不同方法检测食品中大肠埃希氏菌O157:H7/HM能力验证结果比较与分析

为提高实验室对食品中大肠埃希氏菌O157∶H7的检验检测能力,笔者单位参加了由中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的食品中大肠埃希氏菌O157∶H7检测能力验证计划。此次实验采用国家标准《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157∶H7/NM检验》(GB 4789.36—2016)中的第一法和实时荧光PCR方法,分别对能力验证样品进行检测。结果显示,样品23-G520中未检出大肠埃希氏菌O157∶H7;样品23-F568中检出大肠埃希氏菌O157∶H7,结果反馈为满意。在能力验证实验中,不同检测方法同时使用、综合判断,能有效提高检测能力和结果的准确性。

辽宁地区猪源大肠埃希菌O157:H7的流行病学调查和耐药性分析

猪源大肠埃希菌O157:H7是一种新型的人畜共患致病性大肠埃希菌[1],可通过污染的牛肉、奶制品、蔬菜、水果等途径感染人类或畜禽。不仅严重危害生猪养殖业的发展,而且对人类的健康也构成巨大威胁,人感染后主要表现为腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合征、血栓性血小板减少性紫癜等症状。众多动物食品污染源中,猪是其最重要宿主之一。本文从辽宁省9个地区的无害化处理厂、生猪养殖场和生猪屠宰场采集猪肛门拭子900份,进行大肠埃希菌O157:H7分离鉴定以及耐药性分析,为了解辽宁地区猪大肠埃希菌O157:H7的感染情况提供基础数据。

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测食源性大肠埃希氏菌O157:H

目的 建立一种快速、灵敏、特异、高效的食源性大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法 针对大肠埃希氏菌O157:H7型的O抗原特异基因rfbE保守区域设计特异性引物和探针,合成基因片段绘制标准曲线,在菌液基因组DNA和质粒双层面调试优化以完成方法的初步建立。其后,对该方法的特异性、敏感性、重复性等进行全面的质量评估验证。结果 该方法特异性100%;基因组DNA检测敏感性为7.11×10^(2)fg/μL;纯培养物水平检测敏感性为1.0×10^(2)CFU/mL;重复性变异系数在0.10%~1.00%之间;标准曲线相关系数r^(2)为0.9994。结论 成功建立了一种性能良好的大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光探针PCR快速检测方法,该方法具有灵敏度高、特异性强、扩增时间短,仅为35 min的特点,可用于疑似大肠埃希氏菌O157:H7型污染样品的快速诊断检测。

致病菌快速检测管联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法鉴定即食食品中的大肠埃希氏菌O157:H

目的建立基于致病菌快速检测管技术联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)快速、高效、准确鉴定即时食品中大肠埃希氏菌(Escherichia coli,E.coli)O157:H7的方法。方法选取改良胰蛋白胨大豆肉汤(modified tryptone soya broth,mTSB)为初筛培养基,制作出针对即时食品中E.coli O157:H7的致病菌快速检测管,初筛阳性结果采用MALDI-TOF MS技术鉴定。结果5株常见E.coli O157:H7菌株均能特异检出,而其他非E.coli O157:H7均未检出,灵敏度可达51 CFU/mL;通过对人工污染样品和自然样品检测,鉴定结果和GB 4789.36—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》方法完全一致,且检测效率提高了30%。结论两种技术联合应用建立的鉴定即时食品中E.coli O157:H7的新方法,操作简便、成本低廉,适合推广,为快速、准确鉴定即时食品中E.coli O157:H7打开了新思路。

国内外致泻大肠埃希氏菌O157:H7的检测标准比较及建议

致泻大肠埃希氏菌O157:H7(STEC O157:H7)是大肠埃希氏菌中致病性最严重的一种食源性致病菌,主要存在于牛肉、牛奶、水果及其制品中,对身体健康造成很大危害,甚至引发死亡。食品中STEC O157:H7检测尤为重要。本文对国内外STEC O157:H7的检测标准进行比较,提出我国标准在样品前处理、快速筛选方法的应用等方面需要加强,以便为该菌快速准确检测提供帮助,实现与国际标准化体系建设接轨,满足实验室检测需要。

肉制品中大肠埃希氏菌O157:H7实时荧光PCR检测方法的研究

以大肠埃希氏菌O157:H7菌体抗原基因rfbE基因为靶标,设计特异性引物和探针,建立大肠埃希氏菌O157:H7实时荧光PCR检测方法。对方法的特异性与灵敏性研究,并选取市售的10种肉类制品验证方法可行性。实验结果表明该方法具有良好的特异性和灵敏性,具有很好的研究价值和应用前景。

基于内参的大肠埃希氏菌O157∶H7实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

针对大肠埃希氏菌O157∶H7 rfb E和Flic靶基因保守序列,设计特异性引物和探针,优化反应体系,并加入内参(internal amplification control,IAC),建立能够实时监控反应过程的荧光定量聚合酶链式反应(polymease chain reaction,PCR)检测方法。结果表明,该方法对E.coli O157∶H7基因组DNA的最低检测限为1 pg/μL;对含有靶基因质粒的最低检测限为103 copies/μL;对细菌的最低检测限为5×103 CFM/m L;Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(R2=0.999)。人工污染实验结果表明,在初始菌量为7 CFM/25 g时,采用水洗加试剂盒法提取DNA,E.coli O157∶H7在增菌6 h后即可检出;而采用水煮法提取DNA,则在增菌10 h后方可检出。建立的E.coli O157∶H7实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中O157∶H7,又能实时监测PCR反应过程,有效防止"假阴性"的发生。

大肠埃希氏菌O157:H7的HDA检测方法的建立

采用自行建立和优化的依赖解旋酶DNA恒温扩增(HDA)检测体系,建立HDA检测方法对大肠埃希氏菌O157:H7进行检测。采用大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测大肠埃希氏菌O157:H7的HDA检测法,进行了特异性和灵敏度试验,并与普通PCR方法进行了比较。结果表明:所建立起的检测法,灵敏度为4.3×103 cfu·mL-1,灵敏度与普通PCR方法相当。大肠埃希氏菌O157:H7的依赖解旋酶DNA恒温扩增检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,用普通水浴槽即可进行反应。具有广阔的推广前景。

河南省6类食品中肠出血性大肠埃希氏菌O_(157)∶H_7污染状况调查

调查肠出血性大肠埃希氏菌O1 57∶H7在河南省 6类食品中的分布特征和污染状况 ,了解季节因素对于肠出血性大肠埃希氏菌O1 57∶H7分布的影响 ,以预防和控制食品污染保证食品安全。依据河南省自然地理概况 ,分 5个采样区域 ,按夏季和冬季在销售环节随机抽取样品 ,选择性增菌培养后 ,用O1 57胶体金试剂筛查 ,免疫磁珠富集后分离病原菌 ,应用bioM啨ｒｉｅｕｘＶＩＴＥＫ32AMSsystem ,GNI+ 和血清学的方法进行鉴定。结果显示 14 6 3份食品中共检出肠出血性大肠埃希氏菌O1 57∶H72 8株 ,检出率为 1 9% ,其中鲜肉和生食蔬菜检出率最高 ,为 3 3%和 3 2 % ,酸奶中未检出。夏季检出率 (2 5 % )明显高于冬季检出率 (1 1% )。结果提示 ,肠出血性大肠埃希氏菌O1 57∶H7在食品中的污染程度较为严重 ,其检出率的高低与O1 57∶H7感染性腹泻的流行强度呈正相关。应引起有关部门的足够重视 ,加强畜禽屠宰、蔬菜生产和销售环节的监督和监测 。

动物性食品中大肠埃希氏菌O157∶H7特异性二重PCR检测方法的建立

根据大肠埃希氏菌O157∶H7 wzx和fliC基因的保守序列设计了2对引物,建立并优化了特异性检测大肠埃希氏菌O157∶H7的二重PCR体系,扩增产物为395bp(wzx)和1057bp(fliC).人工培养基中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限为2.3×102CFU/mL,人工污染的牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限分别为5.8×102CFU/mL、4.3×102CFU/g和3.1×103CFU/g.样品经3h预增菌后检测下限可达3.1×100～5.8×100CFU/mL(或CFU/g).试验结果提示,针对wzx及fliC基因的二重PCR方法可以快速特异地检测出牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的污染.

呼和浩特市食品中大肠埃希氏菌O157:H7污染状况调查

目的本次研究旨在通过对呼市居民主要的消费食品进行大肠埃希氏菌O157:H7的污染调查,从而掌握该菌对食品的污染情况。方法随机抽取超市、农贸市场、酒店、食品店出售的食品共计15种307份,采用国标法进行检测。结果 349份食品中,检测出2株大肠埃希氏菌O157:H7,检出率为0.57%。其中生畜肉检出1株,检出率1.32%;米粉、盒饭类食品检出1株,检出率3.57%;其余食品均未检出。结论生畜肉,米粉、盒饭类食品中均检出大肠埃希氏菌O157:H7。提示存在发生食源性大肠埃希氏菌O157:H7病的潜在危险。

大肠埃希氏菌O157∶H7/NM标准物质制备

本文用冷冻干燥法制备含鸡肉基质的大肠埃希氏菌O157∶H7/NM标准物质,以细菌存活率为指标,选择存活率最高的保护剂配方。以经钴-60辐照灭菌的鸡肉粉(无抗生素)作为基质,按适当的比例与保护剂配方液混合,添加菌液,于-70℃速冻20 h后冷冻干燥,对样品进行均匀性检测、稳定性追踪以及建立不确定度评估。结果显示,保护剂最优配方为10%海藻糖+25%脱脂牛奶+4%聚乙烯吡咯烷酮+0.8%甘氨酸;基质液比例为基质∶水=1∶7。按基质液:保护剂配方液=1∶3制备样品,均匀性试验:F统计量=1.197<2.201,均匀性良好。当测量检验结果用2次测量值平均值表示结果时,其值分布区间为±80 CFU/mL,且在-20℃的温度下保存18个月未观测到不稳定性。

大肠埃希氏菌O157∶H7三种标准中的检测方法比较

在进行大肠埃希氏菌O157∶H7扩项过程中,对国内常用3个标准中的常规培养法进行比较分析。结果表明,不同温度培养的增菌肉汤均浑浊生长。大肠埃希氏菌O157∶H7显色培养基选择性较好,建议在日常检测工作中使用大肠埃希氏菌O157∶H7显色培养基,以提高区分度及检出率。同时,应用VITEK 2可以快速简便地鉴别目标菌。

级联信号转导系统结合免疫层析法检测大肠埃希氏菌O157:H7

首先通过免疫磁技术实现目标菌的有效富集,然后经同时标记了大量抗体与β-内酰胺酶的胶体金纳米探针介导,利用β-内酰胺酶高效水解青霉素实现检测信号转导及放大,再通过免疫层析法对青霉素含量变化的灵敏甄别,最终实现大肠埃希氏菌O157:H7的超灵敏检测。建立的检测方法对大肠埃希氏菌O157:H7的检测灵敏度为2×10^(2) CFU/mL,相比传统的免疫层析法检测灵敏度提高了570倍。实现超灵敏检测食源性致病菌的同时规避了双抗夹心免疫层析法中Hook效应的影响,为免疫层析高灵敏准确检测大分子目标物提供了新的思路。

我国分离的大肠埃希菌O157∶H7的毒力基因检测分析

目的了解我国部分省区分离的大肠埃希菌O157∶H7菌株特异基因和毒力基因携带特点及在不同动物宿主来源的菌株分布情况。方法采用PCR对分离菌株的O157、H7抗原特异基因rfbEO157、fliCH7以及stx1、stx2、eaeA和hlyA四种毒力基因进行检测。结果在1992-2006年收集的O157及H7抗原阳性的345株大肠埃希菌株中,rfbEO157、fliCH7特异基因均为阳性,eaeA和hlyA的阳性率分别为99.4%和99.1%,stx2的阳性率为91.9%,stx1阳性率仅为13.3%,stx1+stx2的阳性率为13.0%,来源于病人和动物菌株的stx2阳性率均高于stx1。检测菌株中毒力基因型以eaeA+hlyA+stx2为主。携带毒力基因的O157∶H7菌株在羊、牛等动物宿主中广泛存在。结论 stx2是病人及羊、牛等动物来源的产志贺毒素大肠埃希菌O157∶H7携带的主要毒素基因型。