宽体金线蛭体成分研究进展

宽体金线蛭是我国传统中药材,具有通经、消肿等功效,广泛应用于传统中医药和现代医药学等方面,许多学者对其化学成分开展深入研究,目前已报道了多种蛋白多肽类、蝶啶类、脂质类等具有抗凝血、抗血栓等生物活性的化合物。本文对宽体金线蛭体成分相关研究成果进行综述,以期为今后相关基础研究和药用资源开发利用提供参考。

甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对宽体金线蛭的急性毒性研究

宽体金线蛭是中药市场上常见药物原料,人工养殖已成为其主要供应渠道,并且是目前我国养殖规模最大的水蛭种类。甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)是一种阿维菌素类有机化合物,在水果、蔬菜等种植中应用广泛,在稻田生态系统中也有较广泛的使用,但其对水蛭的毒性尚未知。本研究通过甲维盐对宽体金线蛭的急性毒性实验,评估其对野生或养殖水蛭的影响。结果表明,甲维盐对宽体金线蛭高毒,96 h LC50为0.192 mg•L^(–1);农药制剂1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐乳油(EC)对宽体金线蛭为低毒级农药,96 h LC50为19.22 mg•L^(–1)。中毒宽体金线蛭身体肿胀、结节,肠道大量积液;损伤主要集中在肌肉、肠道和肾管部分。甲维盐中毒水蛭肠道中的紧密连接蛋白ZO-1、水通道蛋白AQP2、AQP3、AQP4、AQP5和AQP6的转录水平均显著降低(P<0.05),而白细胞介素IL-16、肿瘤坏死因子TNF-α转录水平均显著上升(P<0.05),提示其对宽体金线蛭肠道的毒性机制包括影响了水蛭的肠道通透性,并诱导肠道炎症的发生。研究结果可为水蛭的资源养护以及健康养殖提供科学依据,在实际生产中使用甲氨基阿维菌素苯甲酸盐类农药时,建议选用低剂量农药制剂、更安全的剂型如微乳剂、于稻田无水时施药,降低用药对自然环境以及水蛭等物种的影响。

5个宽体金线蛭种群遗传多样性和遗传分化的SNP分析

为了解宽体金线蛭(Whitmania pigra)群体的遗传特征,本研究使用单核苷酸多态性标记法对5个地点的宽体金钱蛭(W.pigra)群体(江西抚州AH、安徽太和TH、江西南昌JX、山东微山WSH、山东济南JN)进行遗传多样性和群体遗传结构分析。种群结构分析和主成分分析表明5个宽体金钱蛭种群可追溯至3个不同的种群来源。系统发育树分析结果显示AH种群与TH种群存在部分分支交叉,JX种群、WSH种群和JN种群单独成支。5个群体的成对FST值在0.03~0.20之间,群体两两之间遗传距离在0.03~0.22之间,单核苷酸多态性(π)为0.003974~0.004131,群体间遗传分化程度较低,多态性信息含量(PIC)的含量在0.16~0.20,观测杂合度(Ho)含量在0.18~0.27,近交系数(F)的含量值为-0.07912~0.09063,宽体金钱蛭5个群体有比较低的遗传多样性。Tajima's D值均值为正值,即群体处于稳定状态。群体间遗传变异主要来自群体内部,群体间具有较低的遗传多样性,推测可能是宽体金线蛭在养殖过程中进行了频繁的苗种移养或亲本引种。

藻粉对宽体金线蛭生长、酶活性和基因表达的影响

为揭示方形环棱螺搭配投喂蛋白核小球藻粉或螺旋藻粉对宽体金线蛭生长、消化酶活性、抗凝血酶活性和相关基因表达的影响,将体质量(4.15±0.03)g的宽体金线蛭随机放入38.5 cm×27.5 cm×13.5 cm的透明塑料盒中,每盒20条,分别投喂方形环棱螺(螺组)、方形环棱螺加蛋白核小球藻粉(小球藻粉组)和方形环棱螺加螺旋藻粉(螺旋藻粉组)30 d,螺每1 d、藻粉每2 d投喂1次,养殖30 d时,测定生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF1)等生长相关基因的表达量,α-葡萄糖苷酶(α-GLU)、甘油三酯酶(ATGL)和蛋白酶(PT)消化酶相关基因的表达量,及免疫相关基因超氧化物歧化酶(SOD)和水蛭素(WP)基因的表达量。结果表明:10、20 d和30 d小球藻粉组宽体金线蛭的体质量高于其他组(P<0.05),10 d的特定生长率高于螺组(P<0.05),25 d和30 d的高于螺旋藻粉组(P<0.05),30 d的摄食量高于其他两组(P<0.05),饲料系数在10 d优于螺组,且在30 d优于螺旋藻粉组(P<0.05);养殖30 d后,各组存活率在91.67%以上;小球藻粉组和螺旋藻粉组抗凝血酶活性在30 d均高于螺组(P<0.05),小球藻粉组的脂肪酶活性高于螺组和螺旋藻粉组(P<0.05);小球藻粉组宽体金线蛭的GH、IGF1和PT基因表达量在30 d高于螺旋藻粉组且小球藻粉组的GH和PT基因表达量高于螺组(P<0.05)。综上所述,蛋白核小球藻粉作为辅助饵料与方形环棱螺搭配投喂宽体金线蛭30 d,显著促进了生长,提高了脂肪酶和抗凝血酶的活性,影响了相关基因的表达。

宽体金线蛭(水蛭)、青虾高效生态混养技术试验

1材料与方法1.1塘口条件试验塘口各项条件优良,面积8亩,池塘水深2m,塘埂四周建防逃和防鸟网,防止鸟类危害,进排水口设置双层钢丝网,防止敌害进入及水蛭、青虾逃逸。1.2放养前准备1.2.1清塘消毒每亩用120~150kg生石灰干法消毒,包括塘埂,并曝晒一周以上,彻底杀灭黄鳝、黑鱼、鲇鱼、细菌、病毒等。

鲁北地区宽体金线蛭亲蛭培育与苗种繁育技术

宽体金线蛭是养殖最为广泛的特种水产药用动物之一,养殖效益显著,近年来在鲁北地区推广已近千亩,逐渐摸索出一套适合当地地域环境的亲蛭培育与苗种繁育技术。本文基于工作实践和深入调查,对宽体金线蛭亲蛭培育和苗种繁育技术及养殖效益进行了系统总结与探讨,旨在为养殖者提供科学、实用的技术参考。

宽体金线蛭水肿病病原的分离鉴定与病理学研究

为明确引起宽体金线蛭(Whitmania pigra)水肿病爆发的原因,并为鱼药研究提供新思路,从患病水蛭的体腔液分离得到优势株CQ1808,通过形态学观察、生理生化特性测定和16S rDNA基因序列分析鉴定CQ1808菌株,采用K-B纸片扩散法对该菌进行药物敏感性试验,通过人工感染和病理组织切片观察病蛭组织的病理学变化。结果表明,CQ1808菌株为革兰氏阴性短杆菌。通过BLAST检索,发现该菌株与弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的16S rDNA序列自然聚类。系统发育树表明,CQ1808菌株为弗氏柠檬酸杆菌。药敏试验结果显示,该菌对氨曲南、头孢曲松、头孢哌酮等21种药物高度敏感,对头孢他啶、头孢唑啉、卡那霉素等7种药物中度敏感,对青霉素、头孢呋辛、麦迪霉素等9种药物表现耐药。人工感染结果显示,CQ1808菌株可使水蛭出现与自然病蛭相似症状。组织病理学研究表明,病蛭组织结构整体异常,消化系统尤其是嗉囊受损严重。研究结果证明,引起宽体金线蛭水肿病的病原为弗氏柠檬酸杆菌。

饥饿再投喂对宽体金线蛭的生长、消化酶及抗氧化酶活性的影响

目的:研究不同饥饿再投喂方式对宽体金线蛭幼蛭生长、消化酶及抗氧化酶活性的影响,为其适宜养殖投喂策略提供参考。方法:选用平均体重为(0.094±0.01)g的幼蛭为研究对象,处理方式为饥饿7、14、21 d,再分别恢复投喂23、16、9 d,养殖周期均为30 d。结果:宽体金线蛭幼蛭饥饿7 d恢复投喂后,除增重率外,其他生长指标与对照组无显著差异,随着饥饿时间的延长,幼蛭补偿生长现象逐渐消失。饥饿14 d,幼蛭淀粉酶活性显著高于对照组(P<0.05)。饥饿7 d,幼蛭脂肪酶活性显著高于对照组(P<0.05)。经恢复投喂,各组幼蛭消化酶活性与对照组均无显著差异。饥饿7 d,幼蛭各抗氧化酶活性(SOD、CAT、MDA、GPx)与对照组之间无显著差异。长期饥饿对幼蛭的抗氧化酶活性存在显著影响(P<0.05),幼蛭饥饿21 d,经短期再投喂,其抗氧化酶活性(SOD、CAT、GPx、T-AOC)仍显著高于对照组(P<0.05)。结论:在该实验条件下,幼蛭饥饿7 d后恢复投喂,其具有完全补偿生长效应,但随着饥饿时间的延长,其补偿生长效应逐渐消失,且幼蛭体内强烈氧化还原反应短时间内无法消除。

基于分子模拟技术筛选宽体金线蛭抗凝活性肽

目的:采用分子模拟技术从宽体金线蛭来源多肽库中筛选抗凝活性多肽,结合分子对接初筛及分子动力学模拟复筛,最终通过抗凝实验验证得到宽体金线蛭抗凝活性多肽。方法:利用虚拟酶切技术对宽体金线蛭蛋白库进行酶切,得到宽体金线蛭多肽候选库;选择凝血酶为凝血活性靶点,采用HPEPDOCK及Discovery Studio CDOCKER两种方法进行分子对接,并利用分子动力学模拟技术对分子对接初筛结果中对接结合能高的复合物进行动力学模拟复筛,通过MM-PBSA模块分析计算凝血酶-多肽复合物结合自由能;最后采用固相合成法化学合成复筛中稳定结合的宽体金线蛭多肽并进行体外抗凝活性测定。结果:经过虚拟酶切共得到3317条无毒多肽,通过分子对接进行初筛,结合分子动力学模拟复筛,得到1条结合凝血酶效果最好的目标抗凝肽,该多肽序列为QNTVGLDDFFSSYER,结合自由能为-427.506 kJ·mol^(-1)。凝血酶Arg233残基是该凝血酶-多肽复合物中介导结合相互作用的关键氨基酸。该宽体金线蛭抗凝肽在体外活性测定中确能延长凝血酶时间。结论:利用分子模拟技术有效筛选出1条宽体金线蛭抗凝活性肽,并经过抗凝实验验证,表明“模拟+实验”的活性肽筛选策略切实可行,该研究思路可为动物类中药物质基础研究提供参考。

宽体金线蛭不同工艺提取物的抗凝溶栓活性比较研究

宽体金线蛭(Whitmania pigra)具有抗凝溶栓的药理作用,但其药效受提取工艺的影响。为全面评价并筛选出合适的提取工艺,本试验采用脱脂、水提、酸提和酶解等不同工艺制备了14种提取物,并对提取物的抗凝活性、纤溶活性与体外溶栓活性进行分析。结果表明,脱脂胃蛋白酶酶解提取物的抗凝血酶活性显著高于其他提取物,且具有较强的纤溶活性和体外溶栓活性;仿生酶解提取物具有较强的抗凝血酶活性和体外溶栓活性;脱脂仿生酶解提取物具有较强的纤溶活性和体外溶栓活性;脱脂加热的水提提取物具有较强的纤溶活性和体外溶栓活性。脱脂胃蛋白酶酶解提取物中,分子量小于3 kDa的多肽具有较强的抗凝血酶活性和纤溶活性。此外,三个水提提取物、仿生酶解物、脱脂仿生酶解物和粗酶酶解提取物对纤维蛋白原的α肽链均具有溶解作用。综上所述,宽体金线蛭提取物均具有抗凝溶栓的药理作用,酶解提取物优于水提提取物和酸提提取物,脱脂处理有利于活性物质的提取,其中胃蛋白酶酶解提取物效果最佳,并且脱脂胃蛋白酶酶解物的小分子多肽成分具有最佳的抗凝血酶活性和纤溶活性。本试验结果为进一步开发利用宽体金线蛭的药理作用提供了理论依据。

宽体金线蛭提取物对HEK293细胞维甲酸诱导基因蛋白样受体(RLRs)通路的影响

维甲酸诱导基因蛋白样受体(RLRs)信号通路是机体重要的抗病毒作用途径。宽体金线蛭体内含有抗凝血的活性物质,主要用于治疗血栓等疾病,但对于该信号通路的影响尚无任何报道。本试验目的是采用聚肌苷酸聚胞苷酸(Poly I∶C)建立HEK293细胞RLRs信号通路激活模型,在此基础上揭示宽体金线蛭提取物(LE)对HEK293细胞RLRs信号通路的影响。试验首先转染3个不同质量浓度(1、2、4μg·mL^(-1))的Poly I∶C至HEK293细胞,并分别处理12 h、24 h和48 h,以维甲酸诱导基因I(RIG-I)的蛋白表达水平和mRNA转录水平为RLRs通路激活的指标。RLRs信号通路激活之后,采用LE对HEK293细胞进行处理,共设置4组,每组3个重复,分别为:对照组、2μg·mL^(-1) Poly I∶C转染组、2μg·mL^(-1) Poly I∶C转染且添加150μg·mL^(-1)的水蛭提取物、2μg·mL^(-1) Poly I∶C转染且添加300μg·mL^(-1)的水蛭提取物。处理时长分别为24 h和48 h。试验结果表明,转染3个剂量的Poly I∶C在3个处理时长均引起细胞活力降低,2μg·mL^(-1)和4μg·mL^(-1) Poly I∶C转染HEK293细胞12 h、24 h和48 h均显著提高了RIG-I蛋白的表达量,4μg·mL^(-1)的Poly I∶C转染组RIG-I mRNA转录水平在24 h和48 h显著提高。选择Poly I∶C质量浓度2μg·mL^(-1),处理24 h和48 h作为后续试验激活RLRs的处理条件。质量浓度为150μg·mL^(-1) LE可以显著抑制Poly I∶C介导的细胞活力降低;300μg·mL^(-1)的LE显著降低了RIG-I的蛋白水平;150μg·mL^(-1)和300μg·mL^(-1) LE处理24 h和48 h后均显著抑制了β干扰素的mRNA转录和生成。据此得出如下结论:Poly I∶C转染HEK293细胞成功地激活了RLRs信号通路,宽体金线蛭提取物具有促进HEK293细胞活力和抑制β干扰素生成的作用。

宽体金线蛭室外高密度高效生态养殖技术

宽体金线蛭体内含有多种药用成分,其提取物水蛭素能够减少血栓形成,对治疗心脑血管病有显著疗效,是极具开发价值的动物性中药材。近年来,水蛭药材的用量以每年约30吨递增,而我国野生水蛭产量以每年15%~20%的速度递减,日益枯竭的水蛭野生资源和不断增长的生产需求形成了严重的供需矛盾。目前其标准化、规模化养殖仍存在诸多技术难题,而巨大的市场利润和前景诱使很多养殖户盲目开展养殖,损失惨重,因此探索宽体金线蛭室外高密度高效生态养殖技术势在必行。

宽体金线蛭基因组SSR序列特征分析及其分子标记开发

【目的】分析宽体金线蛭基因组SSR序列特征,并开发多态性SSR分子标记,为宽体金线蛭种质遗传多样性分析及良种选育等提供有效的分子标记。【方法】利用基因组de novo测序技术对宽体金线蛭基因组进行扫描,通过序列拼接得到基因组序列,利用Tandem Repeats Finder v4.09查找拼接序列SSR位点,分析SSR序列特征并使用PRIMER3 Input(version 2.3.7)设计引物,随机选择三碱基、四碱基和五碱基SSR分子标记引物50对对8份宽体金线蛭DNA样品进行PCR验证,并以多态性SSR分子标记分析宽体金线蛭江苏高邮群体遗传多样性。【结果】测序拼接共得到148803个scaffolds序列,scaffold序列长度181～564229 bp,平均1544 bp,总长度230 Mb,N50为5948 bp,GC含量36.94%。宽体金线蛭基因组中三碱基重复SSR位点最多,有136890个,占总SSR位点的68.43%;其次为四碱基重复,有33769个,占总SSR位点的16.88%;六碱基、五碱基、二碱基和单碱基重复分别有11813、7110、6546和3907个,占总SSR位点的5.91%、3.55%、3.27%和1.95%。基序为AAT/ATA/TAA/ATT/TTA/TAT的SSR位点数量最多,其次为ATG/TGA/GAT/TAC/ACT/CTA、AGT/GTA/TAG/TCA/CAT/ATC和AAC/ACA/CAA/TTG/TGT/GTT,其他基序位点数量较少。有11871个SSR位点设计出引物,占总SSR位点的5.93%;选择的50对引物中有18对引物在8份宽体金线蛭DNA样品中具有多态性;群体遗传多样性检测发现宽体金线蛭江苏高邮群体18个SSR位点的平均等位基因(Na)3.81个,观测杂合度(HO)为0.0000～0.6429,平均为0.3631,期望杂合度(He)0.0701～0.7792,平均为0.4869,群体遗传多样性水平低。【结论】采用高通量测序技术开发SSR分子标记效率高,且新开发的18个宽体金线蛭SSR分子标记多态性丰富,可用于宽体金线蛭资源保护和利用。

宽体金线蛭5种提取方法的比较

宽体金线蛭５种提取方法的比较中国中医研究院基础理论研究所（北京１００７００）丁家欣，欧兴长，张秋海，张玲，刘振丽ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎａｍｏｎｇＦｉｖｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔＥｘｔｒａｃｔｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓｏｆＷｈｉｔｍａｎｉａＰｉｇｒａＷｈｉｔｍａｎ￥...

宽体金线蛭耗氧率与窒息点的初步研究

目的:研究宽体金线蛭的耗氧率和窒息点.方法:应用呼吸室法进行研究.结果:平均体重为10 g的宽体金线蛭,15～35℃变温下耗氧率为0.049～0.094mg·g-1· h-1,耗氧量为0.44～0.67mg·p-1·h-1,窒息点为0.9～1.51 mg·L-1;20℃条件下耗氧率为0.044～0.058 mg·g-1·h-1,耗氧量为0.19～0.77 mg·p-1·h-1,窒息点为1.4～1.57mg·L-1.结论:宽体金线蛭的耗氧率随水温的升高而上升;窒息点与温度和体重呈负相关;体重与耗氧率呈负相关,与耗氧量呈正相关;耗氧率白天和夜晚的差异不大.

宽体金线蛭不同炮制品抗炎作用及使用方法的药理研究

比较了宽体金线蛭3种炮制品,对小鼠急性炎症模型的抗炎作用、免疫吞噬能力。以体内、外抗凝及体内抗栓作用为指标,比较了供试品不同使用方法的活血作用,为全面认识宽体金线蛭的药理作用及合理使用方法,提供了初步实验依据。

宽体金线蛭嗜水气单胞菌感染的病原检验

对河北某宽体金线蛭(Whitmania pigraW h itm an)养殖场所养殖的宽体金线蛭发生的病害,进行了发病情况、临床表现、病理变化等方面的检验。同时,择代表菌株进行了16S rRNA基因的分子鉴定,测定了16S rRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树。结果表明所检病例为由嗜水气单胞菌(Aerom onas hydrophila)所引起的感染。分离后做纯培养的10株嗜水气单胞菌均为同种血清型菌株;代表菌株对健康宽体金线蛭的人工感染试验表明了相应的原发病原学意义;药敏试验结果显示,对供试37种抗菌药物中的头孢噻肟等高度敏感、对链霉素等敏感、对苯唑青霉素等耐药。

宽体金线蛭选育群体生产性状的选择效应

目的:为选育经济性状优良的宽体金线蛭新品种。方法:以江苏里下河地区野生宽体金线蛭为材料,以生长速度为指标,选择个体体重18.00 g以上构建宽体金线蛭选育群体,比较选育群体与普通群体繁殖及F1代养殖生产性状。结果:选育群体每10㎏亲蛭产茧1.81㎏,较普通群体提高了63.04%,卵茧规格较普通群体明显增大(P<0.01),亲蛭体重下降率及卵茧平均出苗率选育群体与普通群体无明显变化(P>0.05);选育群体F1养殖产量、均重及成活率较普通群体分别提高了55.69%、17.18%和33.17%,差异极显著,特定生长率及增重率明显高于普通群体(P<0.01),而干物质比2个群体F1代差异不显著(P>0.05)。结论:通过群体选育可以有效提高宽体金线蛭繁殖和养殖性能。

温度对宽体金线蛭生长的影响

[目的]研究不同温度对宽体金线蛭的生长的影响，为宽体金线蛭的人工养殖提供科学依据。[方法]随机分为4个试验组，在不同温度（15、20、25、30℃）下养殖20d，每组2d测1次体重，比较各组宽体金线蛭的日增重。[结果]15、20、25、30℃条件下平均日增重分别为2．04％、2．99％、3．23％、0．62％。在15～20℃范围内，随着温度的升高其生长明显加快（P〈0．05）；20～25℃平均日增重率最高，达到2．99％～3．23％，差异不显著（P〉0．05）；超过30℃则宽体金线蛭生长显著下降，存活率为55％。[结论]宽体金线蛭生长的适宜温度是20～25℃。

不同地理种群宽体金线蛭繁殖力及其初孵稚蛭、幼蛭成活率和生长指标比较

为探究异地引进的宽体金线蛭Whitmania pigra苗种是否适合本地养殖,对江苏省宿迁市的骆马湖(SQ)、江苏省兴化市的乌巾荡(XH)、江苏省苏州市吴江区的太湖(WJ)、湖北省大悟县竹竿河(DWX)和黑龙江省宾县的松花江(BX) 5个不同地理种群的野生宽体金线蛭亲蛭的繁殖力,稚蛭第21天时的成活率、生长指标,以及幼蛭第121天时的成活率、生长指标进行了比较研究。结果表明:各地区在亲蛭体质量间无显著性差异(P>0. 05)的情况下,其各自平均产卵茧数量、卵茧平均质量和平均出苗量均无显著性差异(P>0. 05),种蛭平均体质量与卵茧的平均质量、卵茧的平均出苗数量均成正比;各地区间稚蛭第21天时的成活率均无显著性差异(P>0. 05),黑龙江宾县稚蛭从第11天起生长指标明显低于其他4个地区;江苏3个地区幼蛭第121天时的成活率明显高于黑龙江宾县和湖北大悟县幼蛭,黑龙江宾县幼蛭从第30天起生长指标明显低于其他4个地区。研究表明,江苏3个地区的宽体金线蛭较适宜本地区养殖,夏季水温应控制在30℃以下,在宽体金线蛭的养殖购种时最好选择与本地环境相近的亲本和蛭苗。