DNA的提取方法,并建立其多重聚合酶链式反应(PCR)检测体系。方法优选最佳DNA提取试剂盒和样品处理方式;根据杂色曲霉1(Ver-1)、杂色曲霉B(VerB)、ITS序列分别设计多重PCR引物,优化PCR体系,评价引物的特异性和灵敏性,以黄曲霉素产毒真菌验证体系的适用性。结果液氮研磨后,以Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取效果最佳;所设计的多重PCR引物特异性良好,灵敏度达到1 ng/μL,该体系在7 d内的重复性和稳定性均良好。结论所建立的多重PCR检测体系可用于黄曲霉素产毒真菌的测定,可快速检出该类真菌。

呼吸机相关肺炎最常见七种病原体多重聚合酶链式反应-毛细管电泳检测平台的建立

目的:建立可同时检测呼吸机相关肺炎最常见7种病原体的多重聚合酶链式反应(PCR)-毛细管电泳检测平台,评估其新检测平台的有效性。方法:选择2019年4月~2022年12月于本院重症监护病房接受机械通气后发生呼吸机相关肺炎的56例患者作为研究对象,提取患者的呼吸道病原体,选择目标病原体后建立7种目标病原体的多重PCR反应,并结合毛细管电泳检测技术,建立多重PCR-毛细管电泳检测平台,评估其平台的特异性和灵敏性。结果:建立的多重PCR-毛细管电泳检测平台检测鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单孢菌的敏感性和特异性明显,且与单重荧光定量PCR检测结果的符合率均高于90%(P<0.05)。结论:多重PCR-毛细管电泳检测平台的建立可用于呼吸机相关肺炎最常见7种病原体的检测中,且有效性较好。

多重实时荧光定量聚合酶链式反应在芝麻酱掺假鉴别中的应用

目的研究基于分子生物学技术,建立多重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测芝麻酱中的植物源性成分,实现芝麻酱的快速掺假鉴别,突破单标准单物种检测的局限性。方法该研究以芝麻2S albumim mRNA基因、花生Ara b2基因、大豆Lectin基因、玉米adh1基因设计特异性引物和探针,优化反应体系,建立多重实时荧光定量PCR技术检测芝麻酱中的芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分,并应用于市售的芝麻酱样本检测分析。结果该方法高效低成本,特异性好,对小米、绿豆等10种非目标源性成分无特异性扩增;对芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分的最低检出限为100 pg/μL,具有较高的灵敏度;应用建立的方法,对市售21份芝麻酱样本进行检测分析,检测结果与标签标注不符合的有4份,标签标注符合率为80.95%,与参比方法检测结果一致。结论建立的多重实时荧光定量PCR技术对加工成品的检测具有较好的适用性,为芝麻酱的掺假鉴别提供了一种新的分子生物学方法。

GeXP多重聚合酶链式反应法检测5种常见食源性致病菌

目的建立一种基于GeXP(GenomeLabTM eXpress Profiling)遗传分析系统的5种常见食源性致病菌检测的新技术。方法针对5种常见食源性致病菌(沙门菌、大肠埃希菌O157∶H7、单核细胞增生李斯特菌、志贺菌和副溶血性弧菌)分别进行基因序列比对(invA、rfbE、PfrA、IpaH、tlh基因),设计特异性引物,建立并优化GeXP多重聚合酶链式反应(PCR)体系,评价其特异性和灵敏性,并初步应用于未知菌株和人工污染样品的检测。结果GeXP多重PCR法可实现在5 h内同时对5种常见食源性致病菌进行检测,且检测灵敏度可低至103 CFU/mL。多重体系中各引物对各目标菌有较强特异性,未检出其他非目标菌。结论本方法可有效提高检测效率,为食源性致病菌的快速高通量检测提供了参考思路。

多重聚合酶链式反应技术及其应用

标准的聚合酶链式反应是使用一对引物扩增一个特定的核酸序列,即单一引物对的PCR.但是在具体工作中有时需要同时对多个核酸序列进行扩增分析.显然,单引物对PCR要完成这类工作,需要耗费较多的时间和金钱.1988年,Chamberlain等[1]描述了一种多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction, M-PCR).

基于多重聚合酶链式反应方法的鼠疫耶尔森菌差异区段分型技术的建立与应用

目的利用多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法，扩增鼠疫耶尔森菌（简称鼠疫菌）DNA中的差异区段（differentregion，DFR），探讨建立鼠疫菌多重DFR分型技术的可行性。方法根据鼠疫菌23个DFR及pMT质粒的靶标产物长度，将24对引物进行优化组合，通过不同的组合在一个PCR反应体系中加人多对引物．针对已知阳性DNA模板扩增出多个目的片段。并将200株野生鼠疫菌DNA经多重PCR和普通PCR扩增，验证这两种方法的符合率。结果用已知阳性DNA模板扩增出24个目的片段。通过不同的排列组合，将24对引物优化组合出9个组。通过200株野生鼠疫菌DNA验证多重PCR和普通PCR的符合率为100％。结论利用多重PCR方法对鼠疫菌DNA中的DFR进行分型是可行的，应用该方法能为大批量鼠疫菌DFR分型鉴定提供高效、经济且准确率高的实验手段。

多重聚合酶链式反应在脓毒血症病原体检测中的应用

目的探讨多重聚合酶链式反应(PCR)在脓毒血症病原体检测中的灵敏度、特异性及检测时间,为多重PCR在脓毒血症病原体检测中的应用提供理论依据。方法采用多重PCR和血培养检测医院40例脓毒血症患者血液中的病原体,并比较两种检测方法的灵敏度、特异性、检测速度、检测菌种的差异,并以同期40名健康体检者血标本作为对照;采用SPSS 15.0软件进行数据处理,检测阳性结果以率的形式表示,并进行χ2检验。结果对照组中两种方法的阳性率差异无统计学意义,脓毒血症组多重PCR检测的阳性率为55.0%,血培养为82.5%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05),且血培养检测出18例脓血症患者中共有11例PCR检测为阳性,占61.1%;多重PCR特异性为80.7%,灵敏度为95.7%;脓毒血症组多重PCR的平均检测时间为(6±0.56)h,血培养法为(30.78±1.45)h,差异有统计学意义(P<0.05);从22份阳性血培养中共分离出4种病原菌,分别为金黄色葡萄球菌10株、铜绿假单胞菌7株、鲍氏不动杆菌3株、表皮葡萄球菌2株,多重PCR均能检测上述病原菌的DNA。结论在脓毒血症病原学的检测中,多重PCR较血培养具有更高的敏感性和特异性,检测时间也较血培养明显缩短,有利于脓毒血症病原体的快速检测,指导临床用药。

一种基于多重实时荧光聚合酶链式反应熔解曲线分析的肉及肉制品掺假鉴别方法

为实现肉及肉制品掺假快速鉴别,分别以猪、牛线粒体DNA的COXⅠ,绵羊、山羊、狗、狐狸、貉线粒体DNA的16S rRNA及鸡、鸭线粒体DNA的12S rRNA基因为靶位点,设计扩增产物熔解温度(T_m值)具有显著性差异的特异性引物,建立一种用于快速鉴别肉或肉制品中猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉9种源性成分的5重实时荧光聚合酶链式反应熔解曲线分析方法,通过特异性、灵敏度及市售样品的检测,对该方法进行检验和评价。结果表明:方法具有良好的特异性及灵敏度,单物种DNA检出限为0.001~1 ng,多物种混合DNA检出限均为0.1 ng,通过市售样品检测表明该方法可用于实际样品(包括生鲜样品和熟制样品)掺假的快速鉴别。

多重反转录聚合酶链式反应检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的研究

利用多重反转录聚合酶链式反应同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒.在GenBank中搜索H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,并利用DNAStar软件分析其相似性,利用Primer Premier 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物.这3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228和830 bp.结果表明,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术.该多重RT-PCR对H5、H7和H9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228和830 bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原的核酸不存在交叉反应.该多重RT-PCR对H5、H7和H9亚型AIV cDNA的最低检出量分别为10 pg、1 ng和10 pg.

应用多重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和鸡毒支原体的研究

本文建立了一种同时检测NDV、IBV、ILTV和MG 4种病原体的多重PCR技术。根据NDV、IBV、ILTV和MG的基因文库 ,设计了 4对分别与NDV、IBV、ILTV和MG某段基因序列互补的引物 ,用这 4对引物对同一样品中的NDV、IBV、ILTV、MGRVA或DNA模板进行多重PCR扩增 ,结果均同时得到了 4条特异性大小与实验设计相符的 310bp(NDV)、172 0bp(IBV)、6 47bp(ILTV)、和 732bp(MG)多重PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果表明 ,该多重PCR技术能检出 10pg的IBV、1pg的NDVRNA模板和 10pg的ILTV、1pg的MGDNA模板。

聚合酶链式反应检测酒酒球菌氨基酸脱羧酶基因

利用聚合酶链式反应(PCR)和多重PCR方法,采用3对特异性引物,检测40株酒酒球菌基因组中是否含有组氨酸脱羧酶基因(hdc基因)、酪氨酸脱羧酶基因(tdc基因)和鸟氨酸脱羧酶基因(odc基因)。结果表明:40株酒酒球菌基因组中有33株酒酒球菌含有组氨酸脱羧酶,22株酒酒球菌含有酪氨酸脱羧酶,16菌株含有鸟氨酸脱羧酶。建立的PCR法可快捷、高度特异地检测酒酒球菌中含有的hdc基因、tdc基因和odc基因。

多重实时聚合酶链式反应熔解曲线法同步鉴别蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭

为实现鱼类及其制品掺假的快速鉴别,以蓝鳍金枪鱼(Thunnus thynnus)线粒体DNA的D-loop区、裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)线粒体DNA的16S rRNA基因及异鳞蛇鲭(Lepidocybium flavobrunneum)线粒体DNA的ND4L基因为靶位点,设计扩增产物熔解温度(Tm)具有显著性差异的特异性引物,建立一种快速鉴别鱼类及其制品中蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭源性成分的3重实时聚合酶链式反应熔解曲线分析法,通过引物特异性、灵敏度及市售样品的检测,对该方法进行检验和评价。结果表明:构建优化的方法具有良好的特异性及灵敏度,单物种DNA检出限为0.001 ng,多物种混合DNA检出限均为0.1 ng,蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭源性成分的相对检出限分别为0.5%、1%、0.5%,通过对市售样品的检测表明,该方法可用于实际样品掺假的快速鉴别。

基于单核苷酸多态性位点的多重实时荧光定量聚合酶链式反应法鉴别当雄高山牦牛肉

通过比对5个不同地区牦牛线粒体基因的差异,筛选出用于鉴定当雄高山牦牛的11个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,将这些SNP位点作为引物3′端,同时引入引物碱基错配理念,设计出8对特异性引物,构建出2个三重和1个二重实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)体系,建立一种基于SNP位点和多重RT-PCR技术鉴别当雄高山牦牛肉的方法。结果表明:该方法特异性较好、简便快捷、结果直观可靠,能够有效鉴别当雄高山牦牛肉;方法中3个RT-PCR反应体系扩增产物对应的熔解温度(melting temperature,Tm)范围分别为反应体系A:73.1~75.2、76.0~77.3、79.0~80.0℃,反应体系B:69.5~72.8、75.0~77.9、78.5~80.0℃,反应体系C:76.1~78.1、79.5~80.7℃;根据3个反应体系中熔解曲线峰的有无以及Tm是否符合取值范围来判定样品是否为当雄高山牦牛肉;市售样品测定结果表明,该方法可用于实际样品中当雄高山牦牛肉的快速鉴别。

流式细胞术与不同类型聚合酶链式反应技术用于儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病监测的比较

[目的]比较流式细胞术(FCM)与多种聚合酶链式反应(PCR)技术在儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病(MRD)监测中的应用价值。[方法]选择2016年1月至2018年12月本院收治的170例急性淋巴细胞白血病患儿,且均接受SCCLG-ALL-2016方案治疗。在初诊时通过FCM行免疫分型检测以及通过PCR技术检测急性淋巴细胞白血病融合基因和免疫球蛋白(Ig)及T细胞表面受体(TCR)基因重排;治疗dus通过FCM及不同类型PCR技术(RT-qPCR、巢式RT-PCR、多重PCR)进行MRD监测。分析FCM与不同类型PCR技术对MRD监测结果有无差异。[结果]FCM检测MRD阳性率较RT-qPCR和巢式RT-PCR高,但差异无统计学意义(P>0.05)。FCM检测MRD阳性率较多重PCR高,且其差异具有统计学意义(χ^(2)=34.03,P<0.05)。RT-qPCR、巢式RT-PCR及FCM技术检测MRD阳性患者均较阴性患者OS低,但其差异无统计学意义(P>0.05)。多重PCR技术检测MRD阳性患者较阴性患者OS低,差异有统计学意义(P<0.005)。[结论]FCM方法与RT-qPCR或巢式RT-PCR技术检测白血病特异性融合基因均适用于急性淋巴细胞白血病患儿MRD监测,灵敏度高,特异性强;多重PCR方法检测IG或TCR基因重排进行MRD监测,特异性强,但灵敏度较低。