长链非编码RNA-TUG1调控小梁网细胞内质网应激和炎症的小鼠实验研究

目的观察长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(Lnc-TUG1)对小梁网细胞内质网应激及其主要标志物的影响,并探讨Lnc-TUG1在小梁网功能障碍、细胞凋亡中所起的作用。方法选取C57BL/6J小鼠48只,随机数字表法分为两组,AAV2-Lnc-TUG1组(24只,24眼)单眼前房注射Lnc-TUG1过表达腺病毒,AAV2-GFP组(24只,24眼)单眼前房注射GFP腺病毒。在注射后的不同时间点,分别取AAV2-GFP组和AAV2-Lnc-TUG1组小鼠的前房角组织,用冰冻切片和免疫荧光染色法观察病毒荧光及内质网应激相关蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达;荧光原位杂交法观察Lnc-TUG1的表达和定位。用实时荧光定量PCR法检测炎症因子白细胞介素(IL)-1α、IL-1β、IL-6以及内皮细胞白细胞黏附分子1(ELAM-1)在mRNA水平的表达;用TUNEL染色法观察小梁网细胞的凋亡情况;用超薄切片和透射电镜观察小梁网细胞的超微结构。在注射前及注射后3、7、10、13 d分别用回弹式眼压计测量小鼠的日间及夜间眼压。结果Lnc-TUG1过表达腺病毒在注射后24 h即可观察到注射眼小梁网内的病毒荧光,且AAV2-Lnc-TUG1组的小梁网Lnc-TUG1的表达明显高于AAV2-GFP组,差异有统计学意义(P<0.05)。在注射后3 d,AAV2-Lnc-TUG1组小梁网组织的IL-1α、IL-1β、IL-6、ELAM-1在mRNA水平的表达明显高于AAV2-GFP组,差异有统计学意义(P<0.05)。注射后7 d,与AAV2-GFP组比,AAV2-GFP组和AAV2-Lnc-TUG1组小梁网组织CHOP的表达上调,差异有统计学意义(P<0.05),且小梁网TUNEL阳性细胞数显著增加,小梁网细胞内可见明显扩张的粗面内质网。在注射后7、10、13 d,AAV2-Lnc-TUG1组日间眼压及夜间眼压均高于AAV2-GFP组,但仅术后7 d的差异有统计学意义(P<0.05)。结论单眼前房注射Lnc-TUG1过表达腺病毒可通过上调Lnc-TUG1的表达增加小鼠眼压,并促进小梁网细胞的内质网应激、炎症和细胞凋亡。

miR-181a靶向沉默信息调节因子相关酶1在过氧化氢诱导的人小梁网细胞氧化应激中的调节作用

目的探讨miR-181a对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的人小梁网细胞(HTMCs)氧化应激的调节作用及其机制。方法HTMCs随机分为空白组(0μmol·L^(-1)H_(2)O_(2))、200μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)组、400μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)组、600μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)组,分别使用相应浓度H_(2)O_(2)处理HTMCs,24 h后MTT法检测各组细胞存活率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞miR-181a mRNA表达,Western blot检测各组细胞中沉默信息调节因子相关酶1(SIRT1)蛋白表达。根据转染物的不同分为miR-181a inhibitor组、miR-181a NC组、miR-181a mimics组、miR-181a inhibitor+si-SIRT1组和miR-181a inhibitor+si-NC组,使用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测各组细胞内活性氧(ROS)含量,使用超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)ELISA试剂盒检测各组细胞SOD和MDA活性,使用Annexin V FITC/PI联合流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测各组细胞中SIRT1蛋白表达,双荧光素酶报告基因实验对靶点进行验证。结果与空白组比较,200μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)组、400μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)组、600μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)组细胞存活率均降低(均为P<0.05)。细胞miR-181a mRNA的表达随着H_(2)O_(2)浓度的增加而增加,SIRT1蛋白的表达随着H_(2)O_(2)浓度的增加而降低(均为P<0.05)。与miR-181a NC组比较,miR-181a mimics组细胞凋亡率、MDA活性和ROS含量均升高,细胞SOD活性、SIRT1蛋白表达均降低,miR-181a inhibitor组细胞凋亡率、MDA活性和ROS含量均降低,细胞SOD活性、SIRT1蛋白表达均升高(均为P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-181a靶向抑制SIRT1蛋白的表达。与miR-181a inhibitor+si-NC组比较,miR-181a inhibitor+si-SIRT1组细胞凋亡率、MDA活性和ROS含量均升高,SOD活性降低(均为P<0.05)。结论miR-181a可能通过靶向SIRT1调节H_(2)O_(2)诱导的HTMCs氧化应激作用。

花生四氢酸氨基乙醇对体外培养的牛眼小梁网细胞基质金属蛋白酶-3和基质金属蛋白酶抑制剂-1表达的影响

目的观察花生四氢酸氨基乙醇(AEA)对体外培养的牛眼小梁网细胞基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)表达的影响。方法对牛眼小梁网细胞进行原代及传代培养,并进行鉴定。对传3代的牛眼小梁网细胞分别施加AEA浓度为0.0、0.1、1.0、10.0μmol·L-1的无血清培养液,作用24 h后提取细胞上清液,并制备10.0μmol·L-1作用6、12、18、24 h的细胞上清液,用酶联免疫吸附测定法检测AEA作用后细胞上清液中MMP-3及TIMP-1水平的变化。结果随着AEA浓度的增加,MMP-3及TIMP-1水平均逐渐增加,并呈剂量依赖性(P<0.05)。10.0μmol·L-1AEA作用6、12、18、24 h后的MMP-3、TIMP-1水平均高于0.0μmol·L-1组(P<0.05),且MMP-3、TIMP-1水平随着作用时间的延长逐渐增加,各时间点之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论AEA可以促进MMP-3的分泌,早期AEA可以抑制TIMP-1的分泌,进一步打破MMP-3及TIMP-1的平衡,影响细胞外基质的降解,从而起到降低眼压的作用。

可溶性CD44分子对人眼小梁网细胞凋亡调节蛋白bcl-2相关死亡因子bad表达的影响

背景研究表明可溶性CD44分子（sCD44）在原发性开角型青光眼（POAG）患者眼中的质量浓度高于正常人，POAG患者房水中sCD44水平与小梁网细胞凋亡相关蛋白的表达是否有关及其对POAG的共同作用机制至今尚不明确。目的探讨不同质量浓度的sCD44对POAG患者小梁网细胞凋亡调节蛋白bcl-2相关死亡因子bad表达的影响。方法收集POAG患者行小梁切除术中切除的小梁网组织，采用组织块培养法原代培养小梁网细胞，并用免疫细胞化学法对培养细胞进行鉴定，将第3代的小梁网细胞按随机数字表法随机分为6个组，分别在无血清培养基中加入含终质量浓度为0（对照组）、1、5、10、25、50μg／L的sCD44，培养细胞48h。采用细胞计数试剂8（CCK-8）法和ELISA法检测小梁网细胞中凋亡调节蛋白bcl-2相关死亡因子bad蛋白的表达。结果培养的细胞经层黏连蛋白（LM）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）单克隆抗体、纤维连接蛋白（FN）免疫组织化学染色呈阳性反应。CCK-8法检测0、1、5、10、25、50μg／LsCD44作用48h后小梁网细胞吸光度（A450）值分别为：0．2460±0．0019、0．1874±0．0015、0．1570±0．0016、0．1302±0．0019、0．1084±0．0018、0．0940±O．0020，差异有统计学意义（F=14．922，P=0．000），各实验组A450值均低于对照组，差异均有统计学意义（P=0．013、0．008、0．011、0．005、0．004）。ELISA法检测表明，0、1、5、10、25、50p^g／LsCD44作用48h后小梁网细胞中bad蛋白质量浓度分别为（114．8461±2．9560）、（137．8270±2．4259）、（161．4194±3．7381）、（170．9453±3．2006）、（221．2252±4．3738）、（324．6167±4．4220）ng／L，差异有统计学意义（F=16．610，P=0．000），各实验组小梁网细胞中bad蛋白质量浓度均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P=0．017、0．013、0．008、0．007、0．006）。结论sCD44在一定质量浓度范围内可促进POAG小梁网细胞的凋亡，并且能上调凋亡调节蛋白bel-2相关死亡因子bad蛋白的表达。

内皮素-1对体外培养人小梁网细胞纤维连接蛋白及Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察内皮素-1(ET-1)对人小梁网细胞(TMCs)细胞外基质纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(COLI)的影响。方法取死亡24h内尸眼小梁网组织,行TMCs原代和传代培养,并用FN、层黏连蛋白(LN)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和Ⅷ因子相关抗原(FⅧRAg)鉴定为人TMCs后,取传3代的人TMCs,给予不同浓度ET-1(10-9、10-8、10-7mol/L)孵育72h后,免疫荧光和Westernblot观察ET-1对TMCs中FN、COLI表达的影响;然后取传3代的人TMCs,分别给予10-7mol/LET-1、10-7mol/LET-1+10-7mol/LETA受体拮抗剂、10-7mol/LET-1+10-7mol/LETB受体拮抗剂后孵育72h,Westernblot观察ET受体拮抗剂对FN、COLI表达的影响。结果研究受到伦理委员会的批准,取材前征得供体家属的知情同意。培养的细胞形态多样,含少许色素颗粒,FN、LN、NSE染色均呈阳性反应,FⅧRAg呈阴性反应。人TMCs与10-9～10-7mol/LET-1共孵育后FN表达上调(F=18.41,P<0.05);与10-8mol/L、10-7mol/LET-1共孵育后COLI表达上调(F=39.81,P<0.05),并呈浓度依赖性,10-7mol/L时作用最明显;给予ETA受体拮抗剂后,与ET-1组相比,FN、COLI的表达均降低(qFN=7.213,P<0.05;qCOLI=6.187,P<0.05),但给予ETB受体拮抗剂后,FN、COLI的表达均无明显变化。结论 ET-1能够促进体外培养的人TMCs中FN、COLI的表达,其机制可能是通过激动ETA受体而非ETB受体发挥作用的。

原花青素对氧化应激人眼小梁网细胞凋亡及细胞色素C释放的影响

目的研究原花青素对H2O2诱导人眼小梁网细胞(human trabecular meshwork cells,HTMC)凋亡及细胞色素C释放的影响。方法将HTMC进行传代后随机分为5组。未处理组:正常培养的HTMC;对照组:正常培养的HTMC+H_2O_2(500μmol·L^(-1)处理1 h);3个浓度的原花青素组:正常培养的HTMC+H_2O_2(500μmol·L^(-1)处理1 h)+原花青素(浓度分别为0.02 g·L^(-1)、0.05 g·L^(-1)、0.10 g·L^(-1))。使用Annexin V-FITC检测细胞凋亡情况,Western blot检测HTMC胞浆细胞色素C含量。结果与未处理组相比,对照组及各原花青素组细胞凋亡率均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。与对照组相比,各原花青素组细胞凋亡率均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.01);不同浓度原花青素组间随原花青素浓度增加细胞凋亡率下降,各原花青素组间差异均有统计学意义(均为P<0.01)。与未处理组相比,对照组以及0.02 g·L^(-1)和0.05 g·L^(-1)原花青素组细胞色素C的释放均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.01);而0.10 g·L^(-1)原花青素组与未处理组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,各原花青素组细胞色素C释放均减少,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。不同浓度原花青素组间随原花青素浓度增加细胞色素C的释放减少,各组间差异均有统计学意义(均为P<0.01)。结论外源性原花青素可以降低氧化应激HTMC的凋亡率,减少细胞色素C的释放,有较强的抗氧化作用,并在一定浓度范围内随着浓度的增加其抗氧化作用逐渐增强。

嘌呤受体P2X7在人眼小梁网细胞上的表达及分布

目的探讨嘌呤受体P2X7在体外培养正常人眼小梁网细胞上的表达及分布。方法体外培养、鉴定正常人眼小梁网细胞,利用RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法分别检测正常人眼小梁网细胞上P2X7受体mRNA和蛋白的表达情况及受体蛋白的主要分布部位。结果光镜下观察原代培养的细胞具有人眼小梁网细胞的典型形态;免疫组织化学方法检测结果表明,培养的细胞纤维连接蛋白、层粘连蛋白、神经元特异性烯醇化酶及波形蛋白染色阳性,第Ⅷ因子染色阴性,鉴定为人眼小梁网细胞;RT-PCR扩增到了P2X7mRNA 152 bp大小的基因片段,Western-blot得到了相对分子质量约为74 000的P2X7的蛋白条带,免疫荧光法证实P2X7受体在小梁网细胞膜、细胞质及细胞核内均有广泛分布。结论人眼小梁网细胞上有P2X7受体表达,其在细胞内分布广泛。

叔丁基过氧化氢诱导小梁网细胞氧化应激模型的建立

目的体外建立叔丁基过氧化氢小梁网细胞氧化应激模型。方法应用t BHP刺激体外培养的小梁网细胞(i HTM)后,观察小梁网细胞形态学的改变,分别用MTT法检测氧化损伤后小梁细胞的活性,流式细胞术检测活性氧水平,SucLLVY-荧光底物检测糜蛋白酶样蛋白酶体的活性,流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测小梁细胞的凋亡。结果正常培养的小梁细胞呈梭形,折光性好,贴壁较牢;应用t BHP刺激后,部分细胞变圆、脱落、皱缩,小梁细胞的细胞活性明显下降,活性氧水平升高,糜蛋白酶样蛋白酶体活性降低,细胞凋亡水平明显增加。随着刺激时间的延长,上述改变更为明显。结论 t BHP刺激后,小梁网细胞出现典型的氧化应激改变,t BHP刺激小梁网模型的建立可应用于青光眼氧化应激的研究。

家兔高眼压模型小梁网细胞p53基因表达的检测

目的 检测高眼压状态下不同时间家兔高眼压模型小梁网细胞 p5 3基因的表达。方法 家兔 30只 ,任选 1眼作实验 ,另眼对照。 2 %甲基纤维素 0 .2 0～ 0 .2 5 m l前房注射制做高眼压模型 ,根据高眼压持续时间不同对动物进行分组 (10天、2 0天、30天各为一组 ) ,分期取材、石蜡切片、免疫组化染色检测 p5 3基因的表达情况。光学显微镜下对小梁网细胞凋亡情况进行定量分析。结果 凋亡高低依次为 :10天组 >2 0天组 >30天组 =对照组。结论 在眼压急速升高的模型眼中 ,小梁网细胞有凋亡现象 ,而且凋亡主要发生在实验的早期 ,随着高眼压持续时间的延长 ,小梁网细胞大量死亡 ,凋亡处于相对静止状态。

纤维连接蛋白对原发性开角型青光眼小梁网细胞整合素α4β1表达的影响

目的探讨纤维连接蛋白(FN)对体外培养的原发性开角型青光眼(POAG)患者小梁网细胞整合素α4β1表达及细胞存活的影响。方法对照实验研究,体外培养POAG患者小梁网细胞,分别加入不同浓度的FN培养。采用免疫细胞化学法观察各组细胞整合素α4β1的表达及细胞存活情况。结果随着FN浓度增加,整合素α4β1表达增强;在FN低浓度范围内阳性细胞面积增多。结论 FN影响小梁网细胞肌动蛋白骨架及其细胞连接,改变来参与房水流出的调节过程。

葡萄糖调节蛋白GRP78在小梁网细胞中的表达及临床意义

目的检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在体外培养的正常人小梁网细胞(NTM)及原发性开角型青光眼(POAG)患者小梁网细胞(GTM)中蛋白及m RNA表达差异及临床意义。方法将体外培养的NTM及GTM细胞分为衣霉素(Tm)组、十字孢碱(STS)组及对照组,采用Real-time PCR、Western blot方法检测药物处理6、24 h后小梁网细胞中GRP78 m RNA及蛋白表达。结果原代培养的GTM细胞中GRP78表达水平明显低于NTM细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。Tm可增加NTM、GTM细胞中GRP78的表达,但后者的增高水平明显低于前者,差异有统计学意义(P<0.05)。GTM细胞对STS的反应大于NTM细胞。结论 POAG患者小梁网细胞对内质网应激反应能力低下,GRP78表达明显下调,对损伤性刺激的敏感性增强,提示GRP78蛋白可能在内质网应激诱导产生的小梁细胞凋亡中起保护作用。

嘌呤受体P2X_7在正常人眼和开角型青光眼患者小梁网细胞上的表达对比研究

目的探讨嘌呤受体P2X7在体外培养正常人眼小梁网细胞(NTMC)及开角型青光眼(POAG)患者小梁网细胞(PTMC)上的表达差异。方法体外培养、鉴定2种人眼小梁网细胞,利用实时荧光定量PCR和Westernblot方法分别检测2种小梁网细胞上P2X_7受体基因和蛋白的表达差异。结果形态学和免疫学方法成功鉴定了体外培养的2种人眼小梁网细胞;实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和Westernblot证实正常人和POAG患者小梁网细胞上均有P2X7受体的基因和蛋白表达,且后者表达较前者增高。结论 POAG患者小梁网细胞上的P2X7受体表达较正常人眼小梁网细胞增高。P2X_7受体在小梁网细胞上的作用值得进一步研究。

氧化应激条件下miR-21对人眼小梁网细胞胞外基质蛋白表达的影响

目的探讨氧化应激条件下miR-21对人眼小梁网细胞(human trabecular meshwork cells,HTMCs)胞外基质蛋白表达的影响。方法用不同浓度H_2O_2(0μmol·L^(-1)、200μmol·L^(-1)、400μmol·L^(-1)、600μmol·L^(-1))刺激HTMCs 1 h,MTT法检测其对HTMCs活力的影响,从而确定后续实验所需H_2O_2浓度。随后将细胞分成正常组和H_2O_2组,Real-time PCR检测miR-21的表达,Western blot检测胞外基质蛋白(纤维连接蛋白和胶原蛋白I)的表达。然后将细胞分成5组:H_2O_2组(只用H_2O_2处理)、miR-21干预组(H_2O_2+miR-21模拟物)、miR-21对照组(H_2O_2+miR-21对照模拟物)、miR-21抑制组(H_2O_2+miR-21抑制剂)和miR-21抑制对照组(H_2O_2+miR-21抑制剂对照物),Real-time PCR检测miR-21、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β2和PTEN mRNA表达,Western blot检测胞外基质蛋白、TGF-β2和PTEN蛋白表达。最后将细胞分成3组:H_2O_2组(只用H_2O_2处理)、PTEN干扰组(H_2O_2+PTEN siRNA)和干扰对照组(H_2O_2+control siRNA),检测PTEN、胞外基质蛋白和TGF-β2蛋白水平表达。结果当H_2O_2浓度≥400μmol·L^(-1)时,可显著抑制HTMCs的活性,后续实验选择此浓度。与正常组相比,H_2O_2组中miR-21、纤维连接蛋白和胶原蛋白I的表达均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。检测氧化应激条件下miR-21对胞外基质蛋白、TGF-β2和PTEN表达的影响,发现与H_2O_2组相比,miR-21对照组和miR-21抑制对照组中miR-21、纤维连接蛋白与胶原蛋白I蛋白水平表达以及TGF-β2和PTEN mRNA及蛋白水平表达差异均无统计学意义(均为P>0.05);与miR-21对照组相比,miR-21干预组miR-21、纤维连接蛋白和胶原蛋白I蛋白水平及TGF-β2 mRNA和蛋白水平表达均增加,PTEN蛋白水平表达降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05),而PTEN mRNA表达差异均无统计学意义(均为P>0.05);与miR-21抑制对照组相比,miR-21抑制组miR-21、纤维连接蛋白和胶原蛋白I蛋白水平及TGF-β2 mRNA和蛋白水平表达均降低,PTEN蛋白水平表达增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05),而PTEN mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。采用Western blot检测氧化应激条件下PTEN对TGF-β2和胞外基质蛋白表达的影响,发现与H_2O_2组相比,干扰对照组PTEN、TGF-β2、纤维连接蛋白和胶原蛋白I的表达差异均无统计学意义(均为P>0.05);与干扰对照组相比,PTEN干扰组PTEN的表达下调,TGF-β2、纤维连接蛋白和胶原蛋白I的表达均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论氧化应激条件下miR-21可增加HTMCs胞外基质产物,这可能与其靶向沉默PTEN基因,调节TGF-β2的表达相关。

叉头框转录因子F2小发夹RNA对人眼小梁网细胞外基质蛋白表达的抑制作用

目的探讨叉头框转录因子F2(FoxF2)对小梁网细胞外基质表达的调控作用。方法将培养人眼小梁网细胞(HTMCs)分为Scramble对照组和FoxF2小发夹RNA(shRNA)组,构建FoxF2重组干扰载体FoxF2 shRNA,应用FoxF2 shRNA慢病毒颗粒感染HTMCs,采用Western blot法检测FoxF2 shRNA的敲低效果及细胞外基质(ECM)蛋白的表达变化,利用Transwell计数实验分析HTMCs的迁移能力。结果体外培养的HTMCs呈长梭形,生长状态良好,形态符合HTMCs形态学特征。FoxF2 shRNA组FoxF2蛋白相对表达量为0.72±0.02,显著低于Scramble对照组的1.27±0.05,差异有统计学意义(t=16.68,P<0.01)。FoxF2shRNA组纤连蛋白(FN)、Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)相对表达量分别为0.43±0.03、0.53±0.08和0.86±0.15,显著低于Scramble对照组的0.87±0.04、1.66±0.06和1.73±0.13,差异均有统计学意义(t=15.08、18.81、7.50,均P<0.01)。FoxF2 shRNA组HTMCs的迁移数量为117.30±11.41,显著低于Scramble对照组的251.00±10.37,差异有统计学意义(t=8.72,P<0.01)。结论成功制备可特异性敲低HTMCs内源性FoxF2表达的FoxF2 shRNA病毒,并证实FoxF2干扰对HTMCs中ECM的表达及细胞迁移具有抑制作用。

机械牵张力下大鼠小梁网细胞的差异蛋白组学及生物信息学分析

目的研究机械牵张作用对大鼠小梁网细胞蛋白组学的表达影响。方法实验对象选用对数生长期的大鼠小梁网细胞。采用FX-5000牵张应力加载系统拉伸细胞,提取细胞全蛋白后进行基于鸟枪法的质谱测试和蛋白质的鉴定。运用微阵列显著性分析(significance analysis of microarray,SAM)方法分析实验组和对照组的蛋白组学差异;对差异蛋白进行基于Gene Ontology(GO)的功能注释、富集和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集并筛选出显著富集的蛋白。结果 SAM法筛选出差异蛋白共计57种,均表达上调,分布在细胞各个区域,参与细胞发育、免疫调节、刺激反应、代谢、细胞黏附等过程。其中24种显著富集在9个隶属生物学过程的GO term中,进一步KEGG通路富集分析显示热休克蛋白和核糖体蛋白显著富集在内质网蛋白加工通路和核糖体通路中。结论机械牵张对大鼠小梁网细胞的蛋白质表达影响区域广,过程复杂。富集分析说明热休克蛋白和核糖体蛋白在牵张刺激下的应答保护和眼压调控中起到了重要作用。

小梁网细胞氧化应激在青光眼发病中的研究进展

青光眼是一种常见的不可逆性致盲眼病,病理性眼压升高为主要临床特征。眼压的形成与房水循环密切相关,房水动力学异常,会引起病理性眼压升高。小梁网是房水外流通道的主要组成部分,对维持正常眼压起到非常关键的作用。氧化应激是导致青光眼眼压升高的直接危险因素,表现为氧化与抗氧化作用的失衡。小梁网细胞氧化应激可能导致细胞外基质的沉积与退行性变,使细胞发生自噬和衰老,造成小梁网细胞功能障碍,最终导致房水外流阻力增大,引起病理性眼压升高。本文将针对小梁网细胞氧化应激与青光眼关系的研究进展进行综述,以期为进一步的临床研究提供依据,为探讨青光眼的发病机制、预防及治疗青光眼提供参考。

SIRT1对氧化应激下人小梁网细胞功能的影响

目的:通过在人小梁网细胞(human trabecular meshwork cell,HTMC)中过表达沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulator 1,SIRT1),探讨SIRT1对氧化应激下HTMC功能的影响。方法:将SIRT1过表达慢病毒和GFP阴性对照慢病毒按照最佳(multiplicity of infection,MOI)分别转染入HTMC,并用实时定量PCR法对SIRT1是否在细胞中过表达进行验证。实验分为以下4组:正常组、H2O2组、H2O2+Lv-SIRT1-OE(过表达)组、H2O2+Lv-GFP组,分别采用Transwell法和CCK8法检测氧化应激下HTMC的迁移能力和活性。两组间比较采用独立样本t检验。结果:在正常组、H2O2组、H2O2+Lv-SIRT1-OE组、H2O2+Lv-GFP组这4组中,Transwell实验结果分别为436±73、254±25、510±51、327±46,H2O2+Lv-SIRT1-OE组分别与H2O2组和H2O2+Lv-GFP组差异均有统计学意义(P<0.01)。CCK8法结果显示,H2O2+Lv-SIRT1-OE组分别与H2O2组和H2O2+Lv-GFP组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。H2O2+Lv-SIRT1-OE组分别与H2O2组和阴性对照组(H2O2+Lv-GFP)相比,Bax表达水平明显下降,Bcl-2表达水平明显提高,差异均有统计学意义(P<0.01)。ROS活性氧测定显示H2O2+Lv-SIRT1-OE组比H2O2组的细胞活性氧水平显著降低(P<0.05)。结论:在HTMC中过表达SIRT1能有效降低氧化应激对HTMC迁移能力和活性的影响,从而对HTMC起到一定的保护作用,为后续研究SIRT1保护氧化应激下HTMC的调控机制打下基础。

钙敏感受体在高糖诱导的人眼小梁网细胞损伤中的作用

目的:观察钙敏感受体(CaSR)在高糖(HG)诱导的人眼小梁网细胞(HTMC)损伤中的作用和机制。方法:将HTMC随机分为:对照(control)组(10%胎牛血清-DMEM)、HG组(10%胎牛血清-DMEM+50 mmol/L葡萄糖)、HG+CaSR激动剂NPS R568组(10%胎牛血清-DMEM+50 mmol/L葡萄糖+10μmol/L NPS R568)和HG+CaSR抑制剂Calhex231组(10%胎牛血清-DMEM+50 mmol/L葡萄糖+3μmol/L Calhex231),培养72 h。CCK-8法测量不同浓度的葡萄糖刺激下HTMC活力;试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;Western blot检测CaSR、SOD2、凋亡相关蛋白(cleaved caspase-3和Bcl-2)及自噬相关蛋白(ATG7、P62、LC3-I和LC3-Ⅱ)表达;免疫荧光染色观察CaSR细胞定位和表达。结果:葡萄糖浓度为50 mmol/L时,HTMC相对活力由1.00±0.03下降至0.60±0.07(P<0.05);与control组相比,HG使HTMC中CaSR、cleaved caspase-3和P62表达以及MDA含量增加(P<0.05),而SOD活性,SOD2、Bcl-2和ATG7表达,以及LC3-Ⅱ/LC3-I比值下降(P<0.05);NPS R568进一步促进HG诱导的细胞损伤,而Calhex231可减轻上述变化(P<0.05)。结论:CaSR表达参与HG诱导的HTMC损伤,其机制与促进细胞凋亡和氧化应激以及抑制自噬有关。

细胞外钙离子内流上调原发性开角型青光眼患者小梁网细胞Copine1表达的研究

目的探讨原发性开角型青光眼患者(primary open-angle glaucoma,POAG)小梁网细胞外钙离子内流对膜蛋白copine1表达的影响。方法原代培养POAG患者小梁网细胞,应用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度,所用钙离子荧光探针为Fluo 3-AM;;应用钙离子运载剂A23187增加细胞内钙离子浓度;;应用Real-time PCR检测小梁网细胞内钙离子浓度增加前后copine1在转录水平的表达。结果经免疫组织化学鉴定培养的细胞为小梁网细胞。荧光显微镜下观察与流式细胞仪定量结果均显示,应用钙离子运载剂A23187增加了POAG患者小梁网细胞内的钙离子浓度。Real-time PCR检测证实A23187的应用使copine1 mRNA在小梁网细胞中表达增加了(1.8±0.3)倍。结论 POAG患者小梁网细胞内钙离子浓度增高可引起copine1在转录水平表达的上调,copine1在小梁网细胞中的功能研究将会增加对POAG病理学机制的理解,有助于新药物靶点的开发。

miR-17-5p对小梁网细胞外基质蛋白表达的调控作用及其机制

目的探讨miR-17-5p对小梁网细胞外基质(ECM)蛋白表达的调控作用及其机制。方法收集原发性开角型青光眼(POAG)患者和正常小梁网组织,利用RT-PCR和Western blot分别检测miR-17-5p和Smad3表达;将人小梁网细胞(HTMCs)分为miR-17-5p mimics和miR-17-5p NC组,分别转染载有miR-17-5p mimics组和miR-17-5p NC的载体,Western blot检测HTMCs中ECM蛋白纤连蛋白(FN)、胶原蛋白I(CoL-I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;靶基因预测库预测miR-17-5p靶基因,荧光素酶报告载体联合Western blot鉴定靶基因。HTMCs中共转染miR-17-5p mimics和Smad3过表达载体,Western blot检测各转染组细胞中Smad3、FN、CoL-I、α-SMA的蛋白表达。结果正常小梁网组织中miR-17-5p表达量为1.16±0.11,高于POAG小梁网组织的0.19±0.04,差异有统计学意义(t=10.641,P<0.001);正常小梁网组织中Smad3蛋白表达量为0.31±0.06,低于POAG小梁网组织的0.86±0.07,差异有统计学意义(t=8.105,P<0.001)。miR-17-5p mimics组HTMCs中FN、CoL-I和α-SMA蛋白表达均低于miR-17-5p NC组,差异均有统计学意义(均为P<0.001);靶基因预测库预测及荧光素酶报告载体联合Western blot鉴定证实Smad3为miR-17-5p下游靶基因;miR-17-5p+Smad3转染组HTMCs中Smad3、FN、CoL-I和α-SMA蛋白表达均高于miR-17-5p+vector转染组,差异均有统计学意义(均为P<0.001)。结论miR-17-5p能抑制HTMCs的ECM蛋白表达,这一过程可能是通过靶向抑制Smad3表达而实现的。