液相色谱-串联质谱法同时测定贝类中大田软海绵酸、鳍藻毒素、蛤毒素和虾夷扇贝毒素

建立了同时测定贝类中大田软海绵酸(okadaic acid,OA)及其衍生物鳍藻毒素(dinophysistoxin-1,DTX-1)、蛤毒素(pectenotoxin-2,PTX-2)和虾夷扇贝毒素(yessotoxin,YTX)的液相色谱-串联质谱分析方法。样品经甲醇提取,固相萃取柱净化,C18色谱柱分离,经含甲酸和甲酸铵的乙腈-水溶液为流动相梯度洗脱,选择反应监测(SRM)模式检测,正、负离子切换扫描,基质标准校正,外标法定量。结果表明,OA、DTX-1和YTX的线性范围为2.0～200.0μg/L,定量限(以信噪比(S/N)≥10计)为1.0μg/kg;PTX-2的线性范围为1.0～100.0μg/L,定量限为0.5μg/kg;几种化合物的添加平均回收率为83.1%～105.7%,相对标准偏差(RSD)为3.16%～9.29%。成功应用本法对黄海灵山湾海域采集的贝类样品进行了分析,发现部分样品中含有大田软海绵酸、鳍藻毒素、蛤毒素和虾夷扇贝毒素。

大田软海绵酸单克隆抗体ELISA检测方法的建立

利用BALB／c小鼠腹水大量制备抗大田软海绵酸（okadaic acid，OA）的单克隆抗体，并以此抗体为探针建立了0A的快速、灵敏、简便的ELISA检测方法——直接和间接竞争抑制性ELISA方法，2种检测方法的回归方程和相关系数分别为：y=-38．678χ＋130．01，R^2=0．9886和y=-34．212x＋83．49，R^2=0．9784，线性范围为1.56～75μg／L和0.4425μg／L，对OA的最低检出质量浓度为0．6μg／L和0．18μg／L。并利用所建立的2种ELISA方法对贝类模拟样品及实际样品进行了检测，样品回收率分别为84．72％和98．38％。结果表明，此方法可满足海产品中贝类样品0A限量标准检测。

基于聚硫堇/亚甲基蓝和纳米金放大的免疫传感器检测贝类毒素大田软海绵酸

采用聚硫堇（PTH）修饰电极为传感界面提供一个生物修饰功能基质膜,借助纳米金（GNPs）的导电性、生物相容性与高比表面积特性实现抗体的有效固定,并以亚甲基蓝（MB）为电子媒介加速电极表面电化学反应的电子传递,构建了一种高灵敏的非标记电化学免疫传感器,用于贝类毒素大田软海绵酸（OA）的检测.当分子结构中含有羧基和酚基的OA与其抗体特异性结合后,生成以阴离子形式存在的抗原-抗体复合物,阻碍了传感器表面电子的传递,导致峰电流下降.利用免疫反应前后峰电流的变化,可对OA进行特异性识别和准确定量.在优化实验条件下,OA浓度的对数在0.2～100 μg/L范围内与其峰电流的变化值（△I）呈线性相关,线性方程为△I=1.721 7＋1.083 6lgρ,相关系数为0.992 0,检出限为0.1μg/L.该免疫传感器重现性好、特异性强,用于实际贝类样品的测定,回收率为85.3％～ 112％.

海产品贝毒素大田软海绵酸ELISA及HPLC-MS/MS检测方法的研究

为了检测海产品贝毒大田软海绵酸,保障其食用安全,利用活泼酯法将小分子OA与载体蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠,细胞融合技术建立分泌抗OA的杂交瘤细胞株,并对其各种特性进行分析;小鼠腹水法大量生产抗体,纯化后建立ELISA方法,同时建立OA的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)检测法,并对部分市售海产品进行了实际检测,ELISA方法标准曲线为y=-34.212x+83.49,相关系数为0.9784,线性范围0.4～25μg/L,灵敏度0.18μg/L;HPLC-MS/MS检测方法标准曲线y=193.07x-780.6(Q1/Q3:m/z827.4～m/z723.5)和y=83.021x-335.6(Q1/Q3:m/z827.4～m/z809.5),R2均为0.9991,线性范围10～800μg/L,灵敏度小于2μg/L,平均RSD为4.34%。在检测的实际样品中两种样品ELISA呈阳性反应,其中一种经过了HPLC-MS/MS的验证。所建立的ELISA及HPLC-MS检测方法均可用于海产品腹泻性贝毒OA限量标准检测,为进出口海产品OA标准方法的建立提供实验基础。

贝类毒素大田软海绵酸OA对小鼠肝脏还原型谷胱甘肽GSH、过氧化氢酶CAT、超氧化物岐化酶SOD的影响

为了探究腹腔注射贝类毒素OA对小鼠肝脏还原性谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的影响,采用对一月龄的小鼠腹腔注射不同浓度的OA,24 h后取其小鼠肝脏测定还原性谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)各项指标。结果表明,测定注射OA毒素各剂量组的超氧化物歧化酶(GSH)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)3项指标均显著低于对照组。其中,GSH高剂量组和中剂量组差异性不显著。CAT高剂量组(96μg/kg)、中剂量组(48μg/kg)、低剂量组(24μg/kg)各组变化显著,呈现一定的剂量-效应关系,SOD高中低各组差异性不显著。因此,在小鼠染毒OA 24 h后,还原性谷胱甘肽(GSH),超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)这3项指标均受到了显著性抑制作用,说明这3项指标对毒素OA较为敏感,其中CAT呈现了显著的剂量-效应关系。

大田软海绵酸对FL细胞DNA的损伤及凋亡相关蛋白表达的影响

本文旨在探讨大田软海绵酸对人羊膜细胞DNA的损伤及凋亡相关蛋白表达的影响。实验用0、20、40、608、0、100 nmol/L OA诱导FL细胞4h后,检测DNA损伤程度的彗星实验表明,OA对FL细胞DNA的损伤随染毒浓度的升高而增加。蛋白免疫印迹法显示凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和p53的表达与染毒浓度呈负相关;用100 nmol/L OA分别诱导2h、4h、8h后发现,三种蛋白的表达与染毒时间也呈负相关。由此可知在OA诱导的FL细胞凋亡中,损伤DNA,降低Bcl-2蛋白的表达可能参与了凋亡的部分作用,而Bax和p53蛋白则可能与OA诱导的细胞增殖有关。

大田软海绵酸致病性及检测方法研究进展

大田软海绵酸(okadaic acid,OA)属于海洋腹泻性贝毒,是一类常见的赤潮藻毒素,富集于多种海洋软体动物的消化腺内,食用被污染的海产品后会发生腹泻性中毒,中毒症状极易与细菌性胃肠炎混淆,且OA具有长期的致癌效应。作者就大田软海绵酸的结构性质、致病性及检测方法进行综述,以使公众进一步了解OA检测的公共卫生意义。

大田软海绵酸对HL-7702肝细胞毒性效应的研究

[目的]探讨大田软海绵酸(okadaic acid,OA)对HL-7702肝细胞的毒性效应。[方法]通过细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、细胞形态学观察及流式细胞术等方法,从细胞增殖、细胞凋亡等方面探讨OA对HL-7702肝细胞的毒性效应。[结果]与溶剂对照组相比,OA对HL-7702肝细胞增殖有明显的抑制作用,细胞增殖抑制率随着OA浓度的增加而增加,同时随着染毒时间的延长,细胞增殖抑制率也明显增加;与对照组相比,作用HL-7702肝细胞24h后,5nmol/LOA可明显诱导细胞发生凋亡。[结论]OA可以通过抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的方式对HL-7702肝细胞产生毒性效应,且呈现剂量-效应关系。

海洋毒素大田软海绵酸完全抗原的制备与分析

为了建立大田软海绵酸(Okadaic acid,OA)的免疫学检测方法,利用活泼酯法将OA分子中的羧基与载体蛋白上的氨基偶联,人工制备OA的免疫抗原(OA-IgG)和检测抗原(OA-BSA),经电泳、动物实验及ELISA法进行了鉴定,完全抗原的偶联成功,为利用杂交瘤技术制备OA的单克隆抗体和海产品OA免疫学检测方法奠定了良好的基础。

大田软海绵酸液相色谱串联质谱检测方法的研究

目的：利用高效液相色谱一串联质谱法建立海产品中大田软海绵酸（Okadaic acid，OA）的检测方法。方法：贝样品提取液经AccuBond^Ⅱ SPE silica固相萃取小柱预分离和富集，用三级四极杆串联质谱（MS／MS）作为HPLC的检测器，使用正离子电喷雾（ESI）电离方式，多反应监测（MRM）扫描模式，选择母一子离子对m／z 827→m／z723，m／z827→m／z809作为定量检测的离子对，HPLC的流动相为乙腈：1％甲酸-水（体积比70：30），色谱柱为Agilent Extend—C18（2．1×150mm，φ5．0μm），对OA标准品及加标样品和实际样品进行HPLC—MS／MS检测。结果：方法线性回归方程为Y=193．07X-780．6（Q1／Q3：m／z827．4→723．5）；Y=83．021X-335．6（Q1／Q3：m／z827．4→809．5），相关系数一均为0．9991；线性范围为10～800μg／L。样品平均回收率为83．99％，平均RSD为4．34％。结论：建立的HPLC—MS／MS方法灵敏、快速、准确．可用于海产品中贝类样品OA限量标准检测。

大田软海绵酸人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

采用活化酯法将大田软海绵酸(OA)与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联制备免疫抗原(OA-KLH),用还原聚丙烯酰胺凝胶电泳法和红外光谱法对人工抗原的偶联效果进行分析,通过免疫兔子制备抗体,所得抗血清经Protein A凝胶层析柱纯化处理后,用紫外全波长扫描和间接竞争ELISA法验证纯化效果。结果表明,免疫抗原偶联成功并获得了高亲和力的多克隆抗血清,抗血清纯化后浓度为2.16 mg/mL,间接竞争ELISA测定其滴度为12 800、IC15为3.41 ng/mL,为建立快速、经济的检测方法打下了基础。

γ辐照对水和扇贝中大田软海绵酸降解效果的研究

为了探讨辐照对大田软海绵酸(OA)的降解效果,采用60Co-γ射线辐照降解水溶液和扇贝组织中的OA,基于ELISA法分析辐照剂量、OA初始浓度以及OA所处体系对其降解率的影响。结果表明,OA初始浓度越低、辐照剂量越大,辐照降解率越高。不同体系中辐照降解率的顺序为:水溶液体系的OA>肌肉组织体系的OA>肠道组织体系的OA>胰腺组织体系的OA。研究证实辐照技术可用于去除饮用水中的OA毒素,但去除扇贝等水产品中的OA毒素尚有困难。本研究为OA的去除提供了参考。

基于固定化酶的蛋白质磷酸酶抑制率法测定大田软海绵酸

目的建立和优化用于检测大田软海绵酸(OA)的固定化蛋白质磷酸酶2A(PP2A)抑制率法。方法以分离提取的PP2A为材料,根据OA抑制PP2A酶活性的原理,建立用于检测OA的固定化PP2A酶抑制率法,并对最佳酶用量和反应体系参数等进行优化。结果最佳固定化PP2A酶蛋白量2μg、固定化配比为琼脂糖与PP2A酶蛋白量为1:1、p H值为8.4;采取4参数Logistic曲线法进行标准曲线拟合,曲线R2值达0.994,检测限为3.45μg/L,实际样品测定时具有良好的准确性和重复性。结论建立的固定化PP2A酶抑制率法有望作为低成本、操作简单的OA快速筛检方法推广应用。

大田软海绵酸荧光偏振免疫分析方法研究

设计使用荧光试剂PDAM与大田软海绵酸单（OA）反应合成了荧光标记物,并在OA单克隆抗体的基础上建立了OA荧光偏振免疫（FPIA）检测方法。该FPIA方法检测限为4.6 ng/mL,检测范围为7.0-88.7 ng/mLI,C50为24.9 ng/mL。本方法操作简单、稳定,有望应用于高通量筛查牡蛎样品中OA含量。

抗大田软海绵酸单克隆抗体的制备及免疫学特性分析

目的制备了赤潮毒素大田软海绵酸(okadaic acid,OA)单克隆抗体,并分析其免疫学特性。方法用人工抗原大田软海绵酸-小牛血清蛋白偶联物(OA-BSA)免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术经初筛、复筛和亚克隆,筛选到1株可稳定分泌抗OA单克隆抗体的杂交瘤细胞株3H4。对抗体效价、亚型、特异性、敏感性进行免疫学鉴定与分析。结果抗体亚型为IgG2b;腹水效价为1∶1.28×106;50%抑制质量浓度为2.852 ng/ml;最低检测限为0.45 ng/ml;电泳结果显示抗体,由1条重链和1条轻链组成;与OA同系物PTX1、GYM、SPT1、YTX交叉反应率为0。结论制备的OA单抗效价和特异性均较好,可用于OA的免疫学检测。

赤潮毒素大田软海绵酸表面等离子共振免疫检测方法研究

结合表面等离子体共振技术与免疫检测技术,研究和建立了一种响应速度快、免标记、低成本新型海洋赤潮毒素大田软海绵酸检测方法。基于SpreetaTM传感器构建了小型表面等离子共振免疫检测系统,采用共价偶联方法在传感器金膜表面修饰大田软海绵酸-牛血清蛋白抗原作为生物敏感膜;测得该方法相对标准偏差为1.51%(n=12),定量范围为40 ng/mL～640 ng/mL,检测限为19.4 ng/mL,半抑制浓度IC50为177 ng/mL。结果表明该方法具有较好的重复性;所设计的检测芯片可重复使用,节省了分析测试的成本。该方法对实现赤潮毒素的现场分析有较大的应用前景。

大田软海绵酸对黑鲷胚胎发育及仔鱼的急性毒性

为了研究大田软海绵酸(okadaic acid,OA)对生物胚胎组织发育过程的毒性作用机制,采用静水和半静水实验法,用OA毒素与过滤海水按等对数间距分设5个浓度组,同时以过滤海水为对照组,对人工养殖的黑鲷鱼卵和仔鱼进行了毒性实验。实验结果表明:一定浓度的OA使鱼卵的死亡率和孵出仔鱼的畸形率升高,但对孵化率的影响较弱。OA对黑鲷仔鱼的24、48、72和96h的LC50分别为51.63、45.58、37.97和25.72nmol·L-1,仔鱼体内毒性蓄积程度也随时间逐渐减弱。OA毒素对仔鱼的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和酸性磷酸酶(ACP)的活性均有诱导作用,与对ACP的影响相比,OA毒素对GSH-PX活性的诱导作用更为突出。此外,OA毒素还会对黑鲷仔鱼的肝脏细胞的核酸代谢及DNA合成有一定的影响,使得RNA和DNA的含量比值发生显著变化。

大田软海绵酸诱导细胞凋亡的机制

大田软海绵酸是一种公认的促癌剂,也是腹泻性贝类毒素的主要成分之一,主要由共生于大田软海绵和隐瓜海绵中的利马原甲藻所产生,它在细胞的生长、分化、代谢和死亡中都起着重要的调节作用。现在它已作为一种非常有效的生物工具药被广泛用于基础生命科学的研究,其中有关它对不同细胞株的复杂凋亡诱导机制更是得到了普遍的关注和重视。本文主要概述Fas-FasL,Caspase,Bcl-2和p53等在大田软海绵酸(okadaic acid,OA)诱导的细胞凋亡机制中的作用。