中华大蟾蜍皮化学成分及其细胞毒活性

目的研究中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor皮的化学成分及其细胞毒活性。方法中华大蟾蜍皮95%乙醇提取物采用硅胶、Sephadex LH-20、ODS、制备HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用SRB法评价其对结肠癌细胞HCT-116、HT-29的毒活性。结果从中分离得到5个化合物,分别鉴定为(2β,5β,14β,15β,16β)-2,15-二羟基-14,15-环氧-16-乙酰基-蟾蜍甾-20,22-二烯(1)、1β-羟基蟾毒灵(2)、19-oxobufalin(3)、(3α,5β,14β)-3,11,14-trihydroxy-12-oxo-bufa-9(11),20,22-trienolide(4)、(3β,5β,16α)-3,5,16-trihydroxy-bufa-14,20,22-trienolide(5)。化合物1~4对HCT-116细胞的IC_(50)值为0.08~2.67μmol/L,对HT-29细胞的IC_(50)值为0.24~9.80μmol/L。结论化合物1为新化合物。化合物1~4对HCT-116、HT-29细胞具有毒活性。

中华大蟾蜍甾醇-4α-羧酸酯-3-脱氢酶基因的克隆、表达与生物信息学分析

目的为获得中华大蟾蜍甾醇-4α-羧酸酯-3-脱氢酶(NSDHL)以便于研究其功能,本文建立了该重组蛋白原核表达方法。方法以中华大蟾蜍耳后腺总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆中华大蟾蜍NSDHL基因(Bbg-NSDHL),对Bbg-NSDHL基因进行生物信息学分析,并以大肠埃希菌为宿主菌,采用pCOLD-TF表达载体,构建Bbg-NSDHL原核表达系统,优化诱导表达条件。结果Bbg-NSDHL cDNA全长1521 bp,开放阅读框长1038 bp,编码345个氨基酸,所表达蛋白分子量为38.6 kD,理论等电点为8.70,分子式为C_(1756)H_(2729)N_(455)O_(495)S_(14)。Bbg-NSDHL具有核苷二磷酸糖差向异构酶结构域和短链脱氢酶/还原酶超家族结构域,在270-292处存在1个明显的跨膜区。Bbg-NSDHL单体由5个α-螺旋和9个β-折叠组成。系统进化分析表明,Bbg-NSDHL与两栖动物的NSDHL聚为一类,与哺乳动物遗传距离较远。Rosetta菌株为Bbg-NSDHL重组蛋白表达适合宿主,最佳诱导条件为15℃条件下,细菌生长至OD_(600)值为1.0时,加入0.1 mmol/L的IPTG诱导24 h。去除Bbg-NSDHL跨膜区截短表达可显著提升Bbg-NSDHL重组蛋白表达量。结论本研究首次获得了中华大蟾蜍NSDHL cDNA全长序列,并建立了Bbg-NSDHL原核表达系统,为进一步研究该基因在中华大蟾蜍蟾毒配基类成分生物合成中的作用奠定了基础。

四种除草剂对中华大蟾蜍蝌蚪红细胞微核及核异常的影响

研究了除草剂精克草星、苯磺隆、使它隆和乙草胺单独及联合作用时对中华大蟾蜍蝌蚪红细胞微核及核异常的影响。结果表明 ,处理 2 4小时时 ,单独作用的除草剂均可不同程度地引起微核率及核异常细胞率等遗传指标的上升。而且 ,在一定的浓度下各指标分别有高峰期 ,其中微核率与对照组差异极显著 (P <0 0 1 )或显著 (P <0 0 5)。微核率与除草剂浓度之间无显著相关 ,不表现出剂量 效应关系。四种除草剂联合作用的微核率等指标反而低于单独作用的 ,呈拮抗作用。这四种除草剂对蝌蚪红细胞具有显著的遗传毒性 ,其中使它隆的毒性要大于其它三种。

中华大蟾蜍的研究进展

蟾酥为我国传统名贵中药,是蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥分泌物。现代药理学研究表明其具有强心、抗肿瘤、局麻、镇痛、抗炎等多种作用。自蟾酥投入临床应用以来,在抗肿瘤方面已取得了很好的疗效。蟾酥所含化学成分主要有蟾蜍内酯类、蟾毒色胺类以及甾醇类等。综述近年来国内外学者对中华大蟾蜍的化学成分、药理作用、临床应用的研究概况。

中华大蟾蜍皮化学成分的研究

从中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)皮水溶性部分应用制备型反相HPLC分离得到一个新蟾蜍毒素,根据光谱(UV,IR,~1HNMR,^(13)CNMR,EIMS,FDMS)、氨基酸分析及化学性质,确定其结构为Ⅰ所示,命名为蟾毒它灵3-丁二酰精氨酸酯,同时还分到三个已和蟾蜍毒素;蟾毒灵3-丁二酰精氨酸酯(Ⅱ),华蟾毒精3-丁二酰精氨酸酯(Ⅲ),脂蟾毒配基3-丁二酰精氨酸酯(Ⅳ)。

乙草胺对中华大蟾蜍(Bu fo bu fo gar garizans)早期胚胎发育的影响

用不同浓度的乙草胺分别对中华大蟾蜍 4个不同发育时期的早期胚胎作用 5小时 ,结果发现 ,不同浓度的乙草胺可以导致中华大蟾蜍早期胚胎不同程度的发育成原肠外突和畸胎。不同发育时期的中华大蟾蜍早期胚胎对乙草胺的敏感程度和耐受程度都有所不同 ,其中 ,原肠胚期的胚胎对乙草胺最为敏感。实验表明乙草胺对中华大蟾蜍早期胚胎发育具有明显的致畸致死效应。

中国林蛙蝌蚪和大蟾蜍蝌蚪的最适温度、逃避温度及致死温度

报道了中国林蛙蝌蚪 (Ranachensinensis)和大蟾蜍蝌蚪 (Bufogargarizans)在不同驯化温度下的最适温度、逃避温度和致死温度的研究结果。将中国林蛙蝌蚪和大蟾蜍蝌蚪分别在 5、1 5和 2 5℃ 3个不同温度下驯养 3周 ,利用温度梯度装置观察记录 2种蝌蚪的最适温度、逃避温度和最高致死温度。结果表明 ,经过在 5、1 5和 2 5℃ 3个温度下的驯化 ,中国林蛙蝌蚪的最适温度范围分别为 1 3 . 5～ 1 8℃、2 0. 5～2 5℃和 2 3～ 2 7. 5℃ ;大蟾蜍蝌蚪的最适温度范围分别为 1 2～ 1 6 .5℃、2 1～ 2 5. 5℃和 2 2～ 2 6. 5℃。中国林蛙蝌蚪和大蟾蜍蝌蚪的最高致死温均在 3 7～ 3 8℃之间 ,最低致死温均为 0℃。驯化温度对最适温度影响显著 (P <0 .0 1 ) ,对致死温度则没有显著影响。驯化温度对中国林蛙蝌蚪和大蟾蜍蝌蚪的逃避温度产生的影响比最适温度的大。

汞离子和铜离子对中华大蟾蜍蝌蚪联合毒性研究

研究了重金属离子汞和铜对中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)蝌蚪的毒性和联合毒性的影响。单种离子Hg2+对蝌蚪24h、48h的半致死浓度分别为0·712mg/L、0·612mg/L,Cu2+对蝌蚪24h、48h的半致死浓度分别为1·310mg/L、0·862mg/L,Hg2+和Cu2+共存对蝌蚪24h及48h半致死浓度分别为0·550-0·400mg/L、0·379-0·300mg/L。根据Marking的指数法求得24h、48h的相加指数AI分别为0·078、0·034,表现为协同作用。

除草剂草甘膦对中华大蟾蜍的慢性毒性

为揭示除草剂对农林生态系统中脊椎动物天敌潜在的、长期的慢性毒性，测定了草甘膦对中华大蟾蜍（Bufo gargarizans Cantor）蝌蚪生长发育和运动频率的影响以及对中华大蟾蜍成体空胃率的影响。结果表明，亚致死剂量的草甘膦溶液对中华大蟾蜍蝌蚪的生长发育和运动频率具有明显的抑制作用，蝌蚪体长、体宽、尾长、尾宽和体质量的增长率均与草甘膦浓度呈极显著负相关；蝌蚪的运动频率亦与草甘膦浓度显著负相关。同时，草甘膦的喷施对中华大蟾蜍成体的捕食造成负面影响，其空胃率与草甘膦浓度呈极显著正相关，即使在草甘膦的推荐使用浓度范围之内．中华大蟾蜍（成体）处理组亦出现30％～60％的空胃率。

草甘膦胁迫对中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)神经冲动产生和传导的影响

应用电生理方法研究了除草剂草甘膦对中华大蟾蜍（Bufo gargarizans Cantor）坐骨神经干冲动产生和传导的影响。用不同浓度的草甘膦溶液对中华大蟾蜍进行胁迫处理,草甘膦有效成分经由皮肤进入蟾蜍体内而作用于神经系统,利用生物信号采集处理系统测定草甘膦胁迫下中华大蟾蜍离体坐骨神经干的应激反应时间、动作电位幅度和冲动传导速度,结果表明：随着草甘膦溶液浓度的升高,中华大蟾蜍坐骨神经干接受刺激后产生冲动所需的时间逐渐延长,动作电位峰值降低,神经冲动传导速度亦逐渐减慢。草甘膦施用后,中华大蟾蜍7d内的平均应激反应时间与草甘膦浓度呈正相关,而动作电位幅度及传导速度均与草甘膦浓度呈负相关。草甘膦溶液浓度达到推荐农田使用浓度1.64~2.87ml/L时,各处理组蟾蜍的应激反应时间、动作电位幅度和冲动传导速度均与对照组差异极显著（P〈0.01）。同时,随着试验处理时间的延长,中华大蟾蜍神经干对刺激的反应变得更为迟钝,神经冲动的传导速度也进一步减慢。回归分析可知,中华大蟾蜍坐骨神经干的应激反应时间与草甘膦施用后天数呈正相关,而神经传导速度与药后天数呈负相关。由此可以说明,草甘膦胁迫条件下,中华大蟾蜍神经细胞对刺激反应的灵敏性降低，动作电位的产生及传导受到一定程度的抑制和阻碍。

中华大蟾蜍皮的化学成分

目的研究中华大蟾蜍皮的化学成分。方法利用反复硅胶柱、ODS反相柱、制备液相、重结晶等手段分离分离纯化化学成分,根据化合物的理化性质和光谱数据并参考文献鉴定其化学结构。结果从中华大蟾蜍皮中分离得到6个化合物:胆甾醇(cholesterol,1)、棕榈酸胆甾烯酯(palmitatic acid cholesteryl ester,2)、蟾毒它灵(bufotalin,3)、沙蟾毒精(arenobufagin,4)、嚏根草配基(hellebrigenin,5)、嚏根草配基-3-辛二酸半酯(hellebrigenin-3-hemisuberate,6)。结论化合物6为新化合物。

丙线磷对中华大蟾蜍早期胚胎发育的影响

用3种不同浓度的丙线磷分别处理中华大蟾蜍的处于受精卵、8-细胞、囊胚晚期、原肠晚期4个不同时期的早期胚胎5h。结果发现,丙线磷对中华大蟾蜍的早期胚胎发育有致死致畸效应,各个时期其发育异常比例随丙线磷浓度的增加而升高,在其发育过程中出现了两种异常类型:原肠外突和畸形神经胚,并且各个时期对丙线磷的敏感性不同,其中原肠晚期的胚胎对丙线磷最为敏感,同等浓度下,发育异常比例最高,这与原肠晚期胚胎的发育特点有关。

壬基酚对中华大蟾蜍蝌蚪的毒性效应

为评价水体中低浓度壬基酚(NP)对中华大蟾蜍(Bufo bufogargarizans)蝌蚪的毒性效应,采用室内饲养、测定方法,研究了NP在不同暴露时间(8、16、24、32d),不同浓度(0.002、0.005、0.010mg·L-1)条件下,对蝌蚪生长发育、过氧化氢酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量和DNA损伤的影响。结果表明:暴露于0.010mg·L-1NP的蝌蚪,其生长发育被极显著抑制(P<0.01);CAT活性在两个较低浓度组(0.002、0.005mg·L-1)表现为先诱导后恢复,在0.010mg·L-1浓度组表现为诱导-恢复-诱导(P<0.05);MDA含量在两个较低浓度组(0.002、0.005mg·L-1)持续升高(P<0.05),呈明显的时间-效应关系;各处理组DNA损伤水平均显著高于对照组(P<0.05),但随暴露时间的延长而有所下降,具有一定的剂量-效应关系。总之,即使水体中的NP符合灌溉标准,也可能抑制蝌蚪的生长发育,并对其造成氧化损伤和遗传损伤。

丁草胺对中华大蟾蜍蝌蚪的遗传毒性

以中华大蟾蜍(Bufo gargarizans gargarizans)蝌蚪为研究对象,采用微核实验和碱性单细胞凝胶电泳法(又称彗星实验,SCGE)检测不同质量浓度(0.1,0.2,0.3,0.4 mg/L)的丁草胺溶液对中华大蟾蜍蝌蚪红细胞的遗传毒性.结果表明:在实验室条件下,丁草胺质量浓度越高,蝌蚪红细胞的微核率和核异常率越显著.经丁草胺溶液处理24 h,蝌蚪红细胞的细胞损伤率及DNA损伤程度(彗星DNA长宽比)出现极显著的提高,并与丁草胺质量浓度呈显著的线性关系.研究表明丁草胺对两栖动物具有遗传毒性作用,同时也说明微核实验和碱性单细胞凝胶电泳法是检测环境污染对两栖动物遗传毒性的合适方法.

大蟾蜍蝌蚪与中国林蛙蝌蚪生长发育的温度效应

将大蟾蜍(Bufogargarizans)蝌蚪及中国林蛙(Ranachensinensis)蝌蚪分别饲养在5℃、15℃、25℃3个不同的温度条件下,通过定时定量喂食及测量其全长、体长、体宽的变化,分析温度对蝌蚪生长发育的影响。实验结果表明:(1)在5℃下,大蟾蜍蝌蚪的全长和中国林蛙蝌蚪的全长及体长的增长速率最快;在25℃下,大蟾蜍蝌蚪的体长、体宽和中国林蛙蝌蚪的体宽的增长速率最快。(2)在不同温度条件下,大蟾蜍蝌蚪的全长和体长与时间都呈指数关系,而体宽的生长发育与时间呈一种对数增长关系;中国林蛙蝌蚪的全长和体长与时间都呈对数关系,而体宽的生长发育与时间呈一种线形关系,并且相关系数R都在0.75以上。(3)在相同时间内,25℃的温度条件下大蟾蜍蝌蚪和中国林蛙蝌蚪的变态率最高;在5℃的温度条件下,两种蝌蚪都不能完成变态发育过程,温度对大蟾蜍蝌蚪和中国林蛙蝌蚪的生长发育有显著影响,生长发育速度随生长温度的升高而加快。

中华大蟾蜍galectin-3 cDNA的克隆、序列分析及原核表达载体的构建

通过PCR扩增出中华大蟾蜍Bufo gargarizans半乳糖凝聚素3(gal-3)cDNA全长开放读码框(ORF)并克隆至pGM-T载体,经DNA测序确定获得全长ORF序列(GenBank登录号为JN993733).序列分析表明中华大蟾蜍gal-3的ORF是由789个碱基组成,编码262个氨基酸残基组成的蛋白质.推导氨基酸序列同源性比较发现,中华大蟾蜍与非洲爪蟾Xenopus lavis同源性最高,为51%,与其他10种动物的同源性在41%～50%之间.SMART分析显示gal-3蛋白在136-259位氨基酸存在保守的半乳糖结合域.Net Phos预测gal-3在Ser-6和Ser-186有潜在的丝氨酸磷酸化位点.gal-3氨基酸序列构建的进化树符合传统动物分类学特点.经菌落PCR、双酶切和DNA测序确认gal-3的ORF正确插入原核表达载体pET-28b,表明原核表达用重组质粒构建成功,为研究其蛋白功能和生物学功能奠定了基础.

除草剂草甘膦异丙胺盐水剂对中华大蟾蜍心电活动的影响

采用生物信号采集处理系统对草甘膦异丙胺盐胁迫条件下中华大蟾蜍(BufogargarizansCantor)的心率和心电活动的相关指标进行了测定和分析。不同浓度的草甘膦异丙胺盐溶液被喷施到中华大蟾蜍的体表,由皮肤进入体内而作用于心脏。试验结果表明:随着草甘膦异丙胺盐处理浓度的增大,中华大蟾蜍的心率减慢,心电图中P波、R波和T波的电压峰值降低,而P-R间期、QRS期和Q-T间期的时值延长。草甘膦异丙胺盐胁迫条件下,蟾蜍心率与心电图的各项指标有显著相关性,可用多元线性回归模型分别对蟾蜍心率与心电图中P、R、T波和P-R、QRS、Q-T间期的相关关系进行拟合。多元回归分析结果表明,蟾蜍心电图中Q-T间期值对心率的影响最大,可以推断草甘膦异丙胺盐主要是通过延长蟾蜍心电活动周期中Q-T间期时值即心室收缩期而延长心动周期,导致蟾蜍心率减慢。由此可见草甘膦异丙胺盐水剂的喷施对中华大蟾蜍心脏的电活动周期和机械活动周期均造成了一定影响。

中华大蟾蜍与花背蟾蜍间有性杂交胚胎核型的分析

本文采用胚胎细胞分离及空气干燥法，以痘同发育时期的杂种胚胎为材料，分析了杂种胚胎的核型。结果表明：中华大蟾蜍与花背蟾蜍间正反组合的杂种胚贻染色体数目均为22条，可配成11对，均由中华大蟾蜍和花背蟾蜍的单倍体组成，沤个组别中，随体显现率，中华大蟾蜍的第6染色体高于花育蟾蜍的第4染色体。从囊胚期到蝌蚪期，杂种胚胎中期相中均有畸变的染色体出现，大多表现为双缢痕及着丝点异位，畸变率为3．8－12％。

氟对不同发育时期中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性研究

为探讨氟离子对中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)幼体的毒性效应,采用半静态生物毒性试验方法对中华大蟾蜍不同发育时期(23期、26期、30期和36期)蝌蚪进行了氟离子急性毒性试验,测定了氟离子对中华大蟾蜍4个发育时期蝌蚪的半致死质量浓度(LC50)及350mg/L暴露下对肝脏组织造成的损伤。结果表明:氟离子对中华大蟾蜍23期、26期、30期和36期蝌蚪的96 h半致死质量浓度(LC50)分别为689.11 mg/L、568.96mg/L、495.42mg/L和541.36mg/L,安全质量浓度分别为6.89mg/L、5.69mg/L、4.95 mg/L和5.41 mg/L;不同发育时期蝌蚪对氟离子的敏感性有差异,其中30期蝌蚪的敏感性最强,但蝌蚪对氟离子的敏感性与其体长和体重均无显著相关性(p>0.05);试验用水的硬度会影响氟离子的毒性效应,36期蝌蚪以去离子水和曝气自来水为试验用水条件下的96 h-LC50分别为492.32mg/L和541.36mg/L;高质量浓度氟离子短期暴露可致肝脏组织受损,肝细胞数目显著减少。研究表明,中华大蟾蜍幼体对氟毒性较敏感,水体氟污染的生态毒性效应应引起高度重视。