经导管动脉栓塞术联合小干扰核糖核酸治疗肝癌疗效及对兔缺氧诱导因子-1、血管内皮生长因子的影响

目的:探讨经导管动脉内栓塞(TAE)联合小干扰RNA沉默基因治疗肝癌的疗效及对兔缺氧诱导因子-1(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法:以20只肝癌模型兔为研究对象,采用随机数字表法分为两组,每组10只,对照组采用动脉内注入PVA微粒与对比剂混悬液治疗,研究组使用动脉内灌注PVA微粒与对比剂混悬液及HIF-1α-shRNA溶液治疗,观察对肿瘤体积、肝癌组织核分裂像总数、HIF-1α蛋白和VEGF蛋白的表达以及门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸基转移酶(ALT)水平的影响。结果:(1)治疗前两组肿瘤体积分别为(5510.2±1302.8)mm^(3)和(5475.3±1237.7)mm^(3),两组比较无统计学差异(P>0.05);治疗后两组肿瘤体积均有一定程度的增加,与治疗前比较,对照组为(8125.1±1114.3)mm^(3),差异有统计学意义(P<0.05),研究组为(6314.4±1337.6)mm^(3),差异无统计学意义(P>0.05),组间比较研究组术后肿瘤体积显著降低(P<0.05)。(2)对照组核分裂像总数为(11.12±3.28)个,研究组为(7.85±2.17)个,研究组核分裂像总数显著低于对照组(P<0.05)。(3)研究组肿瘤组织HIF-1α表达量为(1.73±0.15)pg/ml,显著低于对照组的(7.15±2.38)pg/ml(P<0.05),研究组肿瘤组织VEGF表达量为(1.51±0.64)pg/ml,显著低于对照组的(8.75±1.36)pg/ml(P<0.05)。(4)治疗前两组AST和ALT水平比较均无统计学差异(P>0.05),治疗后对照组和研究组ALT水平分别为(78.51±4.85)U/L和(43.58±4.14)U/L,均显著升高(均P<0.05),对照组和研究组AST水平分别为(71.35±4.15)U/L和(38.27±3.24)U/L,均显著升高(均P<0.05),与对照组相比,研究组术后ALT和AST水平均显著降低(均P<0.05)。结论:TAE联合siRNA干扰HIF-1α能通过降低HIF-1α和VEGF蛋白表达量抑制肝癌兔肿瘤的生长。

注射用小干扰核糖核酸脂质体药效学研究

目的利用乙型肝炎病毒(HBV)转基因鼠模型,研究注射用小干扰核糖核酸(siRNA)脂质体药物的抗HBV作用。方法对M-TgHBV转基因小鼠静脉给予不同剂量的注射用siRNA脂质体药物,在给药的不同时间点采血测定乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg),在最后一天取部分鼠肝脏进行免疫组化分析。结果与给药前比较,试验药物2mg/kg组(A组)HBsAg表达水平在第9天和第12天时明显降低(P<0.05),在第15天时降低非常明显(P<0.01),试验药物1mg/kg及0.5mg/kg组(B,C组)、阳性药物(拉米夫定)组(F组)在第15天时均显著降低(P<0.05);免疫组化分析结果表明,相对于阴性对照组(G组),肝内HBsAg表达抑制率A组为48.44%,B组为36.73%。结论注射用siRNA脂质体在转基因鼠中的抗HBV作用明显。

小干扰核糖核酸沉默星形胶质上调基因对人转移胰腺癌细胞侵袭转移的影响

目的研究小干扰核糖核酸(siRNA)星形胶质细胞上调基因(AEG-1)对人胰腺癌细胞侵袭转移的影响及其分子机制。方法将胰腺癌As PC-1细胞随机分为3组:未转染组、脂质体转染组(以20 pmol·μL-1脂质体5μL转染)和AEG-1siRNA转染组(以20 pmol·μL-1siRNA 5μL转染)。用实时荧光定量-聚合酶链反应测定AEG-1 mRNA的表达水平;通过Transwell小室侵袭实验和软琼脂克隆形成实验观察沉默AEG-1对宫颈癌细胞侵袭及体外成瘤能力的影响,以免疫印迹法检测转移相关因子基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达水平。结果未转染组、脂质体转染组和AEG-1siRNA转染组的胰腺癌细胞AEG-1基因表达量分别为0. 92±0. 18,0. 95±0. 22和0. 18±0. 10;上述这3组的MMP-9蛋白水平(灰度值)分别为0. 89±0. 05,0. 98±0. 04和0. 35±0. 02;上述这3组的MMP-2蛋白水平(灰度值)分别为0. 88±0. 04,0. 81±0. 03和0. 36±0. 02;上述这3组的细胞克隆形成数分别为64. 33±3. 05,68. 23±4. 51和16. 63±2. 21。AEG-1siRNA转染组与未转染组和脂质体转染组比较,上述指标的差异均有统计学意义(均P <0. 05)。结论 RNA干扰AEG-1基因表达后,可显著抑制人胰腺癌As PC-1细胞的侵袭转移能力,其作用机制可能通过下调MMP-9和MMP-2有关。

端粒重复序列结合因子2小干扰核糖核酸逆转胃癌细胞多药耐药性的研究

阿霉素（Adriamycin，ADR）和依托泊苷是临床常用的肿瘤化学治疗药物，主要作用机制为抑制DNA拓扑异构酶，导致DNA双链断裂（double—strand DNA breaks，DSB）。肿瘤细胞发生耐药与多种机制有关，其中对DNA损伤修复的影响是其中重要的一环。端粒重复序列结合因子2（telomeric repeat binding factor2，TRF2）能够通过维持端粒末端的T环结构，防止端粒被DNA损伤修复机制检测为DSB，维持端粒的正常结构和功能。

N-乙酰半乳糖胺及其衍生物作为小干扰核糖核酸和反义寡核苷酸递送载体的研究进展

近年来,使用N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)缀合物靶向去唾液酸糖蛋白受体来递送寡核苷酸至肝细胞已成为治疗性寡核苷酸领域的突破方法。与传统的寡核苷酸递送方法相比,GalNAc偶联技术是一种更简单的肝脏递送方法,表现出肝靶向特异性、高效性、安全性以及可规模化制备等优势,具有深入开发的研究价值和临床应用的广阔前景。利用GalNAc偶联技术开发的givosiran已被美国FDA批准用于治疗急性肝卟啉症,此外还有7种缀合物处于注册审评或Ⅲ期临床试验中,另外至少还有21种GalNAc核酸缀合物处于临床开发的早期阶段。但国内GalNAc偶联技术相关研究基础比较薄弱,也无相关产品上市,属于“卡脖子”技术,因此本综述重点介绍了GalNAc及其衍生物作为小干扰核糖核酸(siRNA)和反义寡核苷酸(ASO)这2种寡核苷酸递送载体的研究进展,以期为国内GalNAc缀合物的开发提供参考。

小干扰RNA下调乳腺癌扩增基因3表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞转化生长因子-β通路的影响

目的观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性干扰乳腺癌扩增基因3(amplifiedin breast cancer 3,AIB3)对乳腺癌细胞转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)通路关键分子smad2、smad3及转移相关分子基质金属蛋白-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)表达的影响。方法制备3组靶向AIB3的特异性siRNA分别转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,采用逆转录-聚合酶联反应检测siRNA干涉效果以及smad2、smad3与MMP-9的表达水平变化。结果与空白对照组相比,3组合成的靶向特异性siR-NA均可有效抑制AIB3基因表达;干涉AIB3可同时显著下调smad2、smad3及MMP-9的表达水平。结论成功设计有效干扰AIB3的siRNA序列,在乳腺癌细胞中应用siRNA干扰AIB3可有效抑制TGF-β通路和转移相关通路关键分子的表达,干扰AIB3基因表达有可能成为临床治疗乳腺癌转移的有效策略。

小干扰RNA沉默HK-2细胞VDR及其对低枸橼酸尿症的意义

目的筛选有效沉默人肾近曲小管上皮细胞(HK-2 cells,HK-2细胞)维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)基因的小干扰核糖核酸(small interfering ribonucleic acid,si RNA)及其对低枸橼酸尿症的意义.方法培养HK-2细胞,设计4条VDR-si RNA,利用包装的慢病毒侵染所培养的HK-2细胞,利用蛋白质印迹法(western blot,WB)和实时定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测沉默VDR基因的HK-2细胞中VDR蛋白质和VDR-m RNA的表达水平.结果 si RNA 1(6120)能显著抑制HK-2细胞中VDR的表达,获得了VDR-si RNA 1(6120)稳定细胞株.结论 VDR-si RNA 1(6120)能有效沉默HK-2细胞中VDR的表达,可以进行下一步沉默VDR表达后检测Na(+)-二羧酸转运子[Na(+)-dicarboxylate cotransporter1,Na DC1]表达情况.

小干扰RNA分子对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

目的使用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制黏着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)基因的表达,观察增生性瘢痕成纤维细胞在生物学行为上发生的变化。方法设计特异性探针合成FAK SiRNA片段,脂质体法转染体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞,光学显微镜观察细胞形态;MTT检测细胞活性并绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞周期。结果转染后的成纤维细胞呈短梭形改变,胞质、突触减少,细胞核内核仁减少。细胞生长曲线表明,转染FAK siRNA的瘢痕成纤维细胞生长明显抑制。转染后瘢痕成纤维细胞阻滞在G1期,S期和G2期细胞比例减少。结论FAK与瘢痕增生相关密切,因此改变FAK在成纤维细胞中的表达可望调控增生性瘢痕成纤维细胞的生物活性。

干扰长单一序列区83基因对人巨细胞病毒感染后人脑血管平滑肌促血管生成素及血管内皮生长因子表达的影响

目的长单一序列区(unique long region 83,UL83)基因是人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染再激活标志。本研究拟探索UL83对HCMV感染后人脑血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)中不稳定斑块破裂相关因子,如促血管生成素(angiopoietin,Ang)以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响。方法 (1)采用流式细胞仪确定amidite荧光素(fluorescein amidite,FAM)标记的小干扰核糖核酸(small interfering ribonucleic acid,si RNA)通过脂质体转入人脑VSMC的转染效率;(2)将3条化学合成si RNA通过脂质体转染入已感染HCMV AD_(169)株(MOI=10)的人脑VSMC当中,结合空白组、接毒组及接毒无效干扰组筛选抑制UL83基因最强si RNA;(3)分别检测HCMV AD_(169)株(MOI=10)感染人脑VSMC后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h以及72 h Ang-1、Ang-2及VEGF-A信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,m RNA)及蛋白表达变化;(4)分别检测空白组、接毒高效干扰组、接毒无效干扰组及接毒组在感染48 h后Ang-1、Ang-2及VEGF-A的mRNA及感染72 h后上述蛋白表达情况。结果转染6 h后,95.59%人脑VSMC转染了FAM标记si RNA。感染HCMV AD_(169)株(MOI=10)的人脑VSMC在转染siRNA 48 h后,si RNA转染组与接毒组相比,UL83 m RNA相对表达量最多下降78.7%;转染si RNA72 h后,UL83编码的pp65蛋白相对表达量最多下降81.3%。人脑VSMC感染HCMV AD_(169)株(MOI=10)0 h、6 h、12 h、24 h、48 h以及72 h时后,Ang-1 m RNA及蛋白相对表达量逐渐下降(P<0.01),Ang-2及VEGF-A mRNA及蛋白相对表达量则逐渐增加(P<0.01)。而通过转染高效si RNA抑制HCMV AD_(169)株UL83基因,使得Ang-1表达下降,Ang-2和VEGF-A表达增加均被抑制。结论 HCMV AD_(169)株具有同时促进人脑VSMC中Ang-1表达降低,Ang-2及VEGF-A表达增加功能。而通过si RNA抑制HCMV AD_(169)株UL83基因表达能够阻止上述变化。提示HCMV可能通过UL83基因造成靶细胞产生促血管新生微环境。

重组补体因子B-小干扰RNA抑制大鼠脉络膜新生血管形成的作用及其机制

背景脉络膜新生血管（CNV）是眼内新生血管的重要表现形式。研究发现补体旁路途径的激活在激光诱导的CNV发展中起关键作用，旁路途径中的补体因子B（CFB）可以作为一个重要的靶点来阻断补体活化的旁路途径。目的探讨不同浓度重组CFB—siRNA（CFB—siRNA）抑制激光诱导大鼠CNV的效果及其作用机制。方法取棕色挪威（BN）大鼠60只120只眼，采用随机数字表法将其分为空白对照组、实验对照组和25、50、75μgCFB—siRNA组，每组12只鼠24只眼。实验对照组和CFB—siRNA组大鼠用激光光凝法建立CNV模型，不同剂量CFB—siRNA组于激光光凝后第1、3、5天分别经鼠尾静脉注射相应剂量的CFB—siRNA；实验对照组大鼠以同样方法注射生理盐水，空白对照组大鼠不给予任何干预措施。各组大鼠分别于光凝后第3、7、14、21、28天进行荧光素眼底血管造影（FFA），根据荧光素渗漏程度对各光凝斑评分并检测CNV的生长情况；采用免疫组织化学法检测各组大鼠脉络膜内血管内皮生长因子（VEGF）、Ⅷ因子的表达情况。分别于第7、14、21、28天用免疫组织化学法检测脉络膜中CFB、VEGF、转化生长因子β2（TGF—β2）蛋白的表达，用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法观察CFB与VEGFmRNA、TGF-β2mRNA表达的关系。结果不同剂量CFB—siRNA组的CNV发生率明显低于实验对照组，差异均有统计学意义（P〈0．05）；75p．gCFB—siRNA治疗组CNV发生率明显低于25μgCFB—siRNA组（P〈0．05）。免疫组织化学检测结果显示，不同剂量CFB—siRNA组VEGF、Ⅷ因子在大鼠脉络膜中的表达较2个对照组均减弱，且75μgCFB—siRNA组减弱程度高于25斗gCFB—siRNA组。光凝后14～21d，各剂量CFB-siRNA组VEGF蛋白、Ⅷ因子和TGF—B，在脉络膜中的表达均低于空白对照组，各组总体比较差异有统计学意义（P〈0．05）。光凝后7～21d，不同剂量CFB—siRNA组的CFB在脉络膜中的表达明显低于空白对照组，各组总体比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。RT—PCR检测结果显示，实验对照组CFB表达持续增加，VEGF、TGF—β2呈曲线变化，21d时为表达高峰；不同剂量CFB-siRNA组中CFB、VEGF、TGF—β2表达显著减少，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论尾静脉注射CFB—siRNA能够有效抑制激光诱导的大鼠CNV生成，其抑制效果随着注射剂量的增加而增强。补体激活旁路途径在CNV生成中扮演着重要角色，抑制CFB可减少CNV生成中VEGF和TGF—β2的表达。

外泌体靶向递送核酸类分子研究进展

外泌体作为纳米级小细胞外囊泡,是生命体内细胞信息传递的重要方式。外泌体由于具有递送效率高、免疫原性低、可跨过多种生物屏障和具有靶向性等特点。促使外泌体成为药物递送载体的重要成员,用以克服某些药物稳定性差、生物利用度不足、溶解度低和毒性高等缺点。本文将主要介绍近年来广泛关注的利用外泌体以囊泡形式作为新型药物递送几种核酸类分子,主要包括小分子核糖核酸、小干扰核糖核酸和脱氧核糖核酸进行综述,本文旨在为发展高效安全的外泌体靶向核酸类分子递送提供理论依据和设计思路,促进其临床转化。

核糖核酸干扰下调骨桥蛋白表达对胃癌细胞生物学行为的影响

目的探讨骨桥蛋白(OPN)下调对胃癌细胞株MKN28和SGC7901生物学行为的影响。方法参考相关文献,设计并合成OPN的小干扰RNA(siRNA),通过荧光标记测定2株细胞的转染效率。Western印迹法检测OPN蛋白下调情况。实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测siRNA对OPN mRNA的下调率及随时间的变化。流式细胞仪检测转染前、后细胞周期和凋亡变化。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法连续7d检测OPN干扰时肿瘤细胞增殖的变化,并采用混合模型进行统计分析。Trans- well实验检测转染前、后细胞的运动侵袭能力并行t检验进行分析。结果2株细胞中OPN siRNA的转染效率均在90%以上。干扰后2株细胞中OPN蛋白表达均下调。SGC7901细胞在siRNA转染后72hOPN mRNA表达下降最低,达47%;MKN28细胞在siRNA转染后48hOPN mRNA表达下降最低,达40%。OPN被干扰后,SGC7901和MKN28细胞的增殖能力明显减弱(混合模型分析与未干扰组比较,P<0.01)。OPN被干扰后MKN28和SGC7901细胞周期受到影响,其中SGC7901分裂期细胞比例由18.78%降至17.02%,MKN28分裂期细胞比例则由4.96%降至0.39%。2株细胞都未发现下调OPN后诱发细胞凋亡。OPN下调后2株肿瘤细胞的运动侵袭能力均下降,穿过人工基底膜的细胞数明显减少(SGC7901:t=5.172,P<0.01;MKN28:t=11.365,P<0.01)。结论siRNA能下调MKN28和SGC7901中OPN表达,OPN可能与MKN28和SGC7901细胞的增殖和运动侵袭相关。

小分子核酸药物在降脂治疗中的应用研究进展

动脉粥样硬化性心血管疾病当前排在全球死亡率前列,脂质或脂蛋白的异常是造成动脉粥样硬化的首要原因。他汀类药物等传统降脂药物疗效有时未能达到理想目标,残余心血管风险亟待解决。随着分子生物学的发展,小分子核酸药物凭借其独特的机制和优势,在降脂方面进行了许多研究,但对于不同靶点的研究还处于不同阶段。本文综述小分子核酸药物在降脂方面取得的研究进展。

顺铂通过调节FTO的表达诱导卵巢颗粒细胞凋亡

目的:观察顺铂处理人卵巢颗粒细胞KGN后,细胞中脂肪和肥胖相关基因(FTO)的表达水平和细胞凋亡的变化,探讨FTO基因对化疗后KGN细胞凋亡的调控。方法:分别使用0、5、10、15、20μmol/L顺铂处理KGN细胞24、48、72 h, CCK-8法分析细胞增殖能力变化,流式细胞术检测处理48 h后细胞的凋亡水平,Western blot(WB)法检测细胞中FTO、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。KGN细胞转染针对FTO基因的小干扰RNA(siRNA)(siFTO组),并设立细胞对照组(Control组,只含有脂质体)和siRNA对照组(siNC组,转染阴性对照序列);KGN细胞转染FTO真核表达质粒(FTO组),并设立细胞对照组(Control组,只含有脂质体)和空载体对照组(Vector组,转染空载体)。转染后,同时使用5μmol/L顺铂处理细胞48 h;分别采用qRT-PCR和WB法检测各组FTO、Bcl-2和Bax的表达水平。结果:随着顺铂浓度的增加,各处理时间组KGN细胞的增殖能力均逐渐下降(P<0.05)。细胞凋亡水平随着顺铂浓度的增加逐渐升高(P<0.05),FTO的表达水平逐渐下降(P<0.05)。使用siRNA下调FTO后,抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平下降(P<0.001),促凋亡蛋白Bax的表达水平升高(P<0.001);使用真核表达质粒上调FTO后,抑凋亡蛋白Bcl-2的表达升高(P<0.01),促凋亡蛋白Bax的表达下降(P<0.001)。结论:顺铂能够下调KGN细胞中FTO的表达水平,并通过抑制抑凋亡蛋白Bcl-2表达和上调促凋亡蛋白Bax表达,促进KGN细胞的凋亡,提示化疗可能通过FTO表达促进卵巢颗粒细胞凋亡,引起卵巢早衰。

小核糖核酸调控蚊虫代谢解毒酶基因表达的研究进展

随着分子生物学的发展,研究发现非编码小核糖核酸(small ribonucleic acid, sRNA)在基因表达及蛋白质活性方面具有重要的调控作用,影响着包括蚊虫对杀虫剂抗药性在内的多种生物学途径。了解抗药性的分子调控机制对控制蚊虫至关重要。其中代谢抗性是最关键的机制,主要指蚊虫体内的代谢解毒酶(特别是细胞色素P450酶系)相关基因的高表达。在已验证抗药性基因的基础上进一步研究sRNA与其之间的联系,为进一步阐明蚊虫抗药性发生机制提供了新的思路和方向。蚊虫代谢抗性机制的研究对病媒蚊虫治理、抗药性监测及新型杀虫剂研发意义重大。本文就抗药性基因、sRNA的生物合成、参与调控蚊虫代谢解毒酶基因及实际应用的研究进展予以综述。

沉默GOLPH3基因对胃癌细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

目的观察特异性沉默高尔基体磷蛋白3(GOLPH3)基因对胃癌细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法将人胃癌SGC-7901细胞随机分为3组,A、B组分别转染LV-GOLPH3-RNAi-1、无义链,C组不转染。转染72h后,采用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞GOLPH3、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-m TOR)和m TOR。结果 A组细胞增殖的OD值较B、C组低,细胞凋亡率(2.70%±0.11%)高于B组(0.42%±0.02%)和C组(0.31%±0.02%),细胞GOLPH3、p-m TOR蛋白表达量较B、C组少,P均<0.05;B、C组间各指标比较,P均>0.05。结论沉默GOLPH3基因能抑制胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞凋亡,其机制可能与下调m TOR信号通路中关键因子p-m TOR表达有关。

抑制核转录因子κBp65对鼻咽癌CNE2细胞的生物学影响

目的探讨核转录因子κBp65(NF-κBp65)沉默对鼻咽癌的生物学作用。方法构建NF-κBp65特异性小干扰核糖核酸(si RNA)质粒表达载体(p GPU6/RFP/Neo-NF-κBp65)和阴性对照质粒表达载体(p GPU6/RFP/Neo-NC)。采用非脂质体脂类转染剂将重组质粒表达载体转入人鼻咽癌CNE2细胞,建立NF-κBp65沉默的稳定转染CNE2细胞株(NF-κBp65沉默组)和阴性对照细胞株(阴性对照组);蛋白质印迹法(Western blot)分析癌细胞中NF-κBp65基因的表达水平,MTT实验及流式细胞术分析癌细胞的增殖能力和细胞周期变化;复制裸鼠移植瘤模型,分析沉默NF-κBp65对癌细胞成瘤性的影响。结果成功获得稳定转染CNE2细胞株,NF-κBp65沉默组细胞中NF-κBp65蛋白表达水平降低;NF-κBp65沉默后,CNE2细胞周期阻滞于S期,增殖速度减慢;NF-κBp65沉默组裸鼠移植瘤生长慢,重量轻,与阴性对照组和空白对照组比较,差异有统计学意义(F=14.386,P<0.05)。结论 NF-κBp65沉默能降低鼻咽癌CNE2细胞的恶性生物学行为。

磁性纳米复合物对人肝癌细胞增殖能力的影响

目的探讨磁性纳米复合物对人肝细胞癌(肝癌)细胞(Hep G2细胞株)增殖能力的影响。方法以聚乙烯亚胺包被的磁性纳米复合物(PEI-SPIO)作为基因载体复合富含亮氨酸重复单位的G蛋白耦联受体(LGR)5-小干扰RNA(siRNA),待细胞融合达60%时转染Hep G2细胞建立PEI组,等量的单纯LGR5-siRNA转染Hep G2建立SI组,另设未转染对照(Ctrl)组。采用MRI T2扫描检测纳米复合物进入细胞的效率,细胞计数试剂盒(CCK)-8实验检测细胞增殖抑制率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞LGR5的信使核糖核酸(mRNA)表达水平,蛋白印迹法检测LGR5、cyclin D1蛋白表达。结果 PEI组Hep G2细胞的MRI T2信号明显减低。与Ctrl组相比,PEI组Hep G2细胞的细胞增殖抑制率明显升高,LGR5 mRNA的相对表达量和LGR5、cyclin D1蛋白相对表达量均明显降低(均为P<0.05),而SI组细胞的相应指标差异无统计学意义(均为P>0.05)。结论磁性纳米复合物PEI-SPIO复合LGR5-siRNA可有效转染Hep G2细胞,其机制可能是通过下调cyclin D1表达水平抑制人肝癌Hep G2细胞的增殖能力。

HIF-2α基因下调后的诱导多能干细胞移植对大鼠脑缺血损伤治疗作用的影响

目的探讨低氧诱导因子(HIF)-2α基因下调后的诱导多能干细胞(iPSCs)移植对大鼠脑缺血损伤治疗作用的影响。方法 24只雄性SD大鼠随机分为3组(每组8只):iPSCs治疗组、iPSCs+siHIF-2α组,磷酸盐缓冲液(PBS)对照组。所有大鼠均采用大脑中动脉栓塞法制作脑缺血模型,栓塞90 min后进行再灌注。再灌注后3 d进行i PSCs移植、i PSCs+siHIF-2α移植或PBS注射。在移植之前及之后的第2、4周,行神经行为学评价并采用小动物正电子发射体层仪(micro-PET)扫描测定18F-氟代脱氧葡萄糖(18F-FDG)的摄取值。移植后第4周,处死大鼠行免疫荧光检测神经细胞标志物。结果在干细胞移植后第2、4周,i PSCs治疗组的神经功能评分均明显低于PBS对照组(均为P<0.05),而i PSCs+siHIF-2α组的神经功能评分在这两个时间点均高于i PSCs治疗组(均为P<0.05)。在干细胞移植后的第2、4周,与PBS对照组比较,i PSCs治疗组和i PSC+siHIF-2α组脑缺血大鼠脑部的糖代谢水平(损伤侧/正常侧)明显增加(均为P<0.001)。干细胞移植后第2周,i PSCs治疗组大鼠脑缺血区糖代谢水平明显高于iPSCs+siHIF-2α组(P<0.001)。此后iPSCs+siHIF-2α组大鼠脑缺血区糖代谢水平持续上升,至干细胞移植后第4周,与iPSCs治疗组较为接近,但仍低于iPSCs治疗组(P=0.025)。免疫荧光结果提示移植的干细胞存活并迁移至梗死区周边,并且大部分的移植干细胞均表达了神经细胞标志物。结论i PSCs移植对大鼠脑缺血损伤有明显的治疗作用,HIF-2α基因下调对iPSCs的治疗作用有一定的影响。

siRNA对肝癌细胞异常表达FAT10基因的抑制效应研究

目的:探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对原发性肝癌(肝癌)细胞中异常表达的类泛素蛋白FAT10的抑制作用,研究其对肝癌细胞生长的影响。方法:针对FAT10基因设计4条siRNA序列,并转染至人肝癌细胞株Hep3B细胞,通过实时荧光定量PCR检测siRNA对FAT10基因表达的影响,使用四甲基偶氮唑蓝法检测siRNA对Hep3B细胞生长情况的影响,采用流式细胞术分析siRNA对Hep3B细胞周期变化的影响。结果:Hep3B细胞转染siRNA后,FAT10 mRNA表达降低,Hep3B细胞的生长受到了明显的抑制,其生长主要停滞在G0/G1期,而S期和G2/M期细胞所占比例下降。结论:siRNA可抑制Hep3B细胞FAT10基因的表达,并抑制Hep3B细胞的生长。FAT10基因可能是调控肝癌基因表达的新的靶基因。