外源物质诱导家蚕小分子热激蛋白基因HSP19.9的组织表达活性分析

小分子热激蛋白(sHSP)参与生物体细胞内多种生理生化反应,并保护细胞在外界不良环境胁迫下免于受损或降低受损程度。为了探讨家蚕小分子热激蛋白在家蚕组织对外源物质代谢中的作用,分别给家蚕添食蜕皮激素(MH)和芸香苷(rutin)后,采用双跟踪标定定量PCR(dual spike-in qPCR)方法,分析家蚕sHSP19.9基因(BmHSP19.9)的组织应急表达特征。结果表明,家蚕5龄幼虫食下2×10-3μg/μL蜕皮激素溶液或5×10-2 ng/μL芸香苷溶液浸泡的桑叶2 h后,BmHSP19.9基因在中肠、脂肪体和马氏管组织中的转录水平均有上升,尤其是在脂肪体中的转录水平非常高,在中肠组织的转录水平出现2个峰值,推测与中肠组织存在不同的应激系统有关。

野桑蚕小分子热激蛋白基因BmmHSP19.9的克隆与表达分析

为探究野桑蚕(Bombyx mandarina)响应外源不良胁迫的分子机制,利用RT-PCR技术克隆野桑蚕小分子热激蛋白(small heat shock protein, sHSP)基因BmmHSP19.9,并进行生物信息学分析。BmmHSP19.9基因(GenBank登录号:OP779245)的开放阅读框(ORF)长534 bp,编码177个氨基酸。BmmHSP19.9具有sHSP特征结构域,相对分子质量为19.9 kD,等电点(pI)为6.53。同源比对和系统进化分析显示,昆虫sHSP蛋白具有较高的保守性,BmmHSP19.9与家蚕的BmHSP19.9亲缘关系最近。RT-qPCR结果表明,BmmHSP19.9在野桑蚕5龄幼虫的精巢、中部丝腺和后部丝腺的表达量较高;在高温(40℃)和低温(8℃)胁迫时,BmmHSP19.9在5龄幼虫所有组织中的表达水平均有所上调;添食BmNPV对BmmHSP19.9在5龄幼虫血淋巴和中肠组织的表达有诱导作用;溴氰菊酯胁迫下,BmmHSP19.9在5龄幼虫中肠中的表达水平显著上调。上述结果表明,BmmHSP19.9可能在野桑蚕响应外源不良胁迫的过程中发挥了重要作用。

农药与紫外胁迫对白蛾周氏啮小蜂小分子热激蛋白sHSP12.2基因表达的影响

【目的】研究寄生性天敌昆虫热激蛋白HSPs的功能,为探讨寄生性天敌昆虫的小分子热激蛋白对农药与紫外胁迫下的抗逆性作用提供基础。【方法】克隆白蛾周氏啮小蜂的一个小热激蛋白基因Ccshsp12.2,对其从系统发育、核苷酸替换速率和密码子使用偏好性等方面进行分析,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术研究其经紫外照射及用阿维菌素、苏云金杆菌、灭幼脲和高效氯氰菊酯4种农药处理后,Ccshsp12.2的表达量变化。【结果】获得了含有完整编码区的Ccshsp12.2基因序列,编码206个氨基酸,分子量为23.1 kDa;进化分析结果表明白蛾周氏啮小蜂等寄生性类群与麦茎蜂等自由生活类群聚成2个分支。选取的9条基因平均Ka/Ks(即dN/dS)值为0.906 556,主要接受负选择压力。寄生性昆虫的平均密码子选择偏好性指数为0.344,自由生活昆虫的平均密码子选择偏好性指数为0.353。RT-qPCR试验结果显示,与对照相比,经农药和紫外线的处理后,白蛾周氏啮小蜂Ccshsp12.2表达量均有所上调,达3.36～6.17倍。【结论】通过分子进化分析,发现不同生活方式的昆虫其热激蛋白所受的进化压力有显著差别;紫外照射及阿维菌素等4种农药均能显著诱导Ccshsp12.2基因表达上调。本研究结果将为白蛾周氏啮小蜂HSPs的抗逆性研究提供依据。

甜椒内质网小分子热激蛋白基因(CaHSP22.5)克隆及其在转基因烟草中的表达分析

【目的】克隆甜椒内质网小分子热激蛋白基因(CaHSP22.5),并检测其表达特性,为探究其在植物抗逆中的调控机制提供理论依据。【方法】克隆CaHSP22.5基因并构建其表达载体pBI121-CaHSP22.5,转化农杆菌LBA4404后通过叶盘法转化野生型烟草,即获得CaHSP22.5转基因株系;以转pBI121空载体的野生型烟草为对照组。对转基因株系和野生型烟草进行4℃6 h低温处理,根据幼苗成活率测定CaHSP22.5基因表达对植株耐寒性的影响。采用脉冲振幅调制叶室荧光仪Li-6400测量4℃处理10 h后野生型植株与CaHSP22.5转基因株系叶绿素荧光,根据非光化学淬灭系数(NPQ)值测定CaHSP22.5基因表达对在低温下植株光合作用的影响;使用过氧化氢(H2O2)钛络合物法对烟草叶片中H2O2进行定量分析,通过测定活性氧(ROS)积累程度分析CaHSP22.5对植物光合系统的影响;采用检测柠檬酸合成酶(CS)活性的方法,在体外通过对变性CS复性的影响测定CaHSP22.5的分子伴侣活性。【结果】经低温处理后发现CaHSP22.5转基因株系13号、24号和32号幼苗的平均存活率分别为84%、75%和52%,而野生型烟草的平均存活率为30%,CaHSP22.5转基因株系烟草幼苗成活率菌高于野生型幼苗。低温处理10 h后发现CaHSP22.5转基因植株NPQ较野生型植株显著升高(P<0.05),说明转基因烟草中CaHSP22.5的积累有利于保护光合系统,在低温胁迫下清除ROS。同时发现低温胁迫导致植株ROS产量增加,CaHSP22.5转基因植系与野生型相比ROS积累水平较低。不同浓度的CaHSP22.5均可使变性的CS复性,且其CS活性均高于未添加CaHSP22.5的CS活性。【结论】CaHSP22.5蛋白可增强植株的耐寒性及光合作用,在植物体内可降低ROS积累,减轻脂质过氧化,同时具有分子伴侣活性。

莲草直胸跳甲小分子热激蛋白sHsp20.8基因的克隆及生物信息学分析

[目的]小分子热激蛋白基因对昆虫的生长发育和抵御环境胁迫具有重要作用,本研究在PacBio SMRT测序的基础上,进一步克隆鉴定莲草直胸跳甲(Agasicles hygrophila)小分子热激蛋白sHsp20.8基因并进行生物信息学分析。[方法]采用RT-PCR技术克隆鉴定了莲草直胸跳甲sHsp20.8基因的完整CDS;利用各种生物信息学方法对该热激蛋白的理化性质、保守结构域、亲水/疏水性、信号肽、亚细胞定位、跨膜区进行分析,并进行了二、三级结构的预测和系统发育分析。[结果]莲草直胸跳甲sHsp20.8基因完整CDS为543bp,编码180个氨基酸,分子量为20.8kDa,等电点为6.45。编码蛋白含有小分子热激蛋白保守结构域和特征基序,不含跨膜区和信号肽,定位于细胞核。系统发育分析表明小分子热激蛋白基因可以作为昆虫系统进化分析的标志基因。[结论]获得的sHsp20.8基因是sHsps家族成员,结果将为深入研究小分子热激蛋白的功能奠定理论基础。

过量表达内质网小分子热激蛋白增强转基因番茄果实的耐冷藏性

利用番茄内质网小分子热激蛋白(ERsHSP)特异性抗体,对番茄果实蛋白进行Western分析,以测定低温冷藏下番茄果实中ERsHSP的表达量,并测定果实硬度、腐烂度和失重率等指标,以比较中蔬4号转ERsHSP基因番茄和未转基因番茄果实在4℃低温下的耐冷藏性.结果表明:在4℃冷藏30 d期间,转基因番茄果实具有较高的ERsHSP表达水平,而未转基因番茄果实中没有ERsHSP的表达;相对于未转基因番茄果实,转基因番茄果实冷害症状轻,并具有较高的果实硬度(平均值为2.84 kg/cm2)、较低的果实腐烂度(平均值为21.03%)和失重率(平均值为6.33%).

小分子热激蛋白基因在番茄花药中的转录

选择 8个耐热性不同的番茄品种种植在地处亚热带的日本最南部石垣市 ,测定夏季高温环境下花粉粒的败育率 ,并据此将其分成耐热型和热敏型品种 ,分析高温胁迫下花药中 4类小分子热激蛋白的转录。结果表明 ,番茄花药中含有组成性的细胞质小分子热激蛋白和线粒体小分子热激蛋白mRNA ;高温季节细胞质小分子热激蛋白和线粒体小分子热激蛋白基因转录明显 ;

桑树小分子热激蛋白基因的鉴定及在逆境胁迫下的表达

小分子热激蛋白(s Hsp)在植物抵抗非生物胁迫过程中起重要作用。采用生物信息学方法,在川桑(Morus notabilis)基因组中鉴定了29个桑树s Hsp基因,基于进化关系及亚细胞定位将其分为13个亚家族和1个孤儿基因。13个桑树s Hsp基因亚家族中,CⅫ和CⅩⅢ属于植物s Hsp的2个新的亚家族;预测有4个桑树s Hsp基因的启动子中各具1个完整热激元件(HSE),在桑树s Hsp基因的启动子中可能还包含其他响应非生物胁迫的元件。采用定量PCR方法检测非生物胁迫下印度桑(Morus indica)品种K2的叶片中10个桑树s Hsp基因都能快速地响应高温胁迫,分别有5、9、7个桑树s Hsp基因响应低温、盐分和干旱胁迫,其中Mn15.7-CⅤ基因在4种逆境胁迫下的表达均被抑制,并在高温胁迫5 min后表达显著下调。研究结果提示s Hsp可能在桑树抵抗非生物逆境胁迫的过程中发挥重要作用。

过量表达叶绿体小分子热激蛋白提高番茄的抗寒性(英文)

小分子热激蛋白与植物耐寒性提高有相关性,但是没有直接的实验证据能证明小分子热激蛋白的存在增加植物抗寒性。我们克隆了番茄叶绿体(定位)小分子热激蛋白cDNA,并将35SCaMV启动子驱动的番茄叶绿体小分子热激蛋白cDNA植物表达构架导入番茄,测定转基因番茄和未转基因番茄的抗寒性水平。低温处理后,转基因番茄的冷害症状轻于未转基因的番茄;转基因番茄细胞电解质外渗较少、花青素和MDA累积量较低;净光合速率和叶绿体含量高于对照。这些实验结果说明叶绿体小分子热激蛋白的过量表达提高了植物抗寒性。

高温胁迫下B型烟粉虱热激蛋白基因hsp70表达量的变化

为了探讨热激蛋白在B型烟粉虱Bemisiatabaci B-biotype抵抗高温中的作用,以含有B型烟粉虱热激蛋白基因hsp70片段的质粒为模板,用TaqMan-MGB探针和特异性引物构建了B型烟粉虱hsp70实时荧光定量RT-PCR检测体系,并检测了37℃-45℃高温胁迫及气温变化时B型烟粉虱成虫体内hsp70表达的情况。结果表明：缓和的高温对B型烟粉虱成虫hsp70表达具有诱导作用,在37℃-41℃范围内,hsp70的表达量随着温度的升高从8.78×10^5±6.41×10^4拷贝数上升到1.99×10^7±1.45×10^5拷贝数,在41℃时达到最高峰;而当温度升高到43℃和45℃,hsp70表达量迅速降低。B型烟粉虱成虫hsp70的表达与昼夜气温变化有关,当上午气温从34℃上升到41℃时,hsp70的表达量从1.16×10^5±1.48×10^4拷贝数上升到6.29×10^6±1.80×10^5拷贝数;当傍晚气温下降到33℃时,hsp70表达量也下降到2.32×10^5±7.69×10^3拷贝数。因此推测,hsp70在B型烟粉虱抵抗高温胁迫方面可能具有重要作用。

朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因TCHSP70-4的克隆与表达

为了研究朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)热激蛋白HSP70的表达与其适应高温和低温胁迫的关系,我们利用物种的同源性及RACE技术,获得朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因1个,命名为TCHSP70-4(GenBank登录号为EU977182)。该基因全长2182bp,包含1959bp的开放阅读框,编码653个氨基酸,理论分子量为70.9kDa,等电点为5.4,含有HSP70家族高度保守的基序。运用real-time PCR分析冷激(4℃)和热激(40℃)1h后TCHSP70-4在朱砂叶螨体内的表达量。结果显示冷激后TCHSP70-4表达量明显下降,而热激后TCHSP70-4表达量却明显上升。这些结果一方面表明该基因属于诱导型HSP70基因,另一方面揭示了朱砂叶螨分别受到冷和热胁迫后体内TCHSP70-4的表达及所起的保护作用是不同的。

B型烟粉虱和温室白粉虱热激蛋白90基因(hsp90)的全长cDNA克隆与系统发育分析

B型烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)biotype B和温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum均为全球普遍发生的重要害虫。本研究以其他昆虫热激蛋白90基因(hsp90)保守区域设计兼并引物扩增两种粉虱hsp90中间片段,然后利用RACE技术获得全长cDNA。温室白粉虱hsp90全长cDNA的开放性阅读框2166bp,编码722个氨基酸;烟粉虱hsp90全长cDNA的开放性阅读框2160bp,编码720个氨基酸。两种粉虱HSP90的完整氨基酸序列相似性高达92.94%,并均具有定义HSP90家族签名序列的5个氨基酸保守区域和末尾基序"MEEVD"。通过real-time PCR技术,探测到两个基因在mRNA水平上皆能高温诱导表达。采用昆虫纲所有完整HSP90氨基酸序列进行Kimura双参数遗传距离分析并构建NJ进化树,结果显示hsp90在昆虫纲低级阶元水平和高级阶元水平系统进化上能得到一个较理想结果。本研究结果为B型烟粉虱和温室白粉虱抗逆适应性研究提供基础,并进一步验证保守的功能基因hsp90可以作为研究生物系统发育的手段之一。

利用反向PCR方法扩增细菌热激蛋白HSP60基因

利用PCR简并引物扩增出HSP6 0基因中一段约 6 0 0bp的核心片段 ,将该核心片段标记为探针 ,与基因组DNA进行Southern杂交 ,选择出适宜的限制性内切酶 ,以便消化基因组DNA得到大小合适的、含有HSP6 0基因的酶切片段。将酶切片段自身环化后作为模板进行反向PCR ,引物的延伸方向自核心片段出发延环化分子向未知序列区进行 ,可扩增出核心区上下游的序列。应用该方法 ,扩增并测定了寓齿双歧杆菌 (Bifidobacteriumdenticolens)DSM1 0 1 0 5 T、奇异双歧杆菌 (Bifidobacteriuminopinatum)DSM1 0 1 0 7T 和阴道加德纳氏菌 (Gard nerellavaginalis)ATCC1 40 1 8T 的HSP6 0全基因序列及青春双歧杆菌 (Bifidobacteriumadolescentis)JCM1 2 75 T98%以上的HSP6 0全基因序列。结果表明 ,反向PCR方法可有效的扩增细菌HSP6

拟南芥热激蛋白HSP70基因片段克隆实验体系的建立

以拟南芥为材料,对热激蛋白HSP70基因片段进行了克隆研究,获得了最佳的分子克隆实验体系.首先提取拟南芥总DNA,接着在热激蛋白HSP70编码区设计引物,扩增出HSP70编码区的片断,再将HSP70编码区的片断加上具有EcoR I酶切位点双链的人工接头,通过EcoR I对其进行酶切.再与经过EcoR I酶切并已经去磷酸化的PUC19载体通过T4连接酶进行连接,然后将连接产物置入到感受态大肠杆菌细胞中(即转化),并让这种细胞在含有Amp+/IPTG/X-Gal的LB培养基上生长.挑取培养基上蓝白斑中的白斑,进行质粒DNA提取,通过酶切质粒DNA,从而初步判断目的片段已被克隆.

草莓果实小分子量热激蛋白基因FaHSP17.4的克隆及表达分析

为了探究小分子热激蛋白（SHSP）在草莓果实发育成熟中的作用，以及其在果实发育成熟时期和不同温度下的表达和调控模式。

斑玉蕈热激蛋白基因hsp70在刺芹侧耳中的转化

将斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus)热激蛋白基因hsp70通过农杆菌介导的方法对刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)进行遗传转化,PCR验证得到刺芹侧耳抗性转化子。试验表明:潮霉素浓度为70μg/mL,乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L,侵染时间为90 min,共培养时间为2 d时转化率最高。

异色瓢虫3个小分子热激蛋白序列及低温诱导表达分析

【目的】异色瓢虫(Harmonia axyridis)是一种重要的捕食性天敌昆虫,广泛应用于农林害虫的生物防治中。本研究旨在分析探索低温胁迫条件对3个小分子热激蛋白(small heat shock protein,s HSP)抗寒基因相对表达量的影响,为异色瓢虫低温冷藏及其抗寒机制研究提供科学依据。【方法】在转录组获得异色瓢虫基因序列的基础上,根据特异性引物获得HaHSP47.74(基因登录号:KX161871)、HaHSP21.53(基因登录号:KX161873)和HaHSP21.52(基因登录号:KX161874)基因c DNA的开放阅读框序列(open reading frame,ORF),采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,q RT-PCR)技术测定异色瓢虫3个s HSP基因在不同发育阶段、短时降温和短时降温后恢复处理、低温储存处理下以及不同色斑的表达水平。【结果】在不同发育阶段处理中,HaHSP47.74和HaHSP21.53在蛹期及成虫期高表达;HaHSP21.52在4龄幼虫第4天表达量显著高于对照组。在短时降温处理中,HaHSP47.74在降温至0℃和-5℃时表达量显著高于对照组;HaHSP21.53和HaHSP21.52在降温过程中表达量显著降低。在短时降温后恢复处理中,3个s HSP基因表达量无显著差异。在低温储藏条件下,实验种群:黑底雌瓢虫HaHSP47.74表达水平在储存第5天时显著升高,黄底雌瓢虫HaHSP47.74在储存5—15 d时表达量显著升高;黑底雌瓢虫HaHSP21.53在储存5—20 d时显著性高表达,黄底雌瓢虫HaHSP21.53在15 d时显著性高表达;黑底和黄底雌瓢虫HaHSP21.52无显著性高表达;越冬种群:黑底和黄底雌瓢虫HaHSP47.74、HaHSP21.53、HaHSP21.52在低温储存中均无显著性高表达。【结论】s HSP在异色瓢虫发育阶段可能发挥着作用。短时降温胁迫能够诱导s HSP基因高表达。实验种群在低温储存条件下HaHSP47.74和HaHSP21.53均出现了显著性高表达,表明这两个基因在瓢虫受到冷驯化时起到了作用。此外,不同色斑型异色瓢虫的抗寒机制和抗寒能力有所差异。

马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-HSP60的克隆、序列分析及温度胁迫下的表达

【目的】马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是一种世界性检疫害虫,对温度胁迫具有极强的适应性,为进一步明确其对温度胁迫适应性的分子机制,研究了热激蛋白HSP60在马铃薯甲虫温度胁迫应答过程中的作用。【方法】采用RT-PCR及RACE技术克隆马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因的cDNA全长序列;利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白质的序列特性;运用实时荧光定量PCR技术分析该基因在温度胁迫下的表达模式。【结果】克隆得到马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因,命名为Ld-HSP60(Gen Bank登录号:KC556801),其cDNA全长2 234 bp,开放阅读框(ORF)长1 731 bp,编码576个氨基酸,相对分子量约为61.27 kD,理论等电点为5.51,5'端非翻译区(UTR)长101 bp,3'UTR长402 bp。氨基酸序列中含有HSP60家族典型的特征序列。实时荧光定量PCR结果表明,低温胁迫(-10和0℃)下未检测到马铃薯甲虫雌雄成虫中Ld-HSP60的诱导表达;高温胁迫(38和44℃)诱导马铃薯甲虫雄成虫Ld-HSP60上调表达,随着胁迫温度的升高LdHSP60表达量呈现先升高后降低的趋势,38℃高温胁迫下表达量最高,胁迫时间越长Ld-HSP60表达量也越高。【结论】相比其他热激蛋白,HSP60对温度敏感性较低,推测HSP60可能在马铃薯甲虫雄成虫抵御高温胁迫中发挥作用。

甜菜热激蛋白基因BvHSP18.2的克隆和生物信息学分析

旨在通过基因克隆及生物信息学分析,预测甜菜小分子热激蛋白BvHSP18.2(LOC104903994)的功能。以甜菜‘780016B/12优’为试验材料克隆BvHSP18.2,获得BvHSP18.2基因全长;通过ProtParam tool、SWISS-MODEL、MEGA11等对BvHSP18.2的理化性质、蛋白结构、多序列比对等信息进行分析。RT-PCR扩增得到的BvHSP18.2基因全长为962 bp,编码158个氨基酸,分子式为C_(928)H_(1466)N_(266)O_(284)S_(6),属亲水性不稳定的小分子热激蛋白家族;该基因编码蛋白含13个磷酸化位点,α螺旋和无规则卷曲等主要构件。进化关系发现BvHSP18.2与藜麦、菠菜的sHSP同源性相似。同时,BvHSP18.2基因启动子区域具有参与防御和应激反应等顺式作用元件,推测其在甜菜生长发育和胁迫应答中发挥重要作用。本结果为进一步开展该基因的功能和遗传调控机制研究奠定了基础。

组成型表达线粒体小分子热激蛋白提高番茄抗冷性

线粒体小分子热激蛋白不但是线粒体的主要热诱导产物,而且也被低温诱导,线粒体小分子热激蛋白可以提高植物的耐热性,但目前还不清楚它是否与植物的耐冷性有关.本实验利用基因工程方法,将番茄线粒体小分子热激蛋白基因(LeHsp23.8)导入番茄,Northern-blotting及Western-blotting分析结果表明,在35sCaMV启动子的驱动下,导入的线粒体小分子热激蛋白基因呈现组成型表达.转基因番茄呈现耐低温性更强的表型,说明组成型表达线粒体小分子热激蛋白基因能提高番茄的抗冷性.