肝靶向穿膜肽与家蝇天蚕素基因的融合及其分子特征分析

本研究利用改进SOE-PCR技术构建肝靶向穿膜肽(HTPP)与家蝇天蚕素(MDC)融合基因并对其分子特征进行了预测和分析。结果表明:成功融合了HTPP与MDC,并构建了HTPP-MDC融合基因的克隆重组质粒HTPP-MDC/pMD20-T。PCR和KpnⅠ/HindⅢ双酶切结果显示获得与预期大小一致的基因片段,测序结果显示获得的基因序列没有发生突变,与预期完全一致。分子特征分析表明,该融合基因编码60个氨基酸,分子量为6516.2Da,理论等电点为9.31,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成。研究结果为HTPP-MDC后续的功能研究奠定了基础,同时也为应用SOE-PCR技术构建融合基因提供了有益借鉴。

家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白的生物信息学分析

目的利用生物信息学方法分析家蝇天蚕素-人溶菌酶融合基因推导的氨基酸序列。方法用ProtParam Tool、CDD、ProtScal、sopma等软件对其理化性质、疏水性/亲水性、信号肽、功能结构域及蛋白质二级结构等重要参数进行预测。结果家蝇天蚕素-人溶菌酶由187个氨基酸组成,预测相对分子质量为20 131.7,理论等电点(pI)为9.69,分子式为C862H1375N277O260S11;半衰期预测结果显示其利于基因工程表达。融合蛋白的氨基酸序列含有天蚕素家族和溶菌酶家族二者的保守结构域,二级结构主要由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成。结论分析结果为家蝇天蚕素-人溶菌酶融合基因的原核表达及表达产物的生物学功能研究奠定了基础。

新型抗菌蛋白天蚕素-人溶菌酶在大肠杆菌中的表达条件优化及纯化

目的探讨重组家蝇天蚕素-人溶菌酶(Mdc-hly)在大肠杆菌中的表达条件及纯化。方法利用SDS-PAGE电泳和BandScan凝胶电泳图像分析系统研究诱导温度、诱导时机、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度和诱导时间对融合蛋白表达的影响。融合蛋白经His琼脂糖柱亲和色谱纯化后,Western blot鉴定。结果在起始菌浓度为A600=0.6时加入浓度为1.0 mmol/L的IPTG,37℃诱导6 h,融合蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的39.1%。纯化后融合蛋白纯度可达95%,Western blot鉴定为目的蛋白。结论确定了重组融合蛋白的最佳表达条件,并纯化了目的蛋白。

新型融合多肽HTPP-MDC体外抑制HBV复制活性及亚细胞定位

目的:研究肝细胞靶向穿膜肽-家蝇天蚕素(HTPP-MDC)融合多肽体外对乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用及其在肝细胞中的定位。方法:不同浓度HTPP-MDC分别与HepG2.2.15细胞和Chang liver细胞共培养,用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测药物对细胞的毒性作用,应用ELISA和实时荧光定量PCR技术定量研究HTPP-MDC对HepG2.2.15细胞系分泌HBsAg、HBeAg及HBV DNA复制的影响。应用激光共聚焦技术研究HTPP-MDC在肝细胞中的定位。结果:HTPP-MDC在体外能有效抑制HepG2.2.15细胞系分泌HBsAg和HBeAg,对HBVDNA的复制亦有显著抑制作用。激光共聚焦显微镜观察显示HTPP-MDC进入细胞内部。结论:HTPP-MDC在体外对HBV复制有较强的抑制作用,并能快速透过细胞膜进入细胞内,有望用于临床治疗慢性乙型肝炎相关疾病。

融合基因Mdc-hly的构建及原核表达

构建家蝇天蚕素-人溶菌酶(Mdc-hly)融合基因,实现Mdc-hly基因在大肠杆菌中的表达。通过RT-PCR分别扩增出家蝇天蚕素和人溶菌酶的成熟肽基因序列,再利用Gene-SOEing技术构建融合基因,将融合基因克隆至pET32a表达载体,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导得到高效表达,融合蛋白分子量约为38kD。Western blotting杂交证实了表达蛋白的抗原活性。成功构建了融合其因并进行了原核表达,为进一步的生物活性研究打下基础。

HTPP-MDC原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

通过双酶切、连接、转化等方法将肝靶向穿膜肽-家蝇天蚕素(HTPP-MDC)融合基因克隆至原核表达载体pET32a(+)上,构建重组表达质粒HTPP-MDC/pET32a。重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后,以IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明重组融合蛋白得到了可溶性表达,Western blot杂交证实了表达蛋白的抗原活性。为HTPP-MDC的生物学活性研究及产业化开发奠定了基础。

基于Musca domestica cecropin的抗肿瘤小分子衍生肽筛选及构效关系解析

目的:分析家蝇抗菌肽(Musca domestica cecropin,Mdc)的结构,并对其衍生肽的抗肿瘤活性进行筛选,以期找到高效、经济的抗肿瘤候选小分子肽。方法:采用生物信息学相关软件对抗菌肽Mdc的理化性质和二级结构等进行分析;MTT法测定小分子衍生肽对10种不同肿瘤细胞株的抑制作用,并测定Mdc和衍生肽对正常细胞的毒性作用;溶血实验检测Mdc和衍生肽的溶血性。结果:在抗菌肽Mdc结构分析的基础上,设计了5种衍生肽M1-6、M1-7、M1-8、M9-21、M27-39;MTT结果显示5种衍生肽对特定肿瘤细胞株具有不同程度的抑制作用,但对正常细胞无明显细胞毒性;并且5种衍生肽在一定浓度范围内无溶血现象。结论:成功筛选出了具有相应抗肿瘤活性的小分子肽,其中M27-39、M1-8和M1-7有望成为有前途的抗肿瘤候选小分子肽。