山东省小麦生产品种对小麦黄花叶病毒病的抗性

小麦黄花叶病毒病是危害我国冬小麦的一种重要病害,为明确山东小麦生产品种对该病害的抗性水平,给山东小麦黄花叶病毒病育种、病害防控及品种合理布局提供参考信息,于2012-2015年在山东省莒南县板泉镇的小麦黄花叶病毒病品种抗病性鉴定圃,对山东80个小麦生产品种进行了抗性评价和产量性状分析。结果表明,在供试的80个小麦品种中,济麦22、烟农5158、鲁原231、鲁原304、良星99、烟农0428、烟农173、烟农999、阳光10、红地09-5、山农18、山农29、烟农426、烟农836、济南17共15个品种对小麦黄花叶病毒病表现为抗病,占供试品种的18.75%;烟农24、鲁原502、济麦21、泰农1014等31个品种表现中抗,占供试品种的38.75%;其余34个品种表现为感病,占供试品种的42.5%。感病品种产量的损失率与有效穗数、穗粒数、千粒重3因素的综合损失率密切相关。

一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法

针对小麦黄花叶病毒(WYMV)和中国小麦花叶病毒(CWMV)在症状、传播途径、发生规律等方面高度相似、难以用常规手段鉴定的问题,根据两种病毒基因序列的异同点设计了三条引物CWWY-R2、CW1-F2和WY1-F2,以植物总RNA为模板、CWWY-R2为引物反转录合成cDNA。通过优化建立了一种同步检测两种病毒的反应体系:cDNA1.6μL,引物(10μmol.L-1)各0.4μL,10×PCR Buffer(不含Mg2+)2μL,dNTPs(10mmol.L-1 each)0.4μL,Taq DNA聚合酶(5U.μL-1)0.8μL,MgCl2(25mmol.L-1)0.8μL,ddH2O 13.2μL,合计20μL;PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃50s,50℃50s,72℃90s,共30个循环,72℃延伸10min。WYMV和CWMV的PCR扩增预期目的片段分别为508和918bp。利用该方法对江苏高邮、扬州和大丰的样本进行检测,它们分别为WYMV、WYMV、CWMV单一侵染,证明该方法准确性较高,可用于两种病害同步检测。

小麦黄花叶病毒河南驻马店分离物的鉴定与全序列分析

采集河南省驻马店市13个不同田块小麦样品，利用RT—PCR、ELISA和WesternBlotting检测技术进行检测，结果表明，该地有小麦黄花叶病毒的存在与分布。对检测为阳性的一个分离物全序列进行cDNA克隆和测序，与已报道WYMV河南潢川、江苏扬州、四川雅安和日本分离物的全序列进行比对，RNAl核苷酸一致性为97．1％～98．4％；RNA2为95．1％～98．4％；氨基酸一致性分别为94．8％～97．8％和94．2％～98．2％。利用软件MEGA4．1对上述五个RNAl和RNA2的全序列分别进行进化树分析，结果表明，驻马店分离物与潢川亲缘关系最近，而与四川雅安亲缘关系最远。

山东烟台小麦土传病毒病由小麦黄花叶病毒和土传小麦花叶病毒相关病毒复合侵染所致

Analysis of ISEM, SDS PAGE, Western blot, Northern blot and RT PCR indicated that the soil borne mosaic disease occurred on winter wheat in Yantai district, Shandong Province, was caused by co infection of two different viruses. The filamentous virus was identified to be wheat yellow mosaic virus (WYMV) as it had a coat protein of 33kD, which was serologically related to WYMV, wheat spindle streak mosaic virus(WSSMV) and barley yellow mosaic virus (BaYMV), but not to barley mild mosaic virus(BaMMV) and soil borne wheat mosaic virus(SBWMV). In addition, DNA fragments specifically amplified from its cDNAs template with WYMV primers were identical to those amplified from the homologous template. The rod shaped virus was identified to be a SBWMV related virus as it had a coat protein of 19 kD, which was serologically related to SBWMV and TMV, but not to WYMV, WSSMV, BaYMV, BaMMV and three monoclonal antibodies to SBWMV. Its RNA1 (7.1kb) and RNA2 (3.6 kb) were respectively hybridized by cDNA probes of RNA1(p3H5) and RNA2(pJC2G6) of SBWMV, but no DNA fragments specifically amplified from cDNA template of its RNA with primers of SBWMV RNA 1 and RNA2.

小麦黄花叶病毒病不同发生度土壤的微生物多样性研究

2016年于山东省临沂市、枣庄市、济宁市采集3组小麦黄花叶病毒病发生严重度不同地块的土壤,采用平板稀释分离法分别分离其中的真菌、细菌和放线菌,统计土壤微生物总量及3种可培养微生物的种类和数量,研究其与小麦病毒病发生程度的关系。结果表明,同一地块中细菌数量占绝对优势,其次为放线菌,真菌最少;但是分离得到的可培养真菌的种类和数量最多,其次为细菌,放线菌数量最少;并且发病严重地块的土壤微生物总量均高于轻病地块,其中发病严重地块的真菌数量和种类增加的最为显著,其次为细菌,放线菌基本无变化。

黄淮地区小麦品种对小麦黄花叶病毒抗性评价

小麦黄花叶病是由禾谷多黏菌传播的小麦黄花叶病毒引起的病害,近年在黄淮麦区呈蔓延加重趋势。为了给病害的防治和抗病育种工作提供依据,本研究利用分级评价方法对黄淮地区推广的小麦品种进行了田间抗病性鉴定。两年鉴定结果表明,在145个供试小麦品种中,‘濮优938’、‘新麦208’、‘豫麦416’、‘新原958’、‘豫麦70-36’、‘泛麦5号’等70个品种表现为免疫,占总数的48.28%;‘豫麦47’和‘邯6172’表现为抗病,占总数的1.38%;‘洪育2号’、‘花培2号’、‘偃展4110’、‘豫麦41’、‘郑麦9023’等48个品种表现为中抗,占总数的33.10%;‘兰天06129’、‘兰天0591’、‘徐麦9158’、‘徐麦0054’、‘徐麦1108’等25个品种表现为感病,占总数的17.24%。研究结果为指导小麦黄花叶病区合理选择小麦品种提供了科学依据。

小麦黄花叶病毒单克隆抗体的制备及ACP-ELISA检测方法的建立

为建立简便、有效、低成本小麦黄花叶病毒(WYMV)的检测方法,用提纯的WYMV免疫BALB/c小鼠后,利用杂交瘤细胞技术经细胞融合、筛选和克隆,共获得2D4、2D3和6F4 3株能稳定传代并分泌抗WYMV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并分别注射小鼠腹腔制备其单抗腹水。3株单抗腹水的间接ELISA效价为10^(-6)~10^(-7),抗体类型及亚类均为IgG1、κ链。特异性检测结果表明6F4和2D4这2株单抗仅与WYMV的32 kD外壳蛋白有特异性免疫反应。利用效价最高的2D4单抗建立了检测WYMV的抗原包被ELISA方法(ACP-ELISA),其灵敏度分析结果表明,当病叶以1∶25 600(g/ml)倍稀释时仍能检测到病毒,特异性分析结果表明可有效区分小麦易感染的中国小麦花叶病毒(CWMV)。田间样品检测结果表明该方法可准确、可靠地用于小麦WYMV的大规模检测。

小麦黄花叶病毒的血清学检测

利用间接ELISA对感染WYMV的小麦病叶检测 ,通过比较分析影响ELISA测定结果的包被缓冲液、抗血清及酶标抗体的浓度和种类 ,确立了较为稳定的反应体系。利用此ELISA检测体系并结合RT PCR方法对从四川采集的田间小麦中WYMV进行检测 ,确定了有较高的检测灵敏度的检测系统 ,为田间大量小麦病样的检测提供有效。

小麦黄花叶病毒RNA2 28kDa蛋白基因的表达及表达产物抗血清的制备

根据小麦黄花叶病毒（ Ｗ Ｙ Ｍ Ｖ） 核苷酸序列测定结果，将 Ｗ Ｙ Ｍ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ２ 上的２８ ｋ Ｄａ 蛋白基因克隆到ｐ Ｅ Ｔ１１ａ 上，构建了原核表达载体ｐ Ｅ２８３９ 。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 分析表明，经 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导，２８ ｋ Ｄａ蛋白基因在大肠杆菌 Ｂ Ｌ２１（ Ｄ Ｅ３）ｐ Ｌｙｓ Ｓ 中得到高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原，免疫家兔，首次制备了小麦黄花叶病毒 Ｒ Ｎ Ａ２ 蛋白特异性抗血清。

土传线状小麦黄花叶病毒浦江分离物NIb基因的克隆及序列分析

根据已发表的日本小麦黄花叶病毒（ｗｈｅａｔｙｅｌｏｗｍｏｓａｉｃｂｙｍｏｖｉｒｕｓ，ＷＹＭＶ）ＲＮＡ１核苷酸序列，设计了一对引物ＮＩｂ０１／ＮＩｂ０２，用来扩增浙江浦江土传线状小麦黄花叶病毒分离物ＮＩｂ基因的全长序列。以表现典型病症的小麦植株病叶总ＲＮＡ为模板，Ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）１８为引物合成第一链ｃＤＮＡ，用ＲＴＰＣＲ法扩增浦江分离物ＮＩｂ全长基因，并将此基因直接克隆到ｐＧＥＭＴ质粒中，进行全序列测定。结果表明该分离物与日本ＷＹＭＶ相应序列具有很高的同源性，而与小麦梭条斑花叶病毒（ＷＳＳＭＶ）存在很大的差异，因此认为浦江病毒分离物为ＷＹＭＶ。

小麦黄花叶病毒低分子量RNA1的鉴定

利用小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)潢川分离物连续继代机械接种感病小麦品种鄂恩1号,经继代接种12 代以上的小麦症状明显加重, Northern blot 检测发现一条明显的低分子量病毒RNA1(LMW RNA1),并在随后至26代的继代接种发病材料中稳定存在,但在利用同样病叶提纯的病毒粒子内检测不到LMW RNA1,表明其不能被包装到病毒粒子内。序列分析结果表明,低分子量RNA1 由病毒RNA1 发生内部缺失而产生,从RNA1 5′端非编码区(第68nt)到CI基因编码区的3′端(第2448nt)共缺失2380 个核苷酸,在缺失区域两端的结合位点存在六个碱基的正向重复序列CGTCTC。据此对此低分子量RNA1 的缺失机制进行了讨论,认为由一种模板转换机制导致了缺失的发生。

利用异种动物抗血清双抗夹心法检测小麦黄花叶病毒

小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV),属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae),大麦黄花叶病毒属(Bymovirus),传播介体为禾谷多粘菌(Polymyxa graminis),与发生在欧美的小麦梭条花叶病毒(WSSMV)为同一属内的两种病毒[1].

基于SYBR Green检测小麦黄花叶病毒的两步法qPCR

小麦黄花叶病毒病是其常发病,常造成严重减产。为建立可用于定量检测小麦黄花叶病毒（WYMV）拷贝数的q PCR方法,本研究对不同来源的WYMV小种序列进行比对分析,在序列保守区域设计引物11对,对其退火温度进行优化,进而建立各引物的q PCR标准曲线。结果发现,11对引物的扩增效率在50.60%~116.04%之间,仅2对引物可用于后续研究,扩增效率分别为97.21%（WY-05和WY-06）和91.85%（WY-F2和WY-R2）。利用其中的WY-F2和WY-R2对高抗和高感WYMV的小麦品种进行分析,结果显示,抗感小麦品种WYMV拷贝数差异极显著。对抗感分离群体266个单株进行分析,发现该q PCR方法灵敏度显著高于酶联免疫吸附剂测定法,更适用于抗感杂交分离群体的表型鉴定,因而可以用于抗WYMV基因的遗传定位与图位克隆工作。

用酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒CP互作的寄主因子

为筛选与小麦黄花叶病毒外壳蛋白(wheat yellow mosaic virus coat protein,WYMV-CP)互作的小麦蛋白,构建了小麦茎叶酵母双杂交cDNA文库,并从中筛选获得了与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段。从小麦茎叶中提取小麦总RNA,分离mRNA后,利用GATE-WAY技术将反转录得到的小麦cDNA片段定向转移到目的载体,同源重组反应后成功构建小麦cDNA文库。经检测,小麦cDNA文库的滴度为5.86×106 CFU·mL-1,库容量为2.34×107 CFU,重组率为95.8%。根据NCBI上WYMV-CP开放阅读框信息,构建了诱饵载体pGBK-CP,通过酵母双杂交筛选获得了若干阳性克隆,共转化试验初步验证了WYMV-CP与PEPCK、PAL等蛋白的互作关系。本研究利用酵母双杂交技术成功获得与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段,为明确WYMV的致病机制提供了科学的依据。

小麦黄花叶病毒P1蛋白原核表达、抗血清制备及其检测

用RT-PCR方法从感染小麦黄花叶病毒(Wheat yellowmosaic virus,WYMV)扬州分离物的小麦叶片中扩增获得该病毒P1基因的全长cDNA片段,并进行了序列分析。结果表明,P1基因编码区含有765个核苷酸,编码1个由255氨基酸组成分子量为28.2 kDa的蛋白。将P1基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中构建重组原核表达载体pGEX 6P-1-P1,经IPTG诱导,P1蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达GST-P1的融合蛋白,纯化并制备了P1蛋白的兔抗血清。利用此抗血清,可以检测WYMV病叶中的P1蛋白,但与提纯的WYMV粒子没有血清学反应,表明P1没有参与WYMV粒子的包装,是一种非结构蛋白。

小麦黄花叶病毒P2蛋白原核表达、抗血清制备及其在感病小麦细胞中的定位

通过RT-PCR获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)扬州分离物P2基因,并进行序列分析。P2基因编码区含有2 635个核苷酸,编码一个由875个氨基酸组成的分子量72 kDa的蛋白。在原核表达体系中,该基因的全长表达较困难,因此将P2基因的5'端和3'端各设计大约1 kb亚克隆到原核表达载体pMAL-C2X中构建重组表达载体MBP-P2N,MBP-P2C,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达MBP-P2N和MBP-P2C融合蛋白。MBP-P2C融合蛋白经大量诱导、纯化、制备相应抗血清。用制备的抗血清可以有效检测WYMV病叶中的P2蛋白。免疫胶体金标记实验表明在感病WYMV的小麦叶片细胞膜状内含体结构中发现有大量胶体金颗粒特异性分布,表明P2蛋白可能与膜状内含体结构有关。

酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒P2互作的寄主因子

小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus,WYMV)隶属马铃薯Y病毒科(Potyviridae),大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)。该病毒基因组是由两条正义单链RNA1和RNA2构成,共编码10个蛋白,其编码的P2在病毒的复制过程中发挥重要功能。文章构建了小麦cDNA酵母文库,通过共转试验共筛选获得若干个候选互作寄主因子,包括水杨酸信号通路因子、E3泛素化连接酶、防御反应、氧化还原酶活性、光系统II组件等18种蛋白,研究P2与寄主因子的互作。进一步试验证实,其中的TaTIFY 10A、Ta14-3-3与WYMV-P2存在互作关系。结果表明,WYMV-P2与小麦的E3泛素化类转录因子、水杨酸信号转录因子、植物光系统的稳定组件及叶绿体的形成关键因子等可能存在互作关系,P2可能参与了寄主多种信号途径,为明确WYMV与寄主的互作机制提供了研究基础。

山东小麦黄花叶病毒的分子检测与鉴定

利用RT-PCR对2012年山东10个地区送检的105个小麦样品进行了检测,从泰安、临沂、枣庄3个地区的样品中检测到了小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)。这3个地区WYMV分离物CP基因的核苷酸一致率为97.6%～98.3%,氨基酸一致率为98.3%～99.0%。在利用CP基因核苷酸序列构建的系统进化树中,这3个分离物均与WYMV分离物聚类到一起,其中枣庄分离物和河南分离物(FR828007)亲缘关系更近。

小麦黄花叶病毒编码VPg蛋白N端结构是VPg与核仁蛋白Fibrillarin互作区域

小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)属于马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属成员,其基因组是由两条正义单链RNA组成,共编码10个蛋白。其中,VPg(Viral protein genome-linked)作为病毒末端结合蛋白,与病毒基因组RNA 5’端共价连接。利用软件分析WYMV VPg蛋白氨基酸序列发现其N端具有核定位信号(NLS)序列,C端具有核输出信号(NES)序列。通过激光共聚焦显微镜观察VPg与GFP融合蛋白在烟草细胞中的表达情况发现,GFP-VPg主要定位于细胞核中。利用eYFP(n)标记核仁结构蛋白Fibrillarin与VPg进行双分子荧光互补实验发现,VPg与Fibrillarin互作且定位于细胞核中。根据VPg结构特点构建一系列缺失突变体与Fibrillarin的互作实验验证了它们之间的互作区域发生在N端NLS区域。

小麦黄花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

通过RT-PCR方法扩增获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的衣壳蛋白(CP)基因,将其连接原核表达载体p EHISTEV,并将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,可以表达38 k D的融合蛋白。通过切胶回收的方法收集目的蛋白,免疫新西兰长耳兔,制备WYMV CP的多克隆抗体。间接ELISA测定该抗血清效价为1∶2 048,Western blotting分析表明该血清可以与病株中CP发生特异性反应,而与健康植株汁液无反应。该血清为WYMV的检测及CP功能的研究奠定了基础。