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利用Cas9TX实现非病毒TRAC定点整合制备T细胞
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作者 崔海洋 谭淼 +3 位作者 全壮 陈红利 董艳敏 唐立春 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期190-197,共8页
【目的】Cas9TX是Cas9的变体,能够显著降低基因编辑过程中染色体易位,大幅提升基因编辑的安全性。研究Cas9TX替换Cas9实现基因定点敲入的可行性。【方法】首先,利用His标签蛋白纯化技术制备Cas9TX蛋白,并在细胞水平上通过绘制EC50和核... 【目的】Cas9TX是Cas9的变体,能够显著降低基因编辑过程中染色体易位,大幅提升基因编辑的安全性。研究Cas9TX替换Cas9实现基因定点敲入的可行性。【方法】首先,利用His标签蛋白纯化技术制备Cas9TX蛋白,并在细胞水平上通过绘制EC50和核酸酶裂解动力学曲线等进行功能验证。其次,以RNP和dsDNA混合物电转的方式编辑体外激活的T细胞,流式检测定点敲入的效率。最后,探讨了供体模板进行稳定性修饰提升定点敲入效率的可行性。【结果】制备的Cas9TX在T细胞TRAC基因的A、R和S靶点的敲除效率分别为71.8%、81.0%和79.9%,具有与Cas9相当的基因敲除效率。在TRAC 1号外显子分别设计的dsDNA供体模板(2A-GFP编码序列)和ssDNA供体模板(+GTC bp),发现Cas9TX RNP定点敲入两种模板的效率均显著低于Cas9RNP。通过DNA修饰制备防TREX2核酸外切酶降解的供体模板,不能提升Cas9TXRNP定点敲入的效率。【结论】Cas9TX RNP在TRAC三个靶点的基因敲除方面可以替代Cas9RNP使用,但定点整合外源基因的效率约为Cas9RNP的一半。为Cas9TX应用于基因定点敲入提供了重要参考。 展开更多
关键词 Cas9TX 定点整合 RNP DSDNA CRISPR/Cas9
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运动发酵单胞菌定点整合质粒的构建 被引量:1
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作者 邹少兰 洪解放 +3 位作者 马媛媛 张一婷 张鲲 张敏华 《南开大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期42-47,共6页
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一,被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种,但其可利用的碳源范围窄.对其进行分子生物学基础研究和基因工程改造的工作早在上世纪八、九十年代就开始了,但基... 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一,被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种,但其可利用的碳源范围窄.对其进行分子生物学基础研究和基因工程改造的工作早在上世纪八、九十年代就开始了,但基于其独特的生物学特性,至今遗传操作手段仍不成熟.以大肠杆菌(E.coli)pBR328为出发质粒,分段插入带Z.mobilis乳酸脱氢酶基因ldh、分别作为左右同源臂、1.5 kb大小的DNA片段,构建了Z.mobilis定点整合型质粒pBR328-ldhR-ldhL(6 239 bp),此质粒两同源臂片段即ldhR和ldhL的中间有稀有酶切位点NotI和SfiI,以方便插入待整合片段.经NotI位点插入1 216 bp氯霉素抗性基因cml,将相应质粒pBR328-ldhR-cml-ldhL以环型和线型形式分别电击转化Z.mobilis ZM4菌株,都成功筛选到了ZM4 ldh::cml菌株,证明此定点整合质粒是方便可用的,为对Z.mobilis的定点遗传操作提供了很好的基础. 展开更多
关键词 运动发酵单胞菌 定点整合质粒 ldh基因 cml基因 定点整合
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外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达 被引量:10
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作者 刘萍 夏立秋 +4 位作者 胡胜标 严礼 丁学知 张友明 喻子牛 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期661-666,共6页
【目的】研究构建稳定表达外源基因、无抗性标记基因的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)工程菌的方法。在构建Bt工程菌时,高拷贝外源质粒的转入导致Bt芽孢数量减少,芽孢形成期延滞,影响Bt菌株的杀虫活力。而且,外源质粒在Bt... 【目的】研究构建稳定表达外源基因、无抗性标记基因的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)工程菌的方法。在构建Bt工程菌时,高拷贝外源质粒的转入导致Bt芽孢数量减少,芽孢形成期延滞,影响Bt菌株的杀虫活力。而且,外源质粒在Bt中的稳定性较差,外源基因容易丢失。将基因整合入染色体是一种构建遗传性状稳定、杀虫活力高的Bt工程菌的有效方法。【方法】本研究采用PCR技术,分两段扩增定位于Bt无晶体突变株XBU001染色体上的trigger factor基因片段作为同源臂,克隆入温度敏感型载体pKSV7,构建了定点整合载体pKTF12。并利用pKTF12质粒将cry1Ac基因定点整合入XBU001染色体上。【结果】利用载体pKTF12将cry1Ac定点插入triggerfactor位点,对宿主菌XBU001的正常生长没有影响。重组菌株KCTF12中的cry1Ac基因能够稳定遗传、表达并形成菱形晶体。与携带高拷贝外源质粒的Bt菌株HTX42相比较,KCTF12具有芽孢数量增多、芽孢形成期提前的优势。【结论】定点整合法是一种构建稳定表达外源基因、无抗性标记基因Bt工程菌的有效方法。 展开更多
关键词 苏云金芽孢杆菌 定点整合 同源重组 pKSV7 triggerfactor基因 CRY1AC基因
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动物基因组定点整合转基因技术研究进展 被引量:12
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作者 李国玲 钟翠丽 +5 位作者 莫健新 全绒 吴珍芳 李紫聪 杨化强 张献伟 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期98-109,共12页
传统转基因技术,如显微注射、转座子、慢病毒转染等将目的基因插入基因组内的整合方式是随机的,这些随机整合对后期转基因动物品系组建和育种带来诸多不利,因此有研究人员提出了定点整合转基因技术。目前该技术的定点整合效率非常低,主... 传统转基因技术,如显微注射、转座子、慢病毒转染等将目的基因插入基因组内的整合方式是随机的,这些随机整合对后期转基因动物品系组建和育种带来诸多不利,因此有研究人员提出了定点整合转基因技术。目前该技术的定点整合效率非常低,主要取决于两个方面:一是靶位点产生DNA双链断裂(double-strand break,DSB)的效率;二是断裂后的靶位点与携带同源臂及外源基因的供体质粒发生同源重组的效率,其中同源重组修复(homologous recombination repair,HDR)是基因组定点整合最为依赖的修复机制。靶位点产生DSB后,机体的DNA修复既可能发生HDR,也可能发生非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ),并且两者之间存在竞争关系,因此激活HDR或抑制NEHJ都可提高定点整合转基因的效率。本文结合影响定点整合的因素,对提高定点整合效率最新探索方面进行了综述。 展开更多
关键词 同源重组修复 定点整合 CRISPR/Cas9
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猪瘟病毒E2基因在百脉根叶绿体基因组中定点整合载体的构建 被引量:7
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作者 杨宗岐 李轶女 +2 位作者 张志芳 王勇 沈桂芳 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期2648-2654,共7页
【目的】构建猪瘟病毒主要抗原E2基因在百脉根叶绿体基因组中定点转化载体,为百脉根叶绿体的转化及用叶绿体生产动物可直接食用疫苗奠定基础。【方法】通过用BLAST、DNAMAN等分子生物学分析软件对百脉根叶绿体基因组序列进行分析选定同... 【目的】构建猪瘟病毒主要抗原E2基因在百脉根叶绿体基因组中定点转化载体,为百脉根叶绿体的转化及用叶绿体生产动物可直接食用疫苗奠定基础。【方法】通过用BLAST、DNAMAN等分子生物学分析软件对百脉根叶绿体基因组序列进行分析选定同源重组片段,采用PCR、分子克隆技术进行载体构建和鉴定。【结果】在百脉根叶绿体基因组中选择合适的外源基因整合位点,设计引物用PCR扩增叶绿体同源片段,将同源片段克隆后,构建百脉根特异的叶绿体转化载体;构建的百脉根叶绿体定点转化载体pAKE2以扩增的1.35kbpsbA和1.5kbtrnK两段相邻叶绿体DNA为定点整合外源基因的同源重组片段,包含以叶绿体基因特异强启动子Prrn和终止子TpsbA为调控序列的E2基因表达盒和aadA壮观霉素抗性基因表达盒。【结论】经PCR和酶切验证,所构建的转化载体符合预期设计。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。 展开更多
关键词 猪瘟病毒E2基因 叶绿体转化 同源重组 定点整合 百脉根
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定点整合抗虫基因到油菜叶绿体基因组并获得转基因植株 被引量:18
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作者 侯丙凯 胡赞民 +2 位作者 党本元 石锐 陈正华 《植物生理与分子生物学学报》 CAS CSCD 2002年第3期187-192,共6页
以基因枪法进行了油菜叶绿体基因组的定点转化。载体 pNRAB携带抗壮观霉素的筛选标记基因aadA和抗虫基因cry1Aa10 ,基因的两侧被添加了可用于同源重组的叶绿体DNA序列。基因枪轰击过的油菜子叶柄经植株再生和壮观霉素筛选 ,获得了 36株... 以基因枪法进行了油菜叶绿体基因组的定点转化。载体 pNRAB携带抗壮观霉素的筛选标记基因aadA和抗虫基因cry1Aa10 ,基因的两侧被添加了可用于同源重组的叶绿体DNA序列。基因枪轰击过的油菜子叶柄经植株再生和壮观霉素筛选 ,获得了 36株抗性植株。PCR检测和Southern杂交显示 ,其中 4株的叶绿体基因组已被转化 ,外源基因已被定点整合进叶绿体基因组的rps7和ndhB基因之间。用转基因植株的叶片饲喂二龄小菜蛾 ,1周后幼虫死亡率达33%~ 47% ,存活幼虫的生长明显减慢 。 展开更多
关键词 定点整合 抗虫基因 油菜 叶绿体基因组 转基因植株
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CHO/dhfr^-细胞定点整合高效表达系统的建立 被引量:6
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作者 周宏 刘志刚 +1 位作者 孙志伟 俞炜源 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期756-762,共7页
为了克服随机整合建立高表达细胞株时“位置效应”所带来的不可预知的后果,我们尝试建立基于定点整合的CHO高效表达系统。首先设计一个新的高效筛选载体pMCEscan。该载体含有报告基因(k2tPA)、扩增基因(dhfr)、重组酶识别序列(FRT)及筛... 为了克服随机整合建立高表达细胞株时“位置效应”所带来的不可预知的后果,我们尝试建立基于定点整合的CHO高效表达系统。首先设计一个新的高效筛选载体pMCEscan。该载体含有报告基因(k2tPA)、扩增基因(dhfr)、重组酶识别序列(FRT)及筛选基因(neo),且neo基因的表达经过系统的弱化,确保能够对基因组中的整合位点进行大规模的高效筛选。然后利用该载体转染CHO/dhfr-细胞并进行大规模筛选以获得足够多的阳性克隆,并对阳性克隆进行系统分析,筛选出报告基因表达水平高、单拷贝且扩增效果好的克隆,此克隆被认为筛选载体整合入CHO细胞基因组中转录热点(Hotspot)区域,从而获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系。随后利用位点特异性重组系统(FLP-FRT)将外源基因定点整合到Hotspot区域,以实现外源基因在CHO细胞基因组中的定点整合及高效表达。并利用该细胞系实现了k2tPA的高表达,表达量达到17.1μg/106cell.24h。该研究致力于CHO细胞基因组中高表达位点的寻找和确认,建立基于定点整合的哺乳动物细胞高效表达系统。 展开更多
关键词 CHO细胞 定点整合 高效表达 重组蛋白
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采用定点整合表达技术构建t-PA表达CHO工程细胞株 被引量:5
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作者 吴本传 陈昭烈 +3 位作者 刘红 郝振明 刘兴茂 黄培堂 《药物生物技术》 CAS CSCD 2004年第4期221-224,共4页
运用Flp InTM 定点整合表达系统构建表达组织型纤溶酶原激活剂 (tissue type plasminogenactivator ,t PA)的CHO工程细胞株。将pcDNA5 /FRT载体和携带t PA基因的 pJOD S载体用Hind/KpnI双酶切 ,再将回收的 2 .0kbt PAcDNA片段和pcDNA5 /... 运用Flp InTM 定点整合表达系统构建表达组织型纤溶酶原激活剂 (tissue type plasminogenactivator ,t PA)的CHO工程细胞株。将pcDNA5 /FRT载体和携带t PA基因的 pJOD S载体用Hind/KpnI双酶切 ,再将回收的 2 .0kbt PAcDNA片段和pcDNA5 /FRT载体连接 ,构建 pcDNA5 /FRT/t PA质粒 ;应用Flp InTM定点整合表达系统 ,将t PAcDNA定点插入Flp lnTM CHO细胞基因组中的 1个单拷贝位点上 ,以潮霉素B筛选定点整合t PAcDNA的细胞克隆。经筛选和体外纤维蛋白溶解活性检测 ,获得了t PA表达水平为 15 0 0~ 2 0 0 0IU/ (10 6cells·day)的CHO工程细胞株。 展开更多
关键词 定点整合 T-PA 表达 中国仓鼠卵巢细胞
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油菜叶绿体基因组同源重组片段的克隆及phb基因定点整合载体的构建 被引量:4
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作者 张中林 张景昱 +3 位作者 李轶女 苏宁 宋艳茹 沈桂芳 《植物生理与分子生物学学报》 CAS CSCD 2001年第3期235-242,共8页
利用叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点 ,根据烟草、水稻和玉米叶绿体基因组全序列资料 ,设计合成引物 ,PCR扩增并克隆了油菜叶绿体两个重要的功能基因rbcL和atpB(GenBank登录号分别为AF2 67640和AF2 67641) ,并以此作为定点整合... 利用叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点 ,根据烟草、水稻和玉米叶绿体基因组全序列资料 ,设计合成引物 ,PCR扩增并克隆了油菜叶绿体两个重要的功能基因rbcL和atpB(GenBank登录号分别为AF2 67640和AF2 67641) ,并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。以来自叶绿体的强启动子PpsbA和Prrn等驱动PHB合成途径中 3个关键酶基因phbA、phbB和phbC ,分别构建表达盒 ,并将它们按照其在原始菌株中的自然转录顺序phbC phbA phbB相串联 ,最后连同选择标记基因aadA表达盒一起 ,克隆到油菜叶绿体同源片段中 ,构建成phb基因定点整合载体pRCABZ和pRCABF。酶切及Southern杂交结果证明所构建的转化载体符合预期设计。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。 展开更多
关键词 phb基因 叶绿体转化 同源片段 定点整合 油菜
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菊苣质体同源片段的克隆及非抗生素标记的质体定点整合表达载体构建 被引量:3
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作者 王玉华 郝建国 贾敬芬 《草业学报》 CSCD 北大核心 2009年第6期72-81,共10页
依据烟草、玉米、拟南芥和大豆质体基因组rps7基因和16S rDNA基因的保守序列设计引物,以菊苣质体基因组DNA为模板,PCR扩增到1段4.8 kb的片段。序列分析表明,该片段全长4 751 bp(GenBank登录号为GQ199478),包括449 bp的rps7基因5′端序列... 依据烟草、玉米、拟南芥和大豆质体基因组rps7基因和16S rDNA基因的保守序列设计引物,以菊苣质体基因组DNA为模板,PCR扩增到1段4.8 kb的片段。序列分析表明,该片段全长4 751 bp(GenBank登录号为GQ199478),包括449 bp的rps7基因5′端序列、793 bp的rps12基因、72 bp的trnV基因、1 315 bp的16S rDNA基因5′端以及大部分的基因间隔区,该序列与烟草对应区段的相似性为92%,与莴苣对应区段的相似性为97%。以此片段作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建了非抗生素标记的菊苣质体定点整合表达载体pJBADH-GFP,酶切分析及PCR检测证明构建的载体符合预期设计。该载体的构建为建立高效、稳定的菊苣质体转化和无抗生素筛选体系奠定基础,为进一步通过质体基因工程手段将更多感兴趣的基因导入菊苣进行遗传改良,或以菊苣质体作生物反应器生产动物口服疫苗等搭建技术平台。 展开更多
关键词 菊苣 质体同源片段 非抗生素标记 定点整合 表达载体
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Ad/rAAV杂合体病毒介导抗HBV shRNA表达框定点整合研究 被引量:2
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作者 李绍祥 张艳霞 +4 位作者 张成平 胡学玲 李娟 姚鹏 胡大荣 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第21期3254-3256,3262,共4页
目的探讨解决RNA干扰(RNA interference,RNAi)抗HBV作用时间短暂的问题。方法构建腺病毒/重组腺相关病毒(Adenovirus/recombinant adenovirus associated virus,Ad/rAAV)杂合体病毒,恢复rAAV的定点整合,并借助定点整合的rAAV持续表达shR... 目的探讨解决RNA干扰(RNA interference,RNAi)抗HBV作用时间短暂的问题。方法构建腺病毒/重组腺相关病毒(Adenovirus/recombinant adenovirus associated virus,Ad/rAAV)杂合体病毒,恢复rAAV的定点整合,并借助定点整合的rAAV持续表达shRNA(short hepair RNA),实现RNAi抗HBV的持久性。结果 Ad/rAAV杂合体病毒感染靶细胞后,Rep基因可以在HBV感染细胞中表达,hU6shRNA表达框可以定点整合于细胞基因组AAVS1(adeno-associated virus integration site,腺相关病毒整合位点)中。结论利用Ad、AAV和HBV各种元件构建Ad/rAAV杂合体病毒,作为抗HBV的shRNA表达框的载体,为解决RNAi抗HBV作用时间短暂的问题作了一些技术上的探索。 展开更多
关键词 RNA干扰 Ad/rAAV杂合体病毒 定点整合
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ZFN,TALEN和CRISPR/Cas9在小鼠Rosa26基因定点整合外源基因的效率比较 被引量:1
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作者 刘小凤 刘蔚 +4 位作者 聂宇 丛佩清 刘小红 陈瑶生 何祖勇 《中山大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期137-144,共8页
哺乳动物黑色素的合成依赖于酪氨酸的氧化作用,而酪氨酸酶(Tyr)是催化酪氨酸氧化反应的关键酶,当外源Tyr基因整合进白毛色小鼠基因组中,会使它获得黑色素合成的能力,表现出与原来不同的毛色表型。为方便、快捷地获得Tyr基因整合的小鼠,... 哺乳动物黑色素的合成依赖于酪氨酸的氧化作用,而酪氨酸酶(Tyr)是催化酪氨酸氧化反应的关键酶,当外源Tyr基因整合进白毛色小鼠基因组中,会使它获得黑色素合成的能力,表现出与原来不同的毛色表型。为方便、快捷地获得Tyr基因整合的小鼠,构建了一个无启动子的pTyr-2A-DsRed同源重组质粒供体,选择Rosa26的第一个内含子作为外源基因整合的靶位点,设计了切割位点几乎一致的ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统。通过流式对比分析C 2C 12细胞中红色荧光蛋白DsRed的表达水平,比较了3种基因组编辑工具介导的外源基因定点整合效率,结果发现CRISPR/Cas9的效率最高,在此基础上,利用CRISPR/Cas9将供体整合到小鼠胚胎干细胞中,筛选单细胞克隆进行囊胚腔注射和胚胎移植,获得一只存活的嵌合体小鼠,表现出白毛中夹杂黑毛的表型,表明整合到小鼠Rosa26的Tyr基因可以正常表达。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 TALEN ZFN Rosa26 定点整合
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用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体的研究 被引量:1
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作者 李建民 陈薇 +4 位作者 贾秀杰 安小平 李冰 樊英茹 童贻刚 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期312-315,318,共5页
目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体。方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI neo的MCS中,构建表达载体pCI FRT-HBsAg。以... 目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体。方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI neo的MCS中,构建表达载体pCI FRT-HBsAg。以此载体转染CHO/dhfr-细胞,用1g/L的G418筛选抗性克隆。检测抗性克隆HBsAg的表达,筛选表达量高的克隆作为宿主细胞株,命名为CHO/dhfr-FRT+。将表达质粒pA FRTHFLF和pOG44以1∶9的质量比混合,取2μg转染CHO/dhfr-FRT+。转染48h后,换选择培养基(撤掉H、T)用96孔板进行克隆化,2wk后对长成的单克隆进行检测。筛选正确整合到CHO/dhfr-FRT+细胞中FRT位点的克隆,并不断提高MTX的浓度,进一步筛选表达量更高的克隆。在MTX的浓度为2×10-7mol/L时,获得稳定表达细胞株,其最后的表达量为5mg/L。对此细胞株扩大培养后,收集上清并纯化,以纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE及Westernblot和抗原结合活性的检测。结果:构建了高转录活性位点整合FRT序列的CHO/dhfr-细胞株,并在此细胞株中表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,表达量为5mg/L。结论:构建了含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,为用此系统表达抗体分子和其他蛋白分子奠定了基础? 展开更多
关键词 定点整合 FRT CHO/dhfr^-细胞 基孔肯亚病毒 嵌合抗体
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PCR对ES细胞定点整合重组子的鉴定 被引量:1
14
作者 薛友纺 刘晓冬 吴鹤龄 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 1994年第2期118-124,共7页
PCR(polymerasechainreaction)是一种对ES(embryonicstem)细胞定点整合重组子进行鉴定的有效方法。由于在定点整合重组子和非定点整合重组子中外源导入基因与基因组DNA分子整合的方式... PCR(polymerasechainreaction)是一种对ES(embryonicstem)细胞定点整合重组子进行鉴定的有效方法。由于在定点整合重组子和非定点整合重组子中外源导入基因与基因组DNA分子整合的方式各不相同。因此,非重组子、定点整合重组子和非定点整合重组子的基因组DNA分子结构也将各不相同。当我们设计合适的引物,从PCR扩增结果中即可分析、鉴别出定点整合重组子、非定点整合重组子、或非重组子。本文采用PCR方法,根据pRV4.0质粒转化ES细胞(雄性小鼠CCE株系)后的不同类型转化子细胞基因组DNA分子的特点,设计了两对不同的引物,分别对转化细胞经抗G418,6TG初步筛选的克隆进行了分析,从中快速、简便、特异性极强地得到了定点整合重组子。我们还用soutbern杂交验证了这种方法的准确性。 展开更多
关键词 PCR 鉴定 ES细胞 定点整合 重组子
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基因定点整合改良家畜的现状与展望 被引量:1
15
作者 李宁 吴常信 《中国畜牧杂志》 CAS 北大核心 1992年第6期53-55,共3页
尽管转基因技术在80年代初就已应用于实验动物,但用于改良家畜品种的尝试还只是在1985年以后。至今,已有16种基因转入三种主要畜种(猪、牛、羊),并取得了一些鼓舞人心的成就。例如,转有生长激素基因的猪,在饲料配方中适当提高蛋白质含量... 尽管转基因技术在80年代初就已应用于实验动物,但用于改良家畜品种的尝试还只是在1985年以后。至今,已有16种基因转入三种主要畜种(猪、牛、羊),并取得了一些鼓舞人心的成就。例如,转有生长激素基因的猪,在饲料配方中适当提高蛋白质含量后,可使生长速度提高18%,背膘厚度减少一半左右。又如转基因羊的羊毛质量有了明显的改进,特别是以羊作为生物反应器,已经能够生产出药用价值很高的外源蛋白,并开始商业化生产。但是转基因家畜却难以形成品种或品系,这不仅是因为转基因的表达能引起多种副作用,如不育、畸形、易感病。 展开更多
关键词 家畜 改良 基因定点整合
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人TPO基因定点整合荷斯坦牛αs1-酪蛋白基因打靶载体构建
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作者 刘庆友 李海涛 +1 位作者 崔奎青 石德顺 《广西农业生物科学》 CAS CSCD 2008年第2期93-98,114,共7页
应用LA-PCR的方法,从荷斯坦牛基因组中成功地扩增获得6.0 kb和1.78 kb两个基因片段,其中6.0 kb包括αs1-酪蛋白基因5′调控序列到第三内含子部分,1.78 kb包括αs1-酪蛋白基因第十二内含子到第十四内含子之间序列,作为打靶载体的同源臂;... 应用LA-PCR的方法,从荷斯坦牛基因组中成功地扩增获得6.0 kb和1.78 kb两个基因片段,其中6.0 kb包括αs1-酪蛋白基因5′调控序列到第三内含子部分,1.78 kb包括αs1-酪蛋白基因第十二内含子到第十四内含子之间序列,作为打靶载体的同源臂;从新生儿血液基因组中扩增获得5.5 kb的血小板生成素(thrombopoietin,TPO)基因组序列,包括第一内含子部分序列到3′终止子后的序列。以水牛β-酪蛋白基因的5′调控区4.4 kb片段为启动子,以pLoxp质粒为打靶载体骨架,加上同源臂片段和目的基因TPO的片段,经多步酶切-连接-转化-筛选-鉴定基因重组过程,最终建成长达25 kb的人TPO基因定点整合荷斯坦牛αs1-酪蛋白基因打靶载体,PCR和酶切分析表明载体构建正确,为研制定点整合荷斯坦牛乳腺生物反应器奠定了基础。 展开更多
关键词 血小板生成素 定点整合 αs1-酪蛋白载体
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菊苣叶绿体同源片段的克隆及多顺反子定点整合表达载体的构建
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作者 王玉华 韩晓玲 +1 位作者 黄丛林 贾敬芬 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2010年第1期11-17,共7页
利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计合成引物,从菊苣叶绿体基因组中扩增包括rps7-rps12-trnV-16S rDNA基因在内的一段序列(GenBank登录号为GQ199478),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。以... 利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计合成引物,从菊苣叶绿体基因组中扩增包括rps7-rps12-trnV-16S rDNA基因在内的一段序列(GenBank登录号为GQ199478),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。以叶绿体基因强启动子prrn驱动选择标记基因aadA及报告基因gfp构建多顺反子表达盒prrn-aadA-gfp-psbA-3,′然后将表达盒克隆进菊苣叶绿体同源片段中,获得菊苣叶绿体定点整合表达载体pJAG,酶切分析证明所构建的载体符合预期设计。该载体的构建为建立菊苣的叶绿体转化体系奠定基础,为进一步通过叶绿体基因工程手段将更多感兴趣的基因导入菊苣进行遗传改良,或以菊苣叶绿体作生物反应器生产动物口服疫苗等搭建技术平台。 展开更多
关键词 菊苣 叶绿体同源片段 多顺反子 定点整合表达载体
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NPTⅡ基因在满江红鱼腥藻染色体DNAglnA位点的定点整合及对泌氨和细胞形态结构的影响
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作者 吴晓强 施定基 +5 位作者 刘祥林 汪洪杰 邱泽生 张承谦 印莉萍 赵微平 《首都师范大学学报(自然科学版)》 1993年第4期27-33,共7页
本研究构建了含glnA基因片段和TPTⅡ基因的单交换整合型重组质粒pGN1-4,并通过电激法,三亲接合转移和二亲接合转移法号入到满江红鱼腥藻细胞中。用蓝细菌原位杂交法筛选出转化细胞菌落。再经Southern杂交方法进一步证实了转化结果。化... 本研究构建了含glnA基因片段和TPTⅡ基因的单交换整合型重组质粒pGN1-4,并通过电激法,三亲接合转移和二亲接合转移法号入到满江红鱼腥藻细胞中。用蓝细菌原位杂交法筛选出转化细胞菌落。再经Southern杂交方法进一步证实了转化结果。化学测氨法表明,培养后7~14d泌氨达到高峰,转化细胞泌氨比对照高40%。光镜观察表明,转化细胞藻丝变短,易断成单个细胞,异形胞频率降低;扫描电镜观察指出,转化细胞外壁有鳞片状鞘层,而对照较光滑。 展开更多
关键词 满江红鱼腥藻 NPTII基因 glnA 定点整合 泌氨 细胞形态结构
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FLP介导的酿酒酵母rDNA多拷贝定点整合
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作者 潘辉 邬向东 +1 位作者 袁汉英 李育阳 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 1999年第11期11-16,共6页
构建了一个带有FRT位点以及启动子缺陷的URA3d 选择标记的环状质粒,并通过位点特异性重组将其整合到酵母染色体rDNA中放置的一个FRT位点上。Southern杂交分析表明若处于很强的选择压力下,该质粒的拷贝数会发... 构建了一个带有FRT位点以及启动子缺陷的URA3d 选择标记的环状质粒,并通过位点特异性重组将其整合到酵母染色体rDNA中放置的一个FRT位点上。Southern杂交分析表明若处于很强的选择压力下,该质粒的拷贝数会发生有效的扩增。为了证明该质粒能够作为表达载体, 将乙肝融合表面抗原SA-28基因的表达单元插入该质粒后整合到rDNA位点。与rDNA位点整合了单个表达单元的菌株相比,SA-28蛋白的表达量提高了30~60倍。 展开更多
关键词 酿酒酵母 FLP重组酶 定点整合 染色体rDNA
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小麦叶绿体基因组定点整合表达载体的构建 被引量:4
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作者 高岭 李朔 +3 位作者 侯丙凯 夏光敏 胡赞民 赵启韬 《植物生理与分子生物学学报》 CAS CSCD 2003年第5期469-473,共5页
从小麦中分别克隆了包括rbcL基因 3′端部分和完整的 psaI、ycf4基因的DNA片段。利用克隆到的DNA片段作为同源重组片段、烟草叶绿体 16SrRNA基因的启动子Prrn和PsbA基因的终止子PsbA3′控制筛选标记基因aadA和报告基因gfp的转录 ,构建... 从小麦中分别克隆了包括rbcL基因 3′端部分和完整的 psaI、ycf4基因的DNA片段。利用克隆到的DNA片段作为同源重组片段、烟草叶绿体 16SrRNA基因的启动子Prrn和PsbA基因的终止子PsbA3′控制筛选标记基因aadA和报告基因gfp的转录 ,构建了小麦叶绿体基因组定点整合表达载体pRAGY。用该载体转化大肠杆菌 ,在激光扫描共聚焦显微镜下 ,检测到了gfp基因成功表达的产物被激发出的强烈的绿色荧光。 展开更多
关键词 小麦 叶绿体基因组 表达载体构建 GFP基因 定点整合
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