侵染南瓜的小西葫芦黄化花叶病毒的分离与鉴定

1999年秋在杭州一株表现典型黄化花叶的南瓜(Cucuribita moschata)上分离获得一株线状病毒HZ00s1.该病毒分离物在葫芦科作物(Cucuribitaceae)上引起系统症状.经寄主反应测定、病毒形态学和寄主组织病变观察,初步确定该病毒为小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV).对ZYMV杭州分离物(HZ00s1)的外壳蛋白序列及3’端非编码区进行了克隆及序列测定,并与ZYMV Conneticut分离物、Florida分离物、California分离物以及WMV2 Tonga分离物进行了同源性分析.结果显示:HZ00s1分离物与其它3种ZYMV分离物CP基因核酸序列同源性为93％～94％,而与WMV2 Tonga分离物的同源性仅为67％,来自美国的3种ZYMV分离物之间的同源性高达95％～99％.HZ00s1分离物与其它3个ZYMV分离物CP氨基酸序列同源性在95％～98％之间.因此确定在杭州地区葫芦科作物上有ZYMV的发生.

桃蚜可高效率地传播小西葫芦黄化花叶病毒新疆株

研究了桃蚜传播小西葫芦黄化花叶病毒新疆株的规律 ,结果表明 ,无毒蚜虫能够获毒的最短取食时间为 30s,获毒率随取食时间的延长而提高 ,取食时间为 70s以上时 ,获毒率达10 0 % ;带毒蚜虫传毒的最短取食时间为 0 .2 5h ,当取食时间超过最短传毒时间时 ,传毒率随取食时间的增加而升高 ,取食时间达 2h以上时 ,传毒率达 10 0 % ;带毒蚜虫能够传毒的最少头数为 1头 ,传毒率随单株植物带毒蚜虫数目的增加而升高 ,单株虫量达 15头以上时 ,传毒率达 10 0 % .

小西葫芦黄化花叶病毒分离物的3′末端序列多态性研究

研究了来自中国大陆 9个小西葫芦黄化花叶病毒 (ZYMV)分离物的基因组 3′末端核苷酸序列及所推导的外壳蛋白 (CP)氨基酸序列以及 3′末端非编码区 (UTR)序列 ,并与其它地区所报道的 1 6个ZMYV分离物进行了同源性比较。ZYMVCP基因核苷酸序列具有一定的寄主相关性和地域相关性 ,但总体上其关联程度不明显 ;同时 ,CP氨基酸序列的寄主适应性程度明显高于地域相关性。 2 5个ZYMV分离物的CP氨基酸序列根据其变异程度分为 2个区 :N端约 41个氨基酸为高度变异区 ,CP核心区和C端氨基酸序列为保守区。研究结果初步揭示了ZYMV作为单链RNA病毒通过与寄主相互作用而表现寄主适应性变异的趋势。

新疆小西葫芦黄化花叶病毒的分子鉴定与序列分析

在新疆石河子地区采集具有黄化、花叶和疱斑等症状的多种葫芦科作物,分别提取总RNA,利用小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)特异性引物进行RT-PCR扩增,其中来自黄瓜、甜瓜和丝瓜的模板RNA上可以得到1185bp片段。将扩增得到的片段克隆到pMD18-T上,序列分析结果表明:该片段含有1185个核苷酸,包含完整CP基因。与ZYMV Florida分离物、California、韩国KR-PA分离物、新加坡S及中国北京CH-BJ等GenBank报道的7个不同地域、不同种寄主植物上的分离物序列进行同源性分析的结果显示:ZYMV新疆分离物的CP基因核苷酸与其它11种ZYMV分离物的同源性高达99.42%,氨基酸序列同源性高达98.48%;新疆5个来源于不同寄主植物的ZYMV,不存在明显的遗传变异性,同源性高达97%,而与北京CH-BJ,Reunion和Singapore分离物相比存在较大差异,说明ZYMV地域的相关性要大于寄主上相关性。

罗汉果种子传播小西葫芦黄化花叶病毒的检测

为了解小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaicvirus,ZYMV)是否能通过罗汉果种子传播。本研究通过取ZYMV阳性的罹病罗汉果植株种子700粒,400粒直接播种于防虫网室中,300粒经表面消毒处理后播种于MS培养基上。最终获得213棵罗汉果实生苗。对所获得实生苗进行生物学鉴定及ZYMV特异性RT-PCR检测,均未检测到ZYMV阳性植株。结果表明ZYMV不能经罗汉果种子传播,或其传播率很低。

小西葫芦黄化花叶病毒罗汉果分离株抗血清的制备和应用

将分离自罗汉果(Siraitia grosvenorii)的小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV-LHG)在西葫芦上繁殖,利用差速离心法与PEG沉淀法相结合提纯病毒粒子,用于免疫新西兰大白兔,成功制备出效价为1∶10 240的抗血清。分别用健康西葫芦叶片总蛋白及健康西葫芦叶片汁液吸附处理抗血清,比较2种处理后抗血清背景反应,以健康西葫芦汁液吸附法较佳。用间接ELISA对罗汉果果园及附近共46个科114种植物进行检测,其中9个科25种植物有阳性反应,以葫芦科、苋科、豆科、锦葵科等阳性率较高。田间病毒病发病率调查表明,宿根苗发病率比组培苗高,发病时间更早,是田间罗汉果病毒病的主要初侵染来源之一。

小西葫芦黄化花叶病毒流行特征及防治策略

小西葫芦黄化花叶病毒 (ZYMV)主要通过蚜虫以非持久性方式传播 ,能侵染葫芦科、豆科等 9科植物 ,近年来发现该病毒的发生危害有加重的趋势。通过对杭州地区该病毒的调查 ,描述了ZYMV的发生和流行特征 ,介绍了依靠农业措施及化学、生物等手段控制病害的防治策略。

西瓜花叶病毒西葫芦分离物的基因组及其侵染性克隆

西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus,WMV)是危害瓜类作物的一种主要病毒,笔者分析了西葫芦分离物CH99/69的基因组序列和分子变异,构建了具有侵染性的全长cDNA克隆。结果显示,CH99/69分离物基因组全长为10047 nt,与其他分离物的全基因组核苷酸、多聚蛋白核苷酸和多聚蛋白氨基酸的序列一致性分别为81.40%~94.80%、81.40%~94.70%、88.40%~97.20%。基于全基因组序列的系统进化分析显示,CH99/69与中国的Urumqi火参果分离物、WMV-WS西葫芦分离物和法国的WMV-Fr西葫芦分离物亲缘关系较近,它们均聚于Ⅰ组中,而与中国的WMV-Pg人参分离物、WMV-GZca臭椿分离物、hollyhock蜀葵分离物亲缘关系最远。接种试验显示,CH99/69分离物的克隆具有侵染性,能系统侵染甜瓜、西瓜、西葫芦和瓠瓜,经接种产生的病毒后代能够通过摩擦接种进行侵染。

柑橘黄化花叶病毒的实时定量PCR检测及其在寄主植株中的时空分布规律

【背景】柑橘黄化花叶病毒(citrus yellow mosaic virus,CYMV)是首先发现于印度并对其柑橘产业造成严重危害的一种杆状DNA病毒。目前,CYMV已被美国、日本、新西兰、欧洲和地中海地区列入检疫性有害生物名单,具有传入我国的潜在风险。【目的】建立CYMV的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测体系;筛选CYMV敏感柑橘品种;明确CYMV在寄主植株中的时空分布规律,为该病毒的监控提供技术支持。【方法】根据NCBI中CYMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因保守序列,利用软件Primer Premier 5设计qPCR检测引物8对,通过常规PCR筛选扩增效果好、特异性强的引物。通过对引物浓度、退火温度等反应条件优化,建立CYMV的qPCR检测体系,并进一步通过对不同柑橘病原的检测评价所建体系的特异性;以梯度稀释的1.98×109—1.98 copies/μL的质粒标准品平行进行常规PCR及qPCR检测,评价所建方法的灵敏度;随机采集田间柑橘样品,平行进行常规PCR及qPCR检测,评价所建方法的适用性。将CYMV接种到玉环柚(Citrus grandis)、强德勒柚(C.grandis)、22号枳(Poncirus trifoliata)等15个柑橘品种,进行症状观察和分子检测以筛选敏感指示植物。在接种后不同时间,分别自MV甜橙(C.sinensis)植株不同组织部位取样,以柑橘生长因子1α基因为内参基因,利用所建体系进行qPCR检测,从而明确CYMV在寄主植株中的时空分布规律。【结果】建立了CYMV的qPCR检测体系,其最佳引物为CYMV-qF7/R7,最佳引物浓度为200 nmol·L^(-1),最佳退火温度为63℃。该检测体系的特异性强,检测灵敏度是常规PCR的1000倍。对来自不同地区的660个田间柑橘样品的检测结果表明,qPCR检测与常规PCR检测结果一致,除阳性对照外均未检测到CYMV阳性植株。不同柑橘品种接种试验结果表明,15个柑橘品种中,玉环柚和强德勒柚最早表现出强烈的黄化花叶典型侵染症状,可以作为敏感指示植物。qPCR检测结果表明,老叶中的CYMV滴度最高,老皮和根病毒滴度较高,嫩皮中的滴度较低。CYMV在植株中的相对含量,7—9月最高,此后逐月下降,并在次年1月达到最低值,从次年2月开始,CYMV的相对含量开始上升,与环境温度变化趋势一致。【结论】建立了特异性强、灵敏度高的CYMV实时荧光定量PCR检测方法,利用该方法明确了CYMV在寄主植株中的时空分布规律。此外,玉环柚和强德勒柚可作为CYMV敏感指示植物。

西瓜花叶病毒和小西葫芦黄花叶病毒复合侵染南瓜的透射电镜诊断

应用透射电镜和RT？PCR技术对浙江龙游的南瓜黄化花叶病株进行病原诊断，电镜负染色观察到病株汁液中存在大量线状病毒粒子，超薄切片观察到病叶细胞质中存在III型、Ⅳ型两种类型的风轮状内含体，细胞质中膜结构增生形成许多小泡结构，叶绿体产生周边空泡。用西瓜花叶病毒（ WMV）和小西葫芦黄花叶病毒（ ZYMV）特异性引物扩增到622 bp和696 bp目的片段，序列测定发现与WMV和ZYMV 同源性分别为88％～95％、93％～99％。根据以上结果诊断南瓜病株为WMV和ZYMV复合侵染。

甜瓜种子中黄瓜花叶病毒和小西葫芦黄花叶病毒的RT-LAMP可视化检测方法

本研究旨在针对甜瓜种子中携带的黄瓜花叶病毒(CMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV),建立可视化环介导等温扩增检测方法。根据CMV和ZYMV外壳蛋白(CP)基因的保守序列,分别设计并筛选出2套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,通过对反应体系中主要影响因素的优化,建立适用于快速检测CMV和ZYMV的RT-LAMP检测方法。对优化后的2种LAMP检测方法进行特异性和灵敏度验证。结果表明,建立的2种LAMP检测方法分别能够特异性地检测出CMV和ZYMV,检测灵敏度较常规RT-PCR分别高出10倍和100倍,并且可通过肉眼观察直接对反应结果进行判定。该方法的建立为基层及现场快速检测甜瓜种子的带毒情况提供了新方法。

小西葫芦花叶病毒(ZYMV)抗血清制备及检测技术研究

从小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)免疫的母鸡蛋卵黄和兔抗血清中分别提取免疫球蛋白IgY和IgG,用多种血清学方法进行检测。结果表明,免疫鸡和兔25d后,鸡蛋卵黄IgY和兔抗血清的效价分别达到1/64和1/512。在琼脂扩散试验中,当抗体稀释28倍时,与抗原反应无明显沉淀线。在胶乳凝集试验中,抗体稀释210倍时,与抗原反应无明显凝集物。ELISA法以辣根过氧化酶标记抗体IgY和IgG,用双抗夹心法成功地检测出了ZYMV,当抗体稀释106倍时,与抗原反应仍呈阳性。免疫电镜方法检测ZYMV,较一般血清学方法可多捕捉50倍的病毒颗粒。

北京地区辣椒上黄瓜花叶病毒和甜菜西方黄化病毒复合侵染的分子鉴定

辣椒是我国重要的蔬菜和经济作物,受多种病毒危害。2014年在北京市顺义区调查时发现部分种植的辣椒植株上叶片大面积黄化,边缘症状明显,个别植株叶片轻微上卷。提取典型症状样品的总RNA,反转录得到cDNA,分别用黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)特异引物和马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)通用引物进行PCR检测,CMV特异引物和马铃薯卷叶病毒属通用引物分别扩增得到约650bp和1 400bp的特异条带。测序和核苷酸序列比对表明,其分别与CMV和甜菜西方黄化病毒(Beet western yellows virus,BWYV)序列同源性最高为99%和96%。这是对我国种植的辣椒上发生的CMV和BWYV复合侵染的首次报道。

金瓜和白瓜花叶病毒病病原的初步鉴定

崇明是上海出口蔬菜生产基地之一,也是国家级的绿色食品园区之一,具有生产绿色蔬菜商品的生态环境和资源优势.

柑橘黄化花叶病毒侵染性克隆构建及应用

【目的】构建柑橘黄化花叶病毒(citrus yellow mosaic virus,CYMV)侵染性克隆,为深入研究其分子特性及致病机理打下基础。【方法】利用In-Fusion同源重组技术将分段扩增的CYMV基因组序列与三元表达载体pCY重组连接,构建该病毒1.4倍基因组全长DNA克隆并开展序列分析。将所获克隆通过农杆菌介导接种尤力克柠檬实生苗,通过分子检测、症状和病毒粒子观察及再嫁接实验鉴定其侵染性。利用所获侵染性克隆接种不同的柑橘品种及草本植物,通过RT-PCR检测确定侵染率,观察不同柑橘品种受侵染后的症状差异。基于侵染性克隆构建ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,gfp)的突变体,分析突变对病毒侵染性的影响。【结果】利用In-Fusion同源重组技术获得CYMV 1.4倍基因组全长DNA克隆7个。其中,CYMV-3与已登录GenBank的9个CYMV分离株基因组相应核苷酸序列一致性为90%-100%,与分离株CYMV-SO(AF347695)同源性最高并在遗传进化树上聚为一簇。侵染性鉴定结果表明,CYMV-3接种的14株尤力克柠檬植株中有4株呈RT-PCR阳性,并观察到点状褪绿症状;提取侵染植株系统新叶DNA,PCR扩增获得预期的覆盖CYMV基因组全长的特异性片段;以CYMV-3侵染显症植株为毒源嫁接接种粗柠檬实生苗,通过RT-PCR在90 dpi可检测到CYMV特异性条带;取CYMV-3侵染显症植株的新叶进行固定切片并电镜观察,可见大小约130 nm×30 nm的杆状病毒粒子,说明CYMV-3为CYMV侵染性克隆。将CYMV-3通过农杆菌介导真空浸润接种10个柑橘品种,注射接种5个柑橘品种并进行RT-PCR检测,结果显示前者侵染率为11.11%-100.00%,后者侵染率为63.16%-90.00%,部分柑橘品种出现黄化、花叶、斑块状黄化等CYMV侵染症状。通过农杆菌介导注射接种本氏烟、玉米、豇豆和高粱,结果显示仅高粱检测到RT-PCR阳性植株,且系统叶片沿叶脉周边出现条状褪绿带,表明CYMV可以侵染高粱。构建了CYMV-3 ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为gfp的突变体,通过农杆菌介导注射接种粗柠檬,RT-PCR检测结果均为阴性,且无侵染症状。【结论】成功构建了CYMV的侵染性克隆,通过农杆菌介导注射可高效接种柑橘植株,侵染症状在不同品种上具有差异。

芜菁黄化花叶病毒RT-LAMP检测方法的建立

芜菁黄化花叶病毒(Turnipyellow mosaic virus, TYMV)是芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)的代表种,该病毒侵染白菜能够引起黄化、花叶和皱缩等症状,给白菜产业造成巨大的影响。在此,我们建立了反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术来检测白菜中的TYMV。针对TYMV分离株中保守的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)基因的区域设计的RT-LAMP检测引物。优化后的RT-LAMP方法对TYMV的检测具有特异性和灵敏度,灵敏度比RT-PCR高10,000倍。这种简单、高效、快速和灵敏的方法能够应用于白菜中TYMV的检测。

山西西葫芦花叶病病原鉴定与部分序列分析

利用双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）技术和非序列依赖PCR扩增（sequence-independent amplification,SIA）方法对感病西葫芦进行了分子鉴定。序列测定及分析发现,具有明显花叶和斑驳症状的西葫芦受到黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）的侵染。为进一步明确黄瓜花叶病毒山西西葫芦分离物（CMV-XHL）的分类地位,克隆了CMV-XHL RNA3的外壳蛋白和移动蛋白基因全序列。通过序列比对分析,发现CMV-XHL CP核苷酸序列和氨基酸序列与CMV亚组ⅠB中CMV烟草分离物（CMV-SG）的相似性最高,分别为98.6%和99.5%;MP核苷酸序列和氨基酸序列与CMV亚组Ⅰ分离物的相似性最高,为93.2%~94.6%。MP和CP氨基酸序列系统进化分析表明,CMV-XHL与中国大多数CMV分离物聚为一类,属于CMV亚组Ⅰ中的成员。研究结果对西葫芦病毒病的防治提供一定的理论依据。

3.95%病毒必克可湿性粉剂防治西葫芦病毒病的研究

通过室内生物测定,3.95%病毒必克可湿性粉剂接种前施药,对黄瓜花叶病毒的抑制作用明显高于对照药剂,防治效果达77.07%,接种后施药抑制效果依然显著,达到68.66%。CMV体外钝化试验和叶绿素含量测定试验表明:病毒必克在体外能有效的钝化CMV,使其失去活性;喷施病毒必克后发病植株叶片中的叶绿素含量比同期对照叶片中叶绿素含量高。小区药剂对比试验表明:用3.95%病毒必克可湿性粉剂500倍液喷雾,对西葫芦病毒病的防治效果达72.4%,明显优于对照药剂。