大肠杆菌与金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜组织细胞因子表达及损伤程度的影响

本试验旨在研究体外感染金黄色葡萄球菌与大肠杆菌对奶牛子宫内膜组织中细胞因子白介素-6(IL-6)、IL-1β和IL-8的表达及损伤程度的影响。以体外培养的奶牛子宫内膜组织作为研究对象,采用1×10~5~1×10~9 CFU/mL大肠杆菌与金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜组织进行体外感染,通过实时荧光定量PCR和ELISA方法检测两种细菌刺激后奶牛子宫内膜组织中IL-6、IL-1β及IL-8 mRNA与蛋白的表达量,并用HE染色法观察两种细菌感染后奶牛子宫内膜组织病理学切片。结果显示,1×10~5~1×10~9 CFU/mL大肠杆菌体外感染后,奶牛子宫内膜组织中IL-6、IL-1β和IL-8 mRNA表达量均极显著高于空白对照组(P<0.01);金黄色葡萄球菌感染浓度为1×10~5、1×10~6 CFU/mL时,IL-6、IL-1βmRNA表达量极显著高于空白对照组(P<0.01),感染浓度为1×10~7 CFU/mL时,IL-6、IL-1βmRNA表达量显著高于空白对照组(P<0.05),感染浓度为1×10~6 CFU/mL时,IL-8 mRNA表达量显著高于空白对照组(P<0.05),其他感染浓度均与空白对照组无显著差异(P>0.05)。奶牛子宫内膜组织感染1×10~5~1×10~9 CFU/mL金黄色葡萄球菌和大肠杆菌时,IL-6、IL-1β及IL-8蛋白表达量均极显著高于空白对照组(P<0.01)。相同浓度的大肠杆菌感染奶牛子宫内膜组织后,IL-6、IL-1β及IL-8 mRNA与蛋白表达量均极显著高于金黄色葡萄球菌感染组(P<0.01)。HE切片染色结果显示,大肠杆菌感染后仍有部分上皮细胞保留,而金黄色葡萄球菌感染后上皮细胞全部脱落。本试验结果表明,大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染奶牛子宫内膜组织后,引起的炎症反应不同。大肠杆菌感染后,促炎性细胞因子被显著上调,而金黄色葡萄球菌感染后破坏子宫内膜上皮细胞程度更加严重。

EP2受体介导大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织损伤机制研究

为了探索EP2受体是否参与调节大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织损伤,试验以体外培养的奶牛子宫内膜组织为研究对象,采用实时荧光定量PCR、免疫荧光和H.E.染色等方法对EP2受体激动剂处理的大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织中损伤因子HMGB-1和HABP1的表达以及子宫内膜组织损伤情况进行了研究。结果表明:与空白对照组相比,用大肠杆菌处理后可极显著上调奶牛子宫内膜组织中HMGB-1和HABP1 mRNA及蛋白的表达,而用大肠杆菌和EP2受体激动剂共同处理组织后HMGB-1和HABP1 mRNA及蛋白的表达进一步升高。用大肠杆菌处理的子宫内膜组织上皮细胞部分脱落,腺细胞崩解、坏死,腺体轮廓不清晰;而用大肠杆菌和EP2受体激动剂共同处理时,子宫内膜组织损伤情况进一步加强,上皮细胞完全脱落,腺体崩解融合更加严重。说明EP2受体能够介导大肠杆菌引起的奶牛子宫内膜组织损伤。

EP4受体参与调控大肠杆菌感染后奶牛子宫内膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达、分泌及组织损伤

为了研究EP4受体是否参与调控大肠杆菌感染后的奶牛子宫内膜组织中促炎性细胞因子的表达及组织损伤,试验以体外培养的奶牛子宫内膜组织为研究对象,利用实时荧光定量PCR、ELISA和石蜡切片H.E.染色法检测EP4受体途径对大肠杆菌感染后的奶牛子宫内膜组织中白介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达和分泌情况,并观察EP4受体激动剂(CAY10598)对子宫内膜组织损伤情况的影响。结果表明:与空白对照组比,大肠杆菌感染组感染12 h后IL-1β、IL-6、TNF-α的表达和分泌量均极显著升高(P<0.01);与大肠杆菌感染组比,大肠杆菌+CAY10598共同作用组共同培养12 h后,IL-1β、IL-6、TNF-α的表达和分泌量均极显著升高(P<0.01),奶牛子宫内膜上皮细胞和腺细胞崩解、脱落。说明EP4受体参与大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达和分泌及组织损伤。

PGD_(2)/DP_(1)途径对细菌感染奶牛子宫内膜组织中HMGB-1和PAFR表达的影响

为了研究前列腺素D2(prostaglandin D2,PGD2)/DP1受体途径对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染奶牛子宫内膜组织中炎症介质HMGB-1和PAFR的表达及对组织损伤程度的影响,试验以体外培养奶牛子宫内膜组织为研究对象,应用1×10-6 mol/L DP1受体激动剂(BW-245C和15d-PGJ2)和等量(1×106 CFU/mL)大肠杆菌、金黄色葡萄球菌共同处理奶牛子宫内膜组织,采用实时荧光定量PCR、免疫组化和HE染色法检测奶牛子宫内膜组织中HMGB-1和PAFR的表达并评价组织损伤情况。结果显示,与空白对照组相比,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染奶牛子宫内膜组织中HMGB-1和PAFR表达量显著升高(P<0.05),而DP1受体激动剂与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌共处理奶牛子宫内膜组织中DP1受体激动剂显著抑制奶牛子宫组织中HMGB-1和PAFR的表达(P<0.05)。HE染色结果显示,大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染的奶牛子宫内膜组织上皮细胞和腺上皮细胞完全脱落、坏死、崩解;而DP1受体激动剂、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌共同处理奶牛子宫内膜组织中,DP1受体激动剂的加入显著减轻奶牛子宫内膜组织的损伤程度(P<0.05)。免疫组化染色法结果与以上两种方法结果一致。结果表明,PGD2能够抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染的奶牛子宫内膜组织中损伤相关因子HMGB-1、PAFR的表达,减轻组织损伤程度,这一作用可能是由DP1受体所介导的。

雌激素对奶牛子宫内膜组织中生长因子的影响

为了使用雌激素诱导体外培养的奶牛子宫内膜组织,试验采用Western-blot法检测雌激素对奶牛子宫内膜组织中结缔组织生长因子（CTGF）、成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、细胞增殖抗原（PCNA）蛋白表达的影响。结果表明：与对照组比较,在雌激素诱导下CTGF、FGF-2、TGF-β1、VEGF、MMP-2、PCNA的蛋白表达水平上升,且呈现时间依赖性增高。说明雌激素能够对奶牛子宫内膜组织中CTGF、FGF-2、TGF-β1、VEGF、MMP-2、PCNA等生长因子的表达产生影响,从而为进一步研究雌激素对奶牛子宫内膜组织生长因子表达影响的作用机制提供可靠的理论基础。

TLR4介导大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织中PGE2分泌研究

为了探讨TLR4与大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织中前列腺素E2(PGE2)蓄积的相关性,试验分别用1×10-5 mol/L和1×10-6 mol/L的TLR4抑制剂处理体外培养的大肠杆菌DH5α感受态细胞和大肠杆菌突变株JE5505(脂蛋白缺失菌)感染的奶牛子宫内膜组织,用实时荧光定量PCR方法检测组织中COX-2和mPGES-1 mRNA的表达,用ELISA法检测组织上清液中PGE2的分泌情况。结果表明:大肠杆菌DH5α感受态细胞和大肠杆菌突变株JE5505感染的奶牛子宫内膜组织中COX-2和mPGES-1 mRNA的表达量及组织上清液中PGE2的分泌量明显升高,而TLR4抑制剂能明显降低大肠杆菌DH5α感受态细胞和大肠杆菌突变株JE5505感染的奶牛子宫内膜组织中COX-2和mPGES-1 mRNA的表达量及组织上清液中PGE2的分泌量。说明TLR4可调控大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织中炎症介质PGE2的分泌。

雌二醇对奶牛子宫内膜组织中结缔组织生长因子基因表达的影响

观察雌二醇(17β-estraidol,E_2)对奶牛子宫内膜组织中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)mRNA表达的影响,并探讨雌激素对奶牛子宫内膜组织修复的机制。体外培养奶牛子宫内膜组织,应用荧光定量PCR技术检测E_2对奶牛子宫内膜组织中CTGF mRNA表达的影响。结果显示,与空白对照组相比较,E_2能够极显著(P<0.01)地抑制CTGF mRNA的表达。由研究结果可知,E_2能够对奶牛子宫内膜组织中CTGF的基因表达产生调节作用。

前列腺素D_(2)对大肠杆菌感染奶牛子宫内膜组织中细胞因子和损伤相关因子表达的影响

以体外培养奶牛子宫内膜组织为研究对象,运用ELISA、荧光定量PCR、HE染色和免疫荧光法分析了内源性和外源性前列腺素D_(2)(prostaglandin D_(2),PGD_(2))在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)感染奶牛子宫内膜组织过程中对细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和损伤相关因子(HMGB-1)表达的调控作用。结果显示,与空白对照组相比较,E.coli感染组奶牛子宫内膜组织中COX-2和H-PGDS的基因表达显著升高(P<0.001);PGD_(2)分泌量也显著上升(P<0.001);内源性PGD_(2)抑制剂(H-PGDS inhibitor 1、HQL-79)能够显著抑制E.coli感染奶牛子宫内膜组织中促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的分泌、损伤相关因子(HMGB-1)的表达并减轻了组织损伤;外源性添加PGD_(2)后可显著促进E.coli感染奶牛子宫内膜组织中促炎细胞因子的分泌,HMGB-1的表达及组织损伤程度明显增加。结果表明,PGD_(2)能够通过调控E.coli感染奶牛子宫内膜组织的过程促炎细胞因子和损伤相关因子的表达,进而加剧了由细菌感染引起的组织损伤。

诃子鞣酸通过MAPK/NF-κB通路调控LPS诱导的奶牛子宫内膜组织炎症反应的作用

分离并体外培养奶牛子宫内膜组织,用1.0 mg/L脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激1 h后与诃子鞣酸(Chebulagic acid,CA)(12.5、25.0、50.0、100.0 mg/L)共培养,然后收集不同处理组的奶牛子宫内膜组织进行试验。应用ELISA和实时荧光定量PCR法检测TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白分泌水平和基因表达水平;HE染色观察奶牛子宫内膜组织损伤程度;应用免疫荧光技术鉴定高迁移率蛋白-1(high mobility grope boxprotein 1,HMGB-1)、透明质酸酶结合蛋白-2(hyaluronidase binding protein 2,HABP-2)的表达;Western blot检测ERK、p65和IκBα的磷酸化表达水平。结果显示,经CA处理LPS诱导的奶牛子宫内膜组织炎症反应模型后,TNF-α在6、24 h和IL-6在6、12、24 h的蛋白分泌水平显著下降,IL-1β和IL-6在6、9、12 h和TNF-α在6 h的基因表达水平均显著下调;HE染色切片发现,LPS+CA组相比LPS组均有所改善,上皮细胞脱落程度减轻,腺体和血管结构较为完整,炎性细胞浸润程度降低,无明显的坏死或出血;LPS+CA组也显著下调了HMGB-1和HABP-2的表达;LPS+CA组的ERK、IκBα和p65的磷酸化水平显著降低。结果表明,CA能够通过抑制LPS诱导的奶牛子宫内膜组织炎症反应中MAPK和NF-κB通路的激活,下调其奶牛子宫组织中炎症因子的表达水平从而减轻LPS诱导的奶牛子宫内膜组织炎症反应。由此推断,CA可能是一种潜在的奶牛子宫内膜炎的治疗药物,值得进一步的研究和开发。

EP2受体对大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织中IL-1β和IL-6 mRNA表达的影响

为了研究前列腺素E2(PGE2)受体-EP2受体对大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织中炎性因子的影响,本试验分别用1×10-8~1×10-5 mol/L的EP2受体激动剂(Butaprost)处理大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织,培养12 h,并选取Butaprost的有效作用浓度处理大肠杆菌感染的子宫内膜组织8,12和24 h,用RT-qPCR法检测IL-1β和IL-6 mRNA的表达,同时用HE染色技术观察组织形态结构。最后,在大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织中加入1×10-5 mol/L的EP2受体阻断剂(AH6809),以验证EP2受体对IL-1β和IL-6 mRNA表达的特异性作用。结果显示:当10-7mol/L的Butaprost处理大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织12 h时,对IL-1β和IL-6基因表达的促进作用最为明显,并且能够加剧大肠杆菌引起的奶牛子宫内膜组织的病理性损伤;AH6809能够有效阻断Butaprost对IL-1β和IL-6基因表达的促进作用。结果表明,EP2在调控大肠杆菌引起的奶牛子宫内膜组织的炎性损伤中发挥重要的作用,为更加高效地治疗细菌性奶牛子宫内膜炎提供理论依据。

大肠杆菌对奶牛子宫内膜组织合成分泌IL-1β、IL-6和PGE2的影响

基于奶牛子宫内膜组织体外培养方法,分别采用浓度为1×105,1×106 CFU/mL的致病性大肠杆菌处理体外培养的子宫内膜组织12,24 h后用HE染色方法评价组织损伤情况,ELISA法检测组织培养液上清中IL-1β,IL-6和PGE2的分泌变化,RT-qPCR法检测IL-1β和IL-6基因表达变化。结果显示:与对照组相比,大肠杆菌分别处理12,24 h后奶牛子宫内膜组织中子宫内膜上皮细胞和腺上皮细胞脱落、坏死、崩解,并且显著提高奶牛子宫内膜组织IL-1β,IL-6和PGE2的分泌及IL-1β和IL-6的mRNA的表达量。结果表明:成功建立了体外大肠杆菌型奶牛子宫内膜炎模型,且IL-1β,IL-6和PGE2在大肠杆菌引起的奶牛子宫内膜组织炎症反应中发挥着重要的调控作用。

前列腺素F_(2α)-PTGFR通路的激活对奶牛子宫内膜组织中生长因子表达的影响

子宫内膜修复和前列腺素F_(2α)(PGF_(2α))分泌之间存在正相关关系,但PGF_(2α)在子宫内膜修复中发挥的具体作用目前仍未知。本试验通过体外培养奶牛子宫内膜组织,研究激活PGF_(2α)受体(prostaglandin F_(2α) receptor, PTGFR)对参与子宫内膜修复的一系列生长因子表达的影响。结果显示,在使用氟前列醇(fluprostenol)激活PTGFR后,子宫内膜组织中结缔组织生长因子(CTGF)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和血管内皮生长因子(VEGFA)的mRNA和蛋白表达水平均显著上调(P<0.05)。此外,子宫内膜组织中能够代表细胞发生增殖的增殖细胞核抗原(PCNA)水平也出现显著上升(P<0.05)。结果表明,PGF_(2α)-PTGFR通路的激活可通过诱导生长因子的表达对奶牛子宫内膜的生长起到促进作用。

PTGER2激活对奶牛子宫内膜组织中生长因子表达的影响

为了探索并分析用布他前列素(butaprost)激活前列腺素E_(2)(PGE_(2))受体2(PTGER2)后对奶牛子宫内膜组织中参与组织修复过程的生长因子表达的影响,本试验分离并体外培养了奶牛子宫内膜组织,用不同终浓度(10^(-9)-10^(-5)mol/L)的PTGER2激动剂布他前列素处理,分别在相应处理后的时间点(2,4,8,12,18,24,36或48 h)提取组织mRNA和总蛋白,通过实时荧光定量PCR和Westernblot分析奶牛子宫内膜组织中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor 2,FGF-2)、转化生长因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK-18)和成纤维细胞特异蛋白1(fibroblast-specific protein 1,FSP-1)的表达情况。结果表明,终浓度为10-7mol/L的布他前列素可在不同处理时间点诱导奶牛子宫内膜组织中CTGF、FGF-2、TGF-β1和VEGFA mRNA和蛋白的表达量显著升高(P<0.05)。此外,在使用布他前列素激活PTGER2后,奶牛子宫内膜组织中PCNA、CK-18和FSP-1表达水平也出现显著上调(P<0.05),说明PTGER2的激活可能诱导组织中上皮细胞和成纤维细胞的增殖。上述结果说明,PTGER2的激活可能对奶牛子宫内膜组织的修复具有一定促进作用。

大肠杆菌感染奶牛子宫内膜组织而蓄积的PGE2与感染组织CXCLs mRNA表达的相关性

为研究大肠杆菌感染奶牛子宫内膜组织而蓄积的PGE2与感染组织表达趋化因子的相关性,本试验采用浓度为1×10^-6和1×10^-5 mol/L的COX-2和mPGES-1抑制剂处置体外培养的大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织12 h,用RT-qPCR法检测组织中CXCL1、CXCL2、CXCL3和CXCL5 mRNA表达变化。结果显示:与对照组相比,大肠杆菌感染后12 h奶牛子宫内膜组织中趋化因子mRNA的表达量显著升高,而COX-2和mPGES-1抑制剂处置显著降低趋化因子mRNA的表达。结果表明:病理性蓄积的PGE2也许是大肠杆菌所致奶牛子宫内膜组织炎症反应过程中趋化因子等炎症介质表达的必要条件。

前列腺素D_(2)-DP_(1)受体途径对细菌性奶牛子宫内膜炎炎症介质表达的影响

为了阐明前列腺素D 2(prostaglandin D2,PGD 2)/DP 1受体途径参与大肠埃希氏菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)所致奶牛子宫内膜炎炎症反应的作用机制,以体外培养奶牛子宫内膜组织为研究对象,用浓度1×10^(-6) mol/L的DP 1受体激动剂(BW-245C,15d-PGJ2)或DP 1受体抑制剂(S5751,MK-0524)处理E.coli与S.aureus感染体外培养的奶牛子宫内膜组织12 h,用RT-qPCR检测IL-6、TNF-α和NOS-2表达变化;ELISA检测培养液上清中IL-6、TNF-α分泌变化;免疫荧光法检测组织中NOS-2蛋白表达情况。结果显示,与空白对照组相比,E.coli和S.aureus感染奶牛子宫内膜组织中IL-6、TNF-α和NOS-2的表达显著升高(P<0.05);DP 1受体激动剂与E.coli和S.aureus共孵育奶牛子宫内膜组织,显著抑制组织中IL-6、TNF-α和NOS-2的表达(P<0.05);而DP 1受体抑制剂、E.coli和S.aureus共同处理体外培养的奶牛子宫内膜组织后,组织中IL-6、TNF-α和NOS-2的表达显著高于细菌感染组(P<0.05)。表明PGD 2/DP 1途径在细菌诱导的奶牛子宫内膜炎症中发挥着重要的调控作用。