大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质

以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶（mdh）编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶（mdh）,纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K＋对酶有明显的激活作用,Cu2＋对酶有抑制作用,Hg2＋和Zn2＋对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/（L.min）。

过量表达大豆异丙基苹果酸脱氢酶基因GmIPMDH促进植株开花和生长

异丙基苹果酸合成酶(isopropylmalate synthase,IPMS)和异丙基苹果酸脱氢酶(isopropylmalate dehydrogenase,IPMDH)是亮氨酸生物合成中的重要限速酶,但二者在植物生长发育中的功能鲜有报道。本研究对拟南芥AtIPMDH2基因在大豆中的同源基因GmIPMDH进行了克隆和分析。该基因编码的氨基酸序列中含有Iso_dh亚家族保守结构域,且启动子中含有大量的光反应元件及激素应答元件。实时荧光定量PCR显示大豆叶片中GmIPMDH的表达量随着植株的生长发育逐渐升高。对GmIPMDH进行了烟草的异位表达和大豆的过量表达,表型分析发现GmIPMDH的过量表达显著提前了烟草和大豆的开花时间,且株高和节数均显著增加。转录组分析显示,GmIPMDH过量表达大豆叶片中的若干开花相关基因及赤霉素合成相关基因的表达量发生变化,推测GmIPMDH可能通过赤霉素合成通路参与赤霉素介导的植物开花诱导和株型调控。本研究首次阐明了GmIPMDH在开花期调控中的作用,为今后进一步研究GmIPMDH调控大豆开花和生长发育的分子机制提供了一定的基础。

厌氧表达乳酸脱氢酶以提高大肠杆菌产D-乳酸光学纯度

【目的】为解决在D-乳酸工业发酵生产中使用农业粗加工或废弃物等廉价原料(含有少量L-乳酸)而导致终产物D-乳酸光纯降低的问题。【方法】构建了带有不同启动子的L-乳酸脱氢酶基因lldD的表达质粒:pUC19-PLD(PpflBp6)、pUC19-NLD(PnirB)及pUC19-PNLD(PpflBp6-PnirB),并将它们分别转化入大肠杆菌D-乳酸工程菌HBUT-D中,得到菌株HBUT-D3、HBUT-D5和HBUT-D7。通过LldD的酶活检测以及对NBS培养基(添加1 g/L L-乳酸)发酵结果的TOPSIS多元评估,优选出可快速去除L-乳酸且不影响D-乳酸发酵的菌株,并使用农业廉价原料进行发酵。【结果】HBUT-D7的LldD比酶活为64 U/g,L-乳酸的消耗速率为34 mg/(L·h),D-乳酸的生产强度为4.09 g/(L·h),综合评估为最优菌株。以玉米浆为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率分别为10.41 mg/(L·h)及34.75 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为4.24 g/(L·h)及3.87 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.07%及99.92%。以糖蜜为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率为6.87 mg/(L·h)和17.18 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为1.93 g/(L·h)及1.88 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.22%及99.99%。【结论】厌氧诱导启动子的表达质粒可提高菌株HBUT-D7的L-乳酸脱氢酶酶活,使其在使用廉价原料发酵时能有效消除L-乳酸,提高发酵终产物D-乳酸的光学纯度。

大肠杆菌苹果酸有氧发酵溢出机制的解析及其应用

L苹果酸是一种重要的四碳二羧酸,以可再生生物质为原料,通过微生物发酵高效制备L苹果酸具有重要意义。本研究首先考察了氮限制条件、温度和pH对有氧条件下L苹果酸合成的影响,结果表明氮限制条件是苹果酸大量积累的重要条件,最适的温度为35℃,最优pH为6.8。进一步分析辅因子水平及呼吸链相关基因的转录水平变化后发现,苹果酸的溢出可能是由于电子呼吸链效率下降,导致NADH的氧化不足,NAD+供给不足最终无法催化苹果酸进一步转化为草酰乙酸。通过敲除大肠杆菌中呼吸链NADH脱氢酶Ⅱ编码基因ndh,可降低电子呼吸链效率。最终重组菌E.coli AFP111(Δndh)在氮源充足条件下,丁二酸也能被大量代谢并以苹果酸为主要产物,收率达到0.65 g/g。本研究成果将为通过呼吸链改造提高中间代谢产物的积累提供理论支持和借鉴。

苹果酸脱氢酶协同纤维素酶水解纤维素:理论分析与实验

纤维素分子的刚性结构被认为是限制纤维素酶与底物接触的主要障碍,通过添加纤维素降解辅助蛋白破坏纤维素结构可以有效解决酶对底物的可及性问题。基于文献报道糖苷水解酶家族4(GH_(4))成员中α-葡萄糖苷酶对纤维素酶有协同作用,以及α-葡萄糖苷酶与苹果酸脱氢酶(MDH)的蛋白同源性和蛋白结构分析,本文提出MDH也具有协同作用的功能猜想,并开展了MDH协同纤维素酶水解滤纸纤维素的理论以及实验研究。通过分子对接模拟MDH与结晶纤维素的相互作用,理论分析发现MDH可能通过氢键和疏水的作用来降低纤维素的凝聚。实验考察了MDH添加量、纤维素酶量、水解时间等条件对MDH协同纤维素酶水解纤维素的影响。结果表明,在(50±0.50)mg滤纸体系中添加0.06FPU纤维素酶、150μg苹果酸脱氢酶,50℃水浴震荡24h,测定的还原糖产量是纤维素酶单独作用时的(3.47±0.28)倍,MDH对纤维素酶的增效活性为247%±28%。利用扫描电子显微镜(SEM)、X射线衍射(XRD)以及傅里叶变换红外光谱(FTIR)等手段对MDH作用前后的滤纸进行分析,所得结果表明MDH对纤维素的结晶区域具有破坏作用,协同促进了纤维素酶对纤维素的水解。作为一种有效的纤维素降解辅助蛋白,MDH为提高纤维素的酶法水解效率提供了更多选择。

大肠杆菌L-苏氨酸脱氢酶的高效表达及其酶学性质分析

为提高L-苏氨酸脱氢酶(L-threonine dehydrogenase,L-TDH)催化L-苏氨酸脱氢合成L-2-氨基乙酸乙酯效率,通过基因挖掘的手段挖掘出来自大肠杆菌(Escherichia coli)的L-TDH,再借助pACYCDuet-1表达系统将其在E. coli BL21(DE3)中进行可溶性表达及鉴定。结果表明,L-TDH在E. coli BL21(DE3)中实现了高水平的可溶性表达,其裂解液中的酶活力为19.13 IU/mL,约为E. coli BL21(DE3)本底表达水平的79倍。纯化后的比活力为12.77 IU/mg,它的最适反应温度为45℃,最适反应pH值为9.0,在35℃和40℃保温120 min,残留酶活力仍能达到90%以上。此外,Ec TDH动力学参数也优于其他已报道的L-TDH,在转化L-苏氨酸合成2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP)的过程中具有更大优势,也为实现转化L-苏氨酸合成2,5-DMP的工业化生产奠定了理论基础。

渗透剂对苹果酸脱氢酶包含体的复性作用

将甜菜碱和海藻糖两种渗透剂作为添加剂,考察了其促进苹果酸脱氢酶包含体的复性作用。结果显示,甜菜碱和海藻糖均可有效促进大肠杆菌苹果酸脱氢酶包含体的复性。在本文实验条件下,随添加甜菜碱浓度的升高,复性后苹果酸脱氢酶的比活增大;而海藻糖则出现最佳添加浓度使复性后苹果酸脱氢酶的比活最大;同时在盐酸胍浓度较高、不添加渗透剂时复性效果较差的复性体系中,若添加合适浓度的甜菜碱或海藻糖即可有效促进苹果酸脱氢酶的复性,显示出渗透剂作为添加剂在实际包含体蛋白质复性过程中的应用前景。另外,通过外源荧光分析发现,添加甜菜碱和海藻糖均可降低苹果酸脱氢酶表面疏水性区域的暴露程度;圆二色光谱分析则表明,甜菜碱和海藻糖可以促进苹果酸脱氢酶α-螺旋结构的生成。

苹果酸脱氢酶的结构及功能

苹果酸脱氢酶(MDH)可以催化苹果酸与草酰乙酸间的可逆转换,主要参与TCA循环、光合作用、C4循环等代谢途径。苹果酸脱氢酶可分为NAD-依赖性的MDH(NAD-MDH)和NADP-依赖性的MDH(NADP-MDH)。在所有真核生物和大部分细菌中,MDH通常形成同源二聚体,在少数细菌中为四聚体。不同来源的MDH催化机制和它们的动力学性质十分类似,显示了它们具有高度的结构相似性。MDH的功能多样,包括线粒体中的能量提供和植物的活性氧代谢等。回顾了苹果酸脱氢酶在生理学、医学、农学领域的研究进展,并针对其生化特性、空间结构特点、催化机理等生物学功能的分子生物学进展进行了综述。

超量表达苹果酸脱氢酶基因提高苜蓿对铝毒的耐受性

在酸性土壤中,铝毒是许多作物正常生产的主要限制因子.虽可通过施用生石灰来改良土壤酸碱度,但只能改善土壤表层,在实际应用中受到很大限制.紫花苜蓿作为一种非常重要的牧草、饲料,在酸性土壤条件下苜蓿生长缓慢甚至死亡.我国南方水热资源丰富,但土壤多偏酸性,限制了苜蓿南移.有机酸能螯合铝离子,减轻铝对植物根系的危害.苹果酸是游离铝离子的有效螯合剂,而苹果酸脱氢酶(Malate Dehydro-genase,MDH)催化草酰乙酸形成苹果酸.本研究在苜蓿中超量表达苹果酸脱氢酶基因,通过抗生素筛选、组织化学染色和PCR扩增等技术鉴定出转化植株,并对转化株系进行了耐铝胁迫试验,比较分析了转基因株系与非转基因株系的的相对伸长量,转基因株系根相对伸长量比对照高出3.6%～22.5%.说明超量表达neMDH基因可提高了转基因苜蓿对铝毒的耐受性.

苹果细胞质型苹果酸脱氢酶基因克隆、表达及酶活性分析

根据亚细胞定位,苹果酸脱氢酶可分为5种类型,其中依赖于NAD的细胞质型苹果酸脱氢酶(cyMDH)在植物上的研究较少。从苹果果实中分离了cyMDH的全长cDNA序列,命名为Mal-cyMDH(GenBank登录号为DQ221207),该序列含有一个996bp的开放阅读框(ORF)。序列同源性分析表明Mal-cyMDH与其他物种cyMDH有较高的同源性,进化树分析表明几乎所有的cyMDH可以聚类在一个分支上,并且cyMDH可能是MDH的最原始种。原核表达得到一个37kD左右的融合蛋白,酶活测定表明该酶主要催化合成苹果酸。苹果果实中cyMDH酶活分析表明在高酸和低酸基因型中该酶的还原活性存在明显差异。

牦牛肌红蛋白的基因克隆测序、分离纯化、含量及其与乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶活力的关系

为探索牦牛适应高原缺氧环境的分子机制,测定了麦洼牦牛心肌和骨骼肌中肌红蛋白(Mb)含量及乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)活力,并对牦牛Mb进行了分离纯化和基因克隆测序。牦牛心肌和骨骼肌中Mb含量显著高于水牛和黄牛(P<0.01);牦牛、黄牛和水牛心肌MDH/LDH活力比均显著高于骨骼肌;牦牛心肌MDH/LDH活力比显著高于水牛和黄牛,但在不同牛种骨骼肌之间无显著差异。各组织Mb含量与MDH/LDH活力比呈显著正相关。试验用RT-PCR方法从牦牛心肌中克隆了Mb基因,与普通牛相比,核苷酸序列同源性为99.5%,氨基酸序列完全相同;用盐析、CM-Sephadex阳离子交换层析、Sephadex G-50凝胶层析等方法分离纯化了牦牛Mb,SDS-PAGE显示其分子量约为17 ku。

香蕉苹果酸脱氢酶基因克隆及其逆境胁迫表达

从香蕉果实抑制差减文库中获得一条香蕉苹果酸脱氢酶基因片段,采用RACE技术获得全长,命名为MaMDH;MaMDH基因全长1 249bp,编码332个氨基酸。生物信息学分析预测其编码蛋白分子量约35 448Da,等电点为6.53。与已知植物苹果酸脱氢酶基因相比,氨基酸同源性均达92%。保守结构域分析发现,MaMDH基因具有NAD结合位点、苹果酸结合位点和二聚体结合位点。系统进化树比对分析表明,MaMDH与玉米和小麦的亲缘关系较近。MaMDH基因在乙烯利处理香蕉苗中上调表达;在盐、Al 3+胁迫和香蕉尖孢镰刀菌4号生理小种处理幼苗中先上调表达,后下调表达;在冷害胁迫幼苗中先下调表达,后上调表达;而在干旱胁迫、伤害胁迫幼苗中表达没有明显变化。研究表明,香蕉中的苹果酸脱氢酶基因具有响应生物胁迫和非生物胁迫能力,可能在香蕉适应衰老、盐、铝、低温胁迫和枯萎病菌侵染等逆境中发挥重要作用。

齐口裂腹鱼及草鱼乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶同工酶的比较研究

测定了两种不同生长环境的齐口裂腹鱼和草鱼肌肉组织的乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶活力,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了这两种鱼类的心脏、肝胰脏、鳃、脑及肌肉5种组织的乳酸脱氢酶同工酶谱。结果显示:齐口裂腹鱼的苹果酸脱氢酶/乳酸脱氢酶活力显著高于草鱼(P<0.05),齐口裂腹鱼和草鱼乳酸脱氢酶同工酶谱具有明显的物种特异性和组织特异性,草鱼各组织中乳酸脱氢酶的迁移率明显快于在齐口裂腹鱼各组织中,两种鱼的心脏和脑中乳酸脱氢酶的含量比较丰富;两种鱼的心、脑组织中乳酸脱氢酶1-乳酸脱氢酶3占优势,乳酸脱氢酶4和乳酸脱氢酶5在肌肉组织中占优势。

低温冷藏提高家蚕滞育卵NAD含量和胞质苹果酸脱氢酶活性

为了调查5℃低温处理是否改变家蚕Bombyxmori卵滞育NAD代谢,本研究利用HPLC和分光光度法测定了经25℃和5℃分别处理的滞育卵中NADH含量、NAD+含量、乳酸脱氢酶(LDH)活性和胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)活性。结果表明:5℃处理的NAD(NADH+NAD+)含量和cMDH活性分别增加了106%和53%,并且显著高于25℃处理(P<0.01);但是两种处理的NADH/NAD+比值和LDH活性没有显著差异(P>0.05)。据此推测,5℃低温处理加强了家蚕滞育卵NAD+合成和再生能力。

单细胞激光拉曼光谱检测重组大肠杆菌细胞表达甲酸脱氢酶

甲酸脱氢酶(FDH,EC1.2.1.2)在工业生产中有重要的应用价值,工业上应用的FDH可以通过构建高水平表达重组FDH蛋白的基因工程菌生产,用分子生物学的方法检测重组蛋白的高效表达和积累操作繁杂,耗时耗力且需要破碎细胞。为了寻找一种简单快速,不需破碎细胞,且能实时检测FDH重组蛋白在基因工程菌中表达情况的方法,本研究应用单细胞激光拉曼光谱分析技术(LTRS),研究IPTG诱导不同时间后甲酸脱氢酶重组蛋白(FDH)在大肠杆菌细胞中的表达水平。结果表明,FDH的特征峰1004,1355,1455和1667cm-1随着IPTG诱导时间的延长而增强,说明在诱导培养过程中FDH重组蛋白在重组大肠杆菌细胞中表达并积累,这4个峰强的增加值所反映的FDH表达量与SDS-PAGE电泳分析结果一致。实验结果证明,LTRS是快速有效检测单个大肠杆菌活细胞体内重组FDH实时表达的一种非入侵方法。

鱼精蛋白对黑曲霉细胞内的琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的影响

鱼精蛋白是一种多聚阳离子天然肽类,它是一种碱性蛋白质。为探讨其抑菌作用,我们研究了鱼精蛋白对黑曲霉细胞内的琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的影响。结果表明,鱼精蛋白具有抑制琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性(p<0.01),但效果低于纳他霉素。提示鱼精蛋白用作食品防腐剂具有很大的潜力。

玉米苹果酸脱氢酶基因的分离与结构分析

以一个玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）杂种一代超亲表达的ｃＤＮＡ片段为探针，从玉米幼苗期ｃＤＮＡ文库中筛选到一个全长１２８７ｂｐ的ｃＤＮＡ克隆。序列分析表明，该ｃＤＮＡ编码细胞质苹果酸脱氢酶，推导的氨基酸序列与龙须海棠（Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｕｍ Ｌ．）及拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．）同一编码基因的氨基酸序列同源性分别为９０％和８４％。这是禾谷类作物中首次克隆的编码细胞质苹果酸脱氢酶的完整基因。

云杉种源间苹果酸脱氢酶同工酶变异的研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ,研究了云杉不同种源的苹果酸脱氢酶 (MDH)同工酶的遗传变异。结果表明 :不同种源的MDH的酶带有较大的差异 ,不同的地理、生态气候因子如海拔、纬度、经度等均会影响云杉同工酶酶谱的某些复等位基因的分化 ,即弱带有差异而强带变化不大。不同种源的同工酶形成与不同生态环境相对应的特征谱带。

京海黄鸡苹果酸脱氢酶基因多态性遗传效应的研究

以京海黄鸡为试验素材,采用PCR-RFLP方法研究苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)基因单核苷酸多态性(SNPs)对京海黄鸡生长、屠宰及繁殖性状的遗传效应。结果表明,MDH基因的3种基因型对京海黄鸡母鸡的初生重,4、8、12、16周龄体重,和成年体重无显著影响(P>0.05)。母鸡的AA基因型个体和BB型个体的腹脂重差异显著(P<0.05);BB型个体的腿肌重显著低于AA型和AB型的个体(P<0.05)。公鸡的AB型和BB型个体的腹脂重显著高于AA型个体(P<0.05);AA型和AB型个体的胸肌重显著高于BB型个体(P<0.05)。母鸡BB型个体的300日龄产蛋数和66周龄产蛋数极显著低于AA型和AB型个体(P<0.01)。说明MDH基因可能是影响鸡屠宰性状和繁殖性状的主效基因或与之存在紧密遗传连锁的一个标记。

苹果酸脱氢酶与异柠檬酸脱氢酶在滞育七星瓢虫中的差异表达

为分析七星瓢虫滞育相关蛋白质的类别和功能,在滞育调控及滞育后生物学研究的基础上,应用双向电泳、质谱分析(ESI-QUAD-TOF)、生物信息学等蛋白质组学方法,对表达量存在2倍及以上差异且差异显著的蛋白点进行鉴定。应用Mascot软件进行数据库检索,根据数据的匹配程度鉴定蛋白质。所得蛋白质中,参与三羧酸循环的两种关键酶呈现差异性表达,其中苹果酸脱氢酶(gi|212508346)呈上调表达,异柠檬酸脱氢酶(gi|21392222)则呈下调表达。苹果酸脱氢酶的增加,推测与滞育状态下的生理需求相关:一方面与昆虫对NAD的合成和利用有关,另一方面或是七星瓢虫应对滞育环境条件的一种应激方式,与正常个体的代谢通路相比,滞育个体开启了另外的代谢通路以适应环境条件的改变。异柠檬酸脱氢酶作为三羧酸循环中起关键调节作用的限速酶,在滞育个体中下调表达,或反映了三羧酸循环整体速率的降低,表现在滞育七星瓢虫体内维持了低水平的能量代谢。本文的研究结果,为从蛋白质水平深入揭示七星瓢虫滞育调控及其机理提供一定的参考。