帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。

鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。

3种苹果病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立

苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)对果树的生长发育危害严重,而且复合侵染几率较高,为快速、灵敏和高效的检测3种病毒,本研究根据ASPV、ASGV和ApNMV基因组保守序列设计特异引物建立了3种病毒高灵敏度的实时荧光定量PCR检测体系(Real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)。结果表明:引物ASGV-qF/qR-1、ASPV-qF/R-2和ApNMV-qF/R-3有较高的特异性,最适宜的退火温度分别为60℃、58℃和58℃,ASGV、ASPV和ApNMV 3种病毒的RT-qPCR体系比常规RT-2 PCR检测体系灵敏度高100倍,最低检出限分别为82.6、1.49×10^(2)和13.3 copies/μL。检测体系的Ct值的变异系数均小于5%,组间的变异系数在5%以内。河北农业大学果园中经RT-PCR确定带毒的88棵苹果树RT-qPCR检出率为100%,表明建立的RT-qPCR方法的可靠性和稳定性高,适用于田间果树3种病毒的检测,为苹果病毒的准确诊断提供了技术支撑。

实时荧光定量RT-PCR在麻疹和风疹病毒检测中的应用

目的探讨实时荧光定量RT-PCR在麻疹和风疹病毒检测中的应用效果。方法选取2021年12月—2022年12月盘锦市疾病预防控制中心接收的麻疹与风疹患者76例为研究对象,入院后所有研究对象均接受酶联免疫吸附试验法和实时荧光定量RT-PCR法检测,以检测患者恢复期血免疫球蛋白G(IgG)抗体水平(相对急性期是否4倍升高)为麻疹诊断金标准,对比两种检测方法的检测准确率、不同检测时间的阳性检出率。结果实时荧光定量RT-PCR法总诊断准确率为97.37%;酶联免疫吸附试验法中总诊断准确率为88.16%,比较两种方法的诊断准确率差异有统计学意义(P<0.05)。第1d,实时荧光定量RT-PCR法阳性检出率高于酶联免疫吸附试验法,差异有统计学意义(P<0.05)。第5d,实时荧光定量RT-PCR法阳性检出率低于酶联免疫吸附试验法,差异有统计学意义(P<0.05)。第2d、第3d、第4d实时荧光定量RT-PCR法和酶联免疫吸附试验法阳性检出率对比差异无统计学意义(P>0.05)。结论实时荧光定量RT-PCR对麻疹、风疹检测有一定诊断作用,可以有效提高检测准确率,同时操作简单,灵敏性较高,值得在麻疹与风疹病毒检测中推广。

结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测对菌阴空洞肺结核的诊断效能分析

目的探讨结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(Xpert)检测对菌阴空洞肺结核的诊断效能。方法选取河北省胸科医院2021年4月至2022年10月期间行手术治疗的124例肺部空洞疾病患者相关病历资料,其中菌阴空洞肺结核86例(观察组),非结核肺部空洞疾病38例(对照组)。收集患者手术标本Xpert检测和外周血结核感染T细胞斑点(T-SPOT)试验结果,分析二者对菌阴空洞肺结核的诊断效能。结果Xpert检测和T-SPOT试验诊断菌阴空洞肺结核的敏感度为68.6%、75.6%,特异度为97.4%、68.4%。Xpert检测的敏感度低于T-SPOT试验(χ^(2)=5.832,P<0.001),特异度高于T-SPOT试验(χ^(2)=21.469,P<0.001)。2种方法在观察组中的阳性检出率均高于对照组[Xpert检测:68.6%(59/86)比2.6%(1/38);T-SPOT试验:75.6%(65/86)比31.6%(12/38)](均P<0.001)。受试者工作特征曲线分析结果显示,Xpert检测诊断菌阴空洞肺结核的曲线下面积为0.830,T-SPOT试验的曲线下面积为0.729,Xpert检测的准确度高于T-SPOT试验(P<0.001)。结论Xpert检测对菌阴空洞肺结核有比较可靠的诊断效能。

柑桔衰退病毒RB和VT基因型实时定量PCR检测方法建立和应用

为定量检测样品中柑桔衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)RB和VT基因型含量,以RB基因型的p33基因、VT基因型的ORF1a基因为靶标,建立了RB和VT基因型的特异性实时定量PCR方法。该方法检测RB和VT基因型质粒浓度下限均为2×10^(1) copies/μL,灵敏度为普通PCR的1000倍;对RB和VT基因型进行检测,质粒拷贝数对数(x)与Ct值(y)的标准曲线方程分别为y=-3.3255 x+37.8453和y=-3.2737 x+36.2839,R^(2)分别为0.9991和0.9954,扩增效率分别为99.85%和102.05%;方法的重复性良好,组内和组间Ct值变异系数均小于2.07%。对田间样品检测发现,不同样品之间RB基因型含量差异和VT基因型含量差异均较大。该方法特异性强,灵敏度高,适用于田间样品检测。

应用实时荧光定量TaqManRT-PCR检测口蹄疫病毒

按照口蹄疫病毒 (FMDV )聚合酶 3D基因序列 ,设计合成了引物和探针 ,经各反应条件的优化 ,建立了实时荧光定量 RT- PCR技术 ,对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液中的 FMDV进行了特异性检测和敏感性试验。结果 ,用 30 0 nmol/ L 的引物浓度和 2 0 0 nmol/ L 探针浓度 ,获得的 CT值较小 ,而 ΔRn最大 ;可检测到相当于 0 .1 TCID50 的病毒 RNA;与 VSV和其他水泡性病毒不发生交叉反应 ;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系 ,且线性范围宽 ,相关系数为 0 .984 ;组内和组间试验重复性的变异系数 (CV)分别为 5 .4 %和 6 .7% ;与常规 RT- PCR相比较 ,该方法具有快速、特异、敏感、可定量 。

鸡γ-干扰素实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测鸡γ干扰素的实时荧光定量RT-PCR方法,采用RT-PCR方法从ConA诱导活化的鸡脾淋巴细胞的总RNA中扩增得到鸡γ干扰素（ChIFN-γ）和鸡的28 S rRNA（Ch28 S）基因,将其分别克隆至体外转录载体后经体外转录获得了ChIFN-γ和Ch28 S的RNA,采用各自的特异性引物及Taqman探针,以Ch28 S RNA作为内参进行一步法实时荧光定量RT-PCR,检测ChIFN-γ.结果表明：ChIFN-γ和内参Ch28 S的Ct值与标准品稀释梯度在1×102～1×107拷贝/μL范围分别呈良好的线性关系,γ2均大于0.99.此方法用于检测ChIFN-γ,具有简便、高效、敏感、特异的特点.

褐色橘蚜中柑橘衰退病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法,测定褐色橘蚜(Toxoptera citricida)中柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含量。【方法】根据CTV CP25保守序列,设计特异性引物HD-F/R,通过优化得到最佳反应条件建立橘蚜中CTV实时荧光定量RT-PCR,并进行灵敏性、重复性检验,评价该方法的可行性。应用该方法测定单头橘蚜中CTV含量。【结果】该实时荧光定量RT-PCR方法最低检测限为9.0拷贝/μL,其灵敏度是常规RT-PCR的100倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关性系数为0.998,扩增效率达104.7%。批内和批间变异系数均小于3.24%,表明该方法重现性好。获毒24 h单头橘蚜中CTV最低含量为2.5×103拷贝,最高含量为1.24×106拷贝。【结论】本研究建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法能够准确检测褐色橘蚜中的CTV,可用于研究褐色橘蚜-CTV-寄主互作关系及CTV的流行。

H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

H7亚型禽流感病毒致病性强、危害性大,是进出口家禽及禽类产品的主要检疫对象。为了加强对H7亚型禽流感病毒的检测,建立新的快速检测方法。通过对GenBank已报道的H7亚型禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了两套分别针对H7N2亚型和H7Nx亚型的特异性引物和用FAM标记的Taq Man MGB核酸探针,建立了H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR方法(Real-time RT-PCR)。该方法特异性好,不存在假阴性和假阳性的现象;敏感性高,对禽流感病毒H7亚型标准HI抗原检测的敏感性达到10-5,能够满足口岸禽流感病毒快速、准确、有效的检疫需求。

实时荧光定量RT-PCR检测肝癌组织中miR-122a及miR-224的表达

目的运用实时荧光定量RT-PCR方法分析miR-122与miR-224两种miRNAs在原发性肝细胞癌(HCC)中的表达,探讨以miRNAs为靶点在早期肝癌中的临床诊断意义。方法采用基于2(-△△CT)的实时荧光定量RT-PCR法对35例肝癌组织及癌旁组织的miR-122a及miR-224进行了定量分析,结果经由Northernblot验证。结果与正常组织相比,在所有的被检肝癌组织中,均发现了miR-122a有不同程度的表达下调(P<0.01),而上述肝癌组织中的miR-224的定量结果显示该miRNA表达显著增加(P<0.001)。结论HCC组织中存在上述两种miRNAs表达水平的改变,实时荧光定量RT-PCR法为早期、准确的在临床上检测肝组织癌变提供了新的思路。

新型鸭呼肠孤病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的NDRV S3基因保守序列设计特异性引物,建立了一种检测NDRV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.9996,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。对番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭新城疫病毒和禽流感病毒均未检测到荧光信号。对NDRV的最小检出量为29拷贝/μL,比普通PCR敏感性高100倍。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。

实时定量RT-PCR检测TCRVγ亚家族基因表达水平

目的：建立SYBRGreenI实时定量检测TCRVγ亚家族T细胞表达水平的比较Ct法。方法：利用倍比稀释的成人正常胸腺组织cDNA建立TCRVγⅠ—VγⅢ和B2微球蛋白基因（B2M）基因的相对标准曲线，实验证实靶基因（VγⅠ～VγⅢ）分别和看家基因（152M）的扩增效率-致，可采用比较ct法对TCRVγI—VγⅢ的表达进行相对定量，并运用该方法检测20例健康成人外周血TCRVγI—VγⅢ的表达水平。结果：成人外周血TCRVγⅡ的表达量最高，TCRVγ1次之，TCRVγⅢ的表达量最低，三者比较有统计学意义（P〈0．05）。结论：本研究率先建立了利用SYBRGreenI实时荧光定量RT—PCR检测人TCRV7基因mRNA表达水平比较Ct法，并在国内首先提供了健康成人外周血TCRVγ基因各亚家族mRNA表达水平的资料。

SARS冠状病毒实时荧光RT-PCR定量检测

为建立一种快速、准确、特异的SARS病毒RNA定量检测方法 ,根据复合探针荧光定量分析原理 ,对SARS病毒核酸进行实时荧光定量RT PCR检测 .借助计算机辅助 ,对SARS病毒基因靶序列以及检测引物和探针进行了优化筛选 ;利用体外转录SARS病毒RNA靶序列 ,对RT PCR反应的镁离子浓度参数进行了优化 ;比较Trizol法、磁珠法、Qiagen法、煮沸法等 4种方法提取RNA的检测效果 ,建立了样本处理方法 ;通过对构建的体外转录靶序列模型的检测 ,对本方法的灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评价 ,并通过对4 2例临床标本的检测对本方法的检测效果进行了评估 .通过克隆SARS病毒核酸靶序列并进行体外转录 ,获得了长度约 1 2kb的体外转录RNA靶序列 ;经优化 ,荧光RT PCR反应液中的Mg2 + 浓度以 4 0mmol/L为最好 ;RNA提取方法采用磁珠法效果较好 ;本方法的检测灵敏度最低可达 5个拷贝的体外转录RNA分子 ,特异性10 0 % ,Ct 值的CV值小于 5 % .对临床确诊的 4 2份SARS病人血清和漱口水标本的检测结果表明 ,该方法的检出率为 79% ,与荧光抗体检测法的符合率为 70 % .上述结果表明 ,该方法建立的荧光定量RT PCR技术能够快速准确、特异、敏感地对SARS病毒核酸进行定量分析 ,为临床SARS冠状病毒RNA的检测提供了新的 。

实时定量RT-PCR检测马动脉炎病毒

选取马动脉炎病毒 (EAV )基因组中高度保守的开放阅读框 7(ORF7)序列 ,设计了特异性引物和 Taq Man探针 ,利用一步法的实时定量 RT- PCR来定量检测 EAV。使用含有选定检测序列的克隆标准品做标准曲线 ,证明该方法可以检测出含有 5 (4.77)个 RNA分子 ,即可从组织培养液 (TCF)中检出一般含有 5 PFU/μL 病毒拷贝。对猪生殖呼吸道综合征病毒、马疱疹病毒无交叉反应 ,特异性好。用疫苗用种毒 (Bucyrus标准株 )肌肉注射于马驹后 ,定量 RT- PCR比病毒分离试验更能灵敏地检出呼吸道排出的病毒。对 4 5 6份临床鼻腔分泌物样品检测 ,定量 RT- PCR检出 6份阳性 ,而病毒分离只检出 2份阳性。一步法实时定量 RT- PCR检测样品中的 EAV,在快捷、准确、方便和高通量方面优于细胞培养病毒分离的检测方法 ,可以作为检测马病毒性动脉炎 (EVA )

实时荧光定量RT-PCR法快速定量检测果蔬中星状病毒

目的:针对不同果蔬表面建立星状病毒富集与RNA提取方法,结合已报道的实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)引物和探针,实现果蔬中星状病毒的高灵敏快速定量检测。方法:利用10倍梯度稀释的星状病毒c RNA分子检测Ct值及其对应的初始浓度,构建标准曲线,为星状病毒的定量检测提供参考。将ISO/TS 15216-2:2013针对果蔬中诺如病毒和甲肝病毒RNA的提取方法用于星状病毒的检测,利用人工感染的大白菜和草莓样品,分析病毒回收率、灵敏度及检测重复性。最终通过60份果蔬样品的检测验证该方法的实用性。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR方法扩增效率达95.9%,检测低限为5.6拷贝/反应。人工感染的大白菜样品中病毒回收率在0.94%~9.63%之间,而人工感染草莓样品中病毒回收率最高达1.03%。对同一感染浓度的样品在不同时间的检测结果变异系数均小于2%。最终检出1份来自北京农贸市场的草莓样品为星状病毒阳性,检测阳性率达1.67%。结论:建立的果蔬中星状病毒荧光RT-PCR定量检测方法快速、高效、灵敏,在食源性病毒的日常筛查和风险评估工作中具有重要的应用价值。

牛病毒性腹泻病毒SYBR Green I实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

[目的]在建立一种快速定量的用于检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的实时荧光定量RT-PCR检测方法.[方法]根据GenBank公布的BVDV 5′端非编码区（5′ UTR）核苷酸序列,软件分析后设计特异性扩增引物,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法.[结果]建立的方法只能检测到BVDV,而与猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒及牛冠状病毒没有交叉反应,具有高度的特异性;在102～108copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.998,最低可检测下限可达到102 copies/μL,具有灵敏度高的特点;不同情况下3次重复实验,变异系数均小于1.5％,具有重复性好的特点.[结果]成功建立了一种用于检测BVDV的实时荧光定量RT-PCR技术,并可用于临床样品的检测,适用于BVDV的快速诊断和流行病学调查.

实时荧光定量RT-PCR检测急性白血病患者骨髓HB-1的表达

目的:探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)患者骨髓细胞HB-1基因的表达水平以及HB-1基因在监测ALL微小残留病(MRD)方面的意义。方法:建立实时荧光定量RT-PCR方法(Taqman探针),检测HB-1基因的表达水平,并对其灵敏度、特异性和重复性进行检测。应用此方法检测了急性淋巴细胞白血病183例次,急性髓系白血病(AML)70例,血液系统非恶性疾病52例和造血干细胞健康供者24例的骨髓细胞HB-1基因的表达水平,并分析33例急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患者HB-1基因的表达水平与疾病诊断、复发的相关性。结果:构建的实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平,批间变异系数为6.79%,批内变异系数为4.80%。检测到HB-1基因特异性表达于B-ALL细胞:初发/复发B-ALL中HB-1基因表达的中位水平明显高于ALL完全缓解组、初发T-ALL、初发AML、血液系统非恶性病及健康骨髓供者(33.0%vs 0.68%、0.07%、0.02%、0.58%、0,P<0.01),而初发TALL、初发AM L、血液系统非恶性疾病和健康供者HB-1基因的表达水平无统计学差异(P>0.05)。B-ALL患者血液学缓解时HB-1基因水平明显下降至0.68%(0-7.99%),疾病复发时HB-1表达水平再次升高(共3例,HB-1分别为7.69%、8.08%和484.0%),其检测结果与流式细胞学检测结果变化一致。结论:HB-1基因特异性表达于B-ALL细胞,所建立的实时荧光定量RT-PCR法在检测骨髓细胞HB-1基因的表达水平方面具有很好的灵敏度、特异性和重复性。HB-1基因可作为B-ALL患者的临床检测、监测MRD和早期预测复发的分子学标志。

牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）5′端非编码区核苷酸序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BVDV的实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法只能检测到BVDV,而与CSFV、BRV、MT及IBRV没有交叉反应,具有高度的特异性,在1010~102模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.991,最低可检测到100个拷贝的阳性质粒。所建立的BVDV实时荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、灵敏等特点。