基于定向固定化抗体的侧向流免疫检测试纸建立食用油中玉米赤霉烯酮的检测方法

目的基于定向固定化抗体的侧向流免疫检测试纸建立食用油中玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)的检测方法,并考察市售食用油中ZEN污染状况。方法通过链球菌蛋白G将ZEN抗体定向固定化在铕荧光微球上制备了免疫探针,构建侧向流免疫检测(lateral flow immunoassay,LFIA)试纸,并建立了食用油中ZEN含量的快速检测方法,并对65个市售食用油样品中的ZEN含量进行了检测。结果采用抗体定向固定化方式制备免疫探针可以使检测曲线线性范围收窄,提高试纸的检测精密度。建立的食用油中ZEN快速检测方法前处理步骤只需1步,检测用时仅15 min。方法的检出限为3.93μg/kg,线性范围为22.40~800.00μg/kg。市售食用油样品中ZEN的检出率为58.5%,其中,玉米油中的ZEN检出率为100%,且ZEN含量最高。结论本研究成功制备了可以快速、准确检测食用油中ZEN含量的侧向流免疫层析试纸,并且所探究的抗体定向固定化技术对于提高其他小分子污染物免疫检测技术的分析性能具有参考价值。

蛋白A定向固定抗体的纤维蛋白压电免疫传感器的研究

将９ＭＨｚ双面镀金石英晶体浸入蛋白Ａ溶液中，在晶体电极表面形成一层均匀的蛋白Ａ薄层，用于定向固定人体纤维蛋白抗体．在蛋白Ａ层上形成一层有序致密的自组装抗体分子膜，研制成一种新型的用于人体纤维蛋白检测的压电免疫传感器．比较了３种固定抗体方法的效果，从传感器的灵敏度、稳定性、重现性等考虑，蛋白Ａ吸附法优于聚乙烯亚胺及牛血清白蛋白固定抗体的方法．研究了蛋白Ａ浓度、抗体效价以及抗原抗体反应时间等对传感器灵敏度的影响，考察了电极的选择性和再生能力．纤维蛋白在１×１０－４～１×１０－２ｇ／Ｌ浓度范围内有良好响应．

金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶的研究

以磁性金属螯合琼脂糖微球为载体,利用金属螯合配体(IDACu2+)与蛋白质表面供电子氨基酸相互作用的原理,定向固定了木瓜蛋白酶。固定化最适条件为Cu2+1.5×10-2molg载体、固定化时间4h、固定化pH7.0、给酶量30mgg载体。固定化酶的最适反应温度70℃、最适反应pH8.0,固定化酶的热稳定性明显高于溶液酶,固定化酶活力回收为68.4%,且有较好的操作稳定性,载体重复使用5次后固定化酶酶活为首次固定化酶79.71%。

胰蛋白酶定向固定化亲和配基的理性设计

在胰蛋白酶三维(3D)结构的基础上,首先利用分子对接从ZINC数据库中筛选获得了与胰蛋白酶具有较高亲和性的小分子配基2-硝基苯基-β-D-葡糖苷,并分析了该配基与蛋白质之间的相互作用力主要为范德华和氢键相互作用.并利用分子动力学模拟进一步验证了2-硝基苯基-β-D-葡糖苷与胰蛋白酶之间具有较强的亲和作用.分子动力学(MD)模拟结果表明,配基-目标蛋白质之间形成稳定的复合物且它们之间的距离基本没有变化.此外,一个水分子通过氢键在配基和目标蛋白质的结合腔之间架桥.最后制备了偶联有该配基的亲和载体,进行了胰蛋白酶的定向固定化,并考察了该固定化酶的活性.研究结果表明,利用修饰2-硝基苯基-β-D-葡糖苷配基的亲和载体固定化胰蛋白酶的酶活达到340.8 U·g^(-1),比活达到300.3 U·mg^(-1),分别是未修饰亲和配基载体的10倍和5倍,具有明显的优势.上述结论证明了结合分子对接和分子动力学模拟理性设计定向固定化亲和配基的方法是可行的,具有一定的理论和实用价值.

酶的定向固定化方法及其对酶生物活性的影响

固定化酶可以提高酶的稳定性 ,但通常酶通过酶分子上的多个赖氨酸残基随意固定在载体上 ,这样会使酶的活性显著下降 ,采用定向固定化酶不仅可以提高酶的稳定性 ,而且可以保存它的活性。综述了定向固定化酶的几种方法 ,比较了定向固定化和随意固定化对酶活性的影响。另外 ,还叙述了酶的活性位点结构变化的自旋共振波谱 (EPR)检测。

基于蛋白A定向固定抗体的触珠蛋白压电免疫传感器的研究

用蛋白A-金电极法将触珠蛋白抗体固定在9 MHz镀金石英晶体比表面,研制了一种简单、灵敏的压电免疫传感器,用于溶血性贫血与严重肝病标志物-触珠蛋白的高特异性检测.比较了传感器采用直接金电极吸附法、牛血清白蛋白吸附-戊二醛交联法和蛋白A法三种固定抗体的方法.研究了蛋白A的定向自组装、抗体的固定化浓度和免疫反应时间等主要因素对免疫传感检测灵敏度的影响,并考察了传感器响应与再生性能.测得该免疫传感器检测人血清中触珠蛋白的线性浓度范围为1.27～31.7 mg/L.

酶定向固定化方法及应用的研究进展

传统固定化方法常会导致酶活性大幅度下降,回收率较低,而酶定向固定由于固定化后可完全暴露其活性部位,因而可以保持较高的酶活回收率。本文主要综述了定向固定化酶的两种方法,分别为共价定向固定和非共价定向固定。其中非共价定向固定化主要是抗体与抗原、亲和素/链霉亲和素和生物素以及组氨酸标签与Co2+/Ni2+之间的亲和作用;共价定向固定化主要是通过半胱氨酸残基上的巯基与载体作用。简述了其在生物传感器、分子识别、酶生物燃料电池及酶纯化方面的应用。最后指出今后的主要研究方向为探索新的定向固定化标签以降低对酶活性部位的影响,应用新的载体以提高固定化酶酶活回收率,优化固定化过程及简化固定化步骤等。

以伴刀豆球蛋白为介质定向固定化脲酶的研究

将戊二醛将伴刀豆球蛋白(ConA)和壳聚糖载体交联,然后利用ConA与脲酶糖链的特异性结合作用,实现脲酶的定向固定化。定向固定化的最适条件为戊二醛浓度3.5%、ConA浓度1 mg/mL、ConA溶液pH值7.0、脲酶浓度0.4 mg/mL。定向固定化脲酶的最适pH 5.0～6.0、最适温度77℃、米氏常数Km11.76 mmol/L,与游离酶及非定向固定化脲酶比较,定向固定化脲酶的最适pH向酸性范围发生了偏移并有更宽的pH适用范围,最适温度提高,与底物的亲和力较大,且有较好的操作稳定性。

定向固定化葡萄糖氧化酶及其酶学性质的研究

戊二醛将伴刀豆球蛋白(ConA)和载体壳聚糖膜交联,然后利用ConA与葡萄糖氧化酶糖链的特异性结合作用,实现酶的定向固定化。定向固定化的最适条件为戊二醛浓度0.1%、ConA浓度0.02mg/ml、葡萄糖氧化酶浓度0.08mg/ml。定向固定化葡萄糖氧化酶的最适pH4.0、最适温度57℃,米氏常数K_m为15.84mmol/L,与游离酶及非定向固定化葡萄糖氧化酶比较,定向固定化葡萄糖氧化酶的最适pH值向酸性范围发生了偏移并有更宽的pH值适用范围,最适温度提高,与底物的亲和力较大。

基于DNA定向固定化技术构建毛细管固定化酶微反应器的研究进展

生物酶影响着物质代谢和质能转换等生命活动,生物体内某些酶的活性变化会导致疾病的发生。发展新型的酶分析方法对深刻理解生物代谢过程、疾病诊断和药物研发等具有重要意义。毛细管电泳(CE)具有分离效率高、分析速度快、操作简单和样品消耗少以及可与多种检测手段联用等优点,在酶分析研究中越来越受到关注。CE酶分析主要包括离线和在线两种模式,其中,固定化酶微反应器与毛细管电泳联用(CE-IMER)的在线酶分析已经成为主要的酶分析方法之一。CE-IMER充分结合了固定化酶和CE的优势,将游离酶固定在毛细管内,不仅可以显著提高酶的稳定性和重复使用性,而且可以实现纳升规模溶液的自动化酶分析,进而显著降低酶分析成本。目前已有大量方法制备IMER用于CE酶分析,然而如何构建性能良好、可再生使用、酶固载量大、自动化程度高的CE-IMER一直是该领域重点研究的问题。DNA定向固定化技术(DDI)可以充分利用DNA分子的碱基互补配对(A-T,C-G),在温和的生理条件下特异性固定生物大分子。由于短链双螺旋DNA分子具有较强的机械刚性和物理化学稳定性,通过DDI将酶固定在载体表面,有利于降低传质阻力,提高酶与底物的接触能力,进而促进酶促分析过程。该文主要综述了利用DDI构建新型IMER在CE酶分析中的应用现状,并对其未来发展进行了展望。

酶定向固定的几种新方法

传统的膜一般是通过多个赖氨酸残基和蛋白质的反应将生物分子随机固定在多孔的聚合物膜上。通过运用分子物理学、生物分析化学、化学工程和分子生物学来论述生物技术在酶的定向固定中的应用,这样不仅可以提高酶的稳定性,而且可以保存它的活性。同时,采用电子顺磁共振技术比较了定向固定化和随机固定化的优劣。

固定化药靶蛋白中药活性成分定向筛选研究进展

中药活性成分筛选及作用评价一直是破解药物发现周期长和成功率低等瓶颈问题的核心突破口和重要技术支撑。作者团队创新亲和色谱原理,将药靶蛋白定向固定于色谱担体表面,制备了系列高活性功能化色谱固定相,并提出了固定化药靶蛋白定向筛选中药功效成分的新观点。主要综述了作者团队近五年在固定化药靶蛋白色谱固定相制备技术、中药活性成分定向筛选技术以及活性成分早期成药性评价色谱技术等方面的工作,并对固定化药靶蛋白在中药活性成分定向筛选方面的研究进行了展望。

基于MEMS和A蛋白自组装膜抗体定向固定技术的安培型免疫传感器

采用微机电系统（micro electromechanical systems，MEMS）技术制备安培型免疫传感器电极系统，并利用A蛋白和硫醇白组装单层膜（self-assembled monolayer，SAM）设计传感界面，用于抗体的定向固定，研制了一种新型的安培型免疫传感器．首先采用MEMS技术，在硅片上制备“Au，Pt，Pt”微型三电极系统和SU-8微型反应池；然后基于自组装技术，先在金电极上制备巯基乙胺自组装单层膜，利用静电吸附作用在巯基乙胺单层膜上组装A蛋白，再利用A蛋白对抗体的定向吸附作用实现抗体在金电极表面的定向固定．该传感器的研制以低成本、微型化、高度集成，以及实现“片上系统”生物传感器为目标．采用循环伏安法和计时电流法研究传感器的响应特性，与采用块体电极的传统传感器以及采用在电极上直接吸附A蛋白的抗体固定方法相比，该传感器体积小，与CMOS集成电路工艺兼容，对人免疫球蛋白（HIgG）的测定响应快（20s），线性范围宽（50--400μg／L），检出限低（10μg／L），并且易于实现传感器的阵列化和实时多参数检测．

生物素-亲和素系统定向固定糖化酶的研究

以生物素-亲和素系统定向固定糖化酶,首先,通过正交试验确定生物素标记糖化酶的最佳条件是:质量浓度为4 mg/mL的酶液2 mL、反应温度20℃、反应pH 4.6、搅拌时间2.5 h;其次,确定了亲和素-磁性琼脂糖微粒的最佳制备条件是:亲和素30μg/mg载体、反应时间20 min、pH 6.6;最后,确定了生物素-亲和素系统定向固定糖化酶的最佳条件是:生物素标记糖化酶液40μL/mg载体、反应时间20 min、反应温度20℃、pH 6.1。此条件下固定化酶活力为1 629.7 U/g,活力回收率为50.3%,固定化酶相对活力为64.7%。对固定化糖化酶的酶学性质的研究表明,固定化酶的最适作用温度65℃,最适作用pH 5.1,米氏常数Km为2.28 mg/mL,较游离糖化酶的米氏常数Km(5.56 mol/L)小,说明其与底物的亲和力提高。固定化酶连续使用5次,酶活仍保持71.8%,固定化酶的半衰期为84 d。

多酶定向共固定化的研究进展

多酶体系的定向共固定可以充分地结合不同种类酶的催化特性,既扩展了酶催化的应用范围,又提高了酶体系的整体反应效率,在很大程度上克服了单酶反应体系单一催化的局限性。文章对单酶应用领域的定向固定化方法作了概述,并讨论了多酶反应体系定向共固定化技术的发展现状。多酶体系定向固定化目前主要依赖于非共价定向化的方法,包括生物亲和作用以及DNA技术。

提高固定化酶活力方法的研究进展

针对酶分子在固定化过程中活性中心受损,分子结构发生变化,导致酶活力下降的现象,介绍了近几年来提高固定化酶活力方法的研究进展。研究结果表明:通过改善固定化酶的通透性,超声波处理,定向固定,新载体的使用等方法可以提高固定化酶的活力,并为其的进一步研究奠定了基础。

免疫学检测中抗体固定化方法的研究现状

免疫学检测技术,因具有快速、灵敏、成本低等优点,被广泛应用于食品安全、环境监测等领域。抗体是免疫学检测的核心试剂,免疫学检测中常需要对抗体进行固定,高效固定抗体对提高检测灵敏度具有重要意义。本文对抗体固定化各类方法的特点及其在免疫学检测中的应用进行综述,并对抗体定向固定化技术发展趋势进行了展望。

酶的固定化技术的研究进展

酶的固定化技术是一门交叉学科技术,目前已得到长足的发展。介绍了近几年酶的固定化技术的一些新技术,主要阐述了新型载体固定化酶技术、无载体固定化酶技术以及酶的定向固定化技术。

酶固定化技术研究进展

酶的固定化技术是酶工程领域研究的重点和热点之一,本文阐述了传统的酶固定化技术,并对定向固定、多酶共固、新型载体等前沿技术做了介绍,另外还对固定化酶的应用前景和发展趋势进行了预测。

新型酶固定化技术研究进展

酶的固定化技术是酶工程的核心技术之一,它的出现降低了酶制剂的成本,促进了酶的工业化应用。对新型的酶固定化技术进行了综述,包括共价固定法、氨基酸置换法、抗体偶联法、生物素-亲和素亲和法、酶与金属离子的连接和疏水定向固定法及其他技术处理方法,并对固定化技术的应用前景进行了展望。