融合引物与巢式聚合酶链式反应（fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR）是一种分离并扩增已知序列旁未知序列的有效方法。以大花三色堇（Viola×wittrockiana Gams.）为材料,为提高FPNI-PCR产物特异性,增加条带清晰度...融合引物与巢式聚合酶链式反应（fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR）是一种分离并扩增已知序列旁未知序列的有效方法。以大花三色堇（Viola×wittrockiana Gams.）为材料,为提高FPNI-PCR产物特异性,增加条带清晰度,降低非特异性条带的干扰,对FPNI-PCR反应体系中第1轮的模板DNA浓度进行对比,优化了第3轮反应中引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、缓冲液用量,筛选了第3轮特异性引物的退火温度,进一步完善了FPNIPCR反应体系。各因素优化比对试验表明：FPNI-PCR第1轮反应体系应以稀释后的DNA为模板,20μL体系中,用量在4.5-10 ng。第3轮最优反应体系为：20μL反应体系中,特异性引物浓度0.2μmol/L,引物SP2浓度0.75μmol/L,Taq DNA酶用量1.0 U,d NTP用量2μL,10×buffer（20 mmol/L,Mg2＋plus）用量2μL,模板1μL（第2轮反应稀释100倍后取1μL为模板）,dd H2O补足。第3轮反应中,退火温度为64℃或66℃时条带最为清晰。展开更多
