班氏促卵助孕汤改善多囊卵巢综合征小鼠卵母细胞的质量

背景:班氏促卵助孕汤改善多囊卵巢综合征卵母细胞质量的分子机制亟待完善补充。目的:探讨班氏促卵助孕汤对多囊卵巢综合征小鼠卵母细胞质量的影响和分子机制。方法:21 d龄雌性昆明小鼠颈部皮下注射硫酸脱氢表雄酮构建多囊卵巢综合征模型,连续给药21 d,记录动情周期及妊娠情况,ELISA检测血清性激素水平,Annexin V染色检测卵母细胞凋亡率,DCFH-DA荧光探针检测卵母细胞内活性氧水平,免疫荧光法观察卵母细胞纺锤体及染色体情况,网络药理学及分子对接验证班氏促卵助孕汤核心有效成分与卵母细胞成熟相关因子(生长分化因子9和骨形态发生蛋白15)结合活性,实时荧光定量PCR和Western blot检测卵母细胞中生长分化因子9和骨形态发生蛋白15的mRNA及蛋白表达水平。结果与结论:①班氏促卵助孕汤中的成分(槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇)与生长分化因子9、骨形态发生蛋白15具有良好的结合活性;②班氏促卵助孕汤能恢复小鼠动情期,改善性激素紊乱和妊娠情况,降低细胞凋亡率、活性氧水平、纺锤体组装异常率、染色体丢失率(P<0.01,P<0.05),促进生长分化因子9、骨形态发生蛋白15 mRNA和蛋白表达(P<0.01,P<0.05)。结果表明,班氏促卵助孕汤可能通过调控生长分化因子9和骨形态发生蛋白15的基因表达,改善多囊卵巢综合征小鼠卵母细胞质量,提高生育力。

核膜孔亚复合物Nup98/Rae1对小鼠卵母细胞体外减数分裂成熟的影响

【目的】探究核膜孔蛋白98(Nup98)和核糖核酸输出因子1(Rae1)对小鼠卵母细胞体外减数分裂成熟的影响。【方法】选择4周龄SPF级雌性昆明小鼠,分离小鼠卵母细胞并进行体外成熟培养,利用实时荧光定量PCR检测小鼠卵母细胞中Nup 98和Rae 1基因表达量;利用免疫荧光法检测Nup98和Rae1共定位情况;利用电转siRNA干扰技术敲低小鼠卵母细胞中Nup 98和Rae 1基因,通过实时荧光定量PCR检测干扰效率,并观察小鼠卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)和第一极体排出(first polar body extruction,PBE)情况;利用免疫荧光法检测敲低Nup 98和Rae 1基因后小鼠卵母细胞纺锤体组装和染色体排列情况;利用染色体爬片技术检测染色体非整倍体率。【结果】Nup 98和Rae 1基因在小鼠卵母细胞中均有表达。在小鼠卵母细胞生发泡(germinal vesicle,GV)时期,Nup98和Rae1共定位于核膜边缘;在减数分裂过程中,Nup98和Rae1聚集于染色体动粒上。siRNA干扰试验结果显示,与对照组相比,单独敲低Nup 98和Rae 1基因后,对另一基因表达无显著影响(P<0.05);双敲Nup 98和Rae 1基因后,对卵母细胞减数分裂恢复率无显著影响(P>0.05),小鼠卵母细胞发育9.5 h时的PBE率极显著升高(P<0.01),染色体分离比率和非整倍体率极显著或显著增加(P<0.01;P<0.05)。【结论】Nup 98和Rae 1基因在小鼠卵母细胞减数分裂中参与染色体分离,影响非整倍体的发生,从而影响受精胚胎的发育潜力。

SGK3在小鼠卵母细胞第一次减数分裂恢复中的作用及其机制

目的:探讨血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶3(SGK3)在小鼠卵母细胞第一次减数分裂恢复中的作用,初步阐明SGK3在哺乳动物卵母细胞早期发育中的调控机制。方法:利用超排卵技术获取生发泡(GV)期小鼠卵母细胞,利用显微注射技术将表达质粒体外转录获得的SGK3 mRNA注射至GV期卵母细胞,分为对照组、Tris-EDTA缓冲液(TE)组和SGK3 mRNA组,采用Western blotting法检测各组小鼠卵母细胞中SGK3蛋白表达水平,显微注射SGK3 mRNA后1、2、3和4 h观察并计算各组卵母细胞生发泡破裂(GVBD)率,采用SGK3抗体稀释抑制实验观察各组卵母细胞形态表现,采用Western blotting法检测体外培养不同时间点卵母细胞中磷酸化SGK3(pSer48)(SGK3-pSer48)和磷酸化细胞分裂周期蛋白2(CDC2)(pTyr15)(CDC2-pTyr15)蛋白表达水平。结果:与对照组和TE组比较,SGK3 mRNA组小鼠卵母细胞中SGK3蛋白表达水平升高(P<0.01),显微注射后1和2 h时GVBD率升高(P<0.01)。SGK3抗体稀释抑制实验,随着SGK3抗体浓度增加,各组小鼠卵母细胞GVBD率呈浓度依赖性降低。过表达SGK3后,与对照组比较,SGK3 mRNA组小鼠卵母细胞中检测不到CDC2-pTyr15蛋白表达的时间至少提前1 h。不同稀释浓度SGK3抗体作用后,与对照组比较,随着SGK3抗体浓度升高和时间的延长,小鼠卵母细胞中CDC2-pTyr15蛋白表达水平逐渐降低(P<0.01),SGK3-pSer486蛋白表达水平逐渐升高(P<0.01)。结论:过表达SGK3可以增加小鼠卵母细胞GVBD率,加快CDC2-pTyr15的脱磷酸化,而CDC2-pTyr15的脱磷酸化晚于SGK3-Ser486的磷酸化。SGK3可能作为CDC2上游调节因子参与调控小鼠卵母细胞第一次减数分裂的恢复。

细胞松弛素B浓度对小鼠卵母细胞去核效果的影响

目的 探讨细胞松弛素 B浓度对小鼠卵母细胞去核效果的影响。方法 常规超排 KM小鼠获卵母细胞 ,将有明显第一极体的卵母细胞放入含有 5× 10 - 3、1× 10 - 2 、2× 10 - 2 g/ L CB的成熟培养液中孵育 15 min,采用盲吸法去核 ,去核后的卵母细胞放入含 5× 10 - 3g/ L Hoechst33342的成熟培养液中染色 15 min,在荧光显微镜下检查去核的效率。结果 CB组去核率可达 88.2 % ,而对照组去核成功率仅达 2 9.7% ,两者的去核效果统计学上有显著差异 ;同时 CB的浓度过高会影响去核的效果 ,使卵母细胞的破溃率升高。结论 CB有利于去核 ,同时卵胞膜可以借助磷脂双层的游动性而很快得到修复 ;高浓度的 CB对卵胞膜作用过于强烈 ,细胞骨架严重破坏 ,磷脂双层结构的弹性和粘性减弱 ,修复能力降低 ,影响胚胎的构建。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达及作用

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种Ser/Thr激酶,属于PIKK超家族,对调节细胞周期、蛋白质合成等具有重要作用,是细胞生长、增殖、分化、凋亡的中心调控器,但在哺乳动物卵母细胞中的研究还未见报道.以小鼠卵母细胞为研究对象,采用免疫荧光为主要研究方法,对mTOR在小鼠卵母细胞中的表达进行研究,并通过mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对卵母细胞进行处理,对mTOR在卵母细胞成熟过程中的作用进行研究.结果显示:小鼠卵母细胞成熟过程中,生发泡(germinal vesicle,GV)期mTOR主要集中在核膜处表达,生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)后mTOR伴随染色体分布,第二次减数分裂中期(second metaphase,MⅡ期)mTOR伴随纺锤体分布;雷帕霉素处理后,小鼠卵母细胞的成熟受到抑制,且这种抑制作用具有浓度依赖性,同时其mTOR的表达部位和形态也发生变化.研究表明,在小鼠卵母细胞成熟过程中,mTOR在各个时期的表达及分布具有阶段特异性,并对小鼠卵母细胞GVBD的发生和第一极体的排放都具有重要作用.

抗氧化剂半胱氨酸对小鼠卵母细胞体外成熟及发育潜能的影响

目的研究抗氧化剂半胱氨酸对小鼠卵母细胞体外成熟及发育潜能的影响,为进一步优化卵母细胞体外成熟培养体系提供理论依据。方法对照组采用基础体外培养液,共培养101枚GV期小鼠卵母细胞;实验组采用基础体外培养液+0.6 mmol/L半胱氨酸,共培养115枚GV期小鼠卵母细胞。观察两组卵母细胞的成熟率、谷胱甘肽的含量和线粒体内膜电位。结果对照组和实验组卵母细胞的成熟率分别为68.3%和80.0%,差别具有统计学意义(P<0.05);对照组和实验组卵母细胞平均谷胱甘肽含量分别为0.48±0.6μg/L和0.51±0.5μg/L,实验组谷胱甘肽含量略高,但两者无统计学差异(P>0.05)。线粒体内膜电位,对照组与实验组分别为0.04±0.003△Ψm与0.39±0.020△Ψm,实验组线粒体内膜电位明显高于对照组(P<0.05)。结论抗氧化剂半胱氨酸对体外培养小鼠卵母细胞成熟有一定的促进作用,并可能会提高卵母细胞的发育潜能。

铬对小鼠卵母细胞凋亡及DNA损伤的影响

利用人工水质染毒的方法,采用组织切片、透射电镜和单细胞凝胶电泳(彗星实验)技术,观察小鼠卵母细胞的超微结构变化及DNA损伤状况,从形态学角度研究不同剂量铬对小鼠雌性生殖细胞凋亡及DNA损伤的影响,目的在于探讨三价铬的繁殖毒性。实验设置对照组及3个处理实验组,分别饮用添加0.24、0.48和0.72 mmol·L^(-1)三氯化铬的纯净水,对照组小鼠饮用纯净水,30 d后取材观察。结果表明:除实验一组外,各实验组中小鼠卵母细胞处于凋亡时期的数量显著高于对照组,凋亡时期的卵母细胞超微结构呈现出线粒体空泡、核膜内陷、染色质周缘化及核固缩等现象。高剂量处理(0.72 mmol·L^(-1))组彗星比率为21.35%、尾部DNA含量为17.53%、Olive尾矩(OTM)为3.92,均显著高于对照组,而头部DNA含量(82.47%)显著低于对照组(94.15%)(P<0.05),说明添加高剂量铬容易引起小鼠卵巢发育过程中卵母细胞DNA的损伤。

三氧化二砷对小鼠卵母细胞线粒体DNA氧化损伤作用及其机制

目的研究三氧化二砷(As2O3)对小鼠卵母细胞线粒体DNA(mt DNA)的氧化损伤作用及其作用机制。方法 1体外实验挤压正常小鼠卵巢获取卵母细胞,培养成熟后,分为As2O31和2μmol·L-1单独处理组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)5 mmol·L-1处理组、2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(Tempo)1 mmol·L-1处理组、As2O31或2μmol·L-1+NAC 5 mmol·L-1共处理组、As2O31或2μmol·L-1+Tempo 1 mmol·L-1共处理组,培养20 h后,收集成熟卵母细胞进行后续实验指标测定。2体内实验雌性昆明小鼠ip给药,分为As2O31和2 mg·kg-1染毒组、As2O31或2 mg·kg-1+NAC 200 mg·kg-1组,每日1次,连续60 d,椎脱臼处死取卵母细胞。2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐荧光染色检测细胞内活性氧(ROS)水平;8-羟基脱氧鸟苷酶(8-OHd G)联免疫反应检测提取mt DNA中8-OHd G含量;Western蛋白印迹法检测DNA聚合酶γ(Polγ)和线粒体转录因子A(mt TFA)的蛋白表达;β-半乳糖苷酶(β-Gal)报告基因检测试剂盒检测溶酶体活力。结果 1体外实验As2O3单独处理组小鼠卵母细胞中ROS和8-OHd G含量升高,Polγ和mt TFA蛋白表达水平降低(P<0.05);而As2O3与NAC或Tempo共处理组卵母细胞中ROS含量减少,8-OHd G水平降低,Polγ和mt TFA蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。2体内实验As2O3单独处理组小鼠卵母细胞中ROS和8-OHd G含量升高,Polγ和mt TFA蛋白表达水平降低(P<0.05);As2O3与NAC共处理组小鼠卵母细胞中ROS含量减少,8-OHd G水平降低,Polγ和mt TFA蛋白表达水平提高(P<0.05)。As2O3单独处理组体外培养的卵母细胞,β-Gal活力显著提高(P<0.05),而As2O3与NAC或Tempo共处理组β-Gal活力显著下降(P<0.05)。体内实验各处理组β-Gal活力无显著差异。结论砷暴露可诱导小鼠卵母细胞大量生成ROS,抑制线粒体基因组修复与复制相关因子Polγ及mt TFA的表达,同时改变溶酶体活力,最终诱发mt DNA氧化损伤。

顺式高尔基体蛋白GM130影响小鼠卵母细胞减数不对称分裂的研究

目的确定顺式高尔基体蛋白(GM130)对小鼠卵母细胞纺锤体迁移及减数不对称分裂的影响。方法免疫荧光法检测GM130在小鼠卵母细胞的定位,活细胞工作站延时拍摄系统捕捉纺锤体在降调GM130表达后的的动态变化。结果降调GM130的表达后,第一极体排出率下降,在排出的极体中,大极体的比率升高;但对微丝网络及微丝帽的影响不明显。向卵母细胞内注射β5-tubulin--GFP mRNA和GM130特定的寡聚核苷酸(morpholino,MO)的混合物后,用活细胞工作站延时拍摄系统证实了降调GM130会影响卵母细胞纺锤体的迁移,纺锤体单极拉长,并能与该侧的皮质接触,产生胞质分裂环,导致大极体排出。若拉长的纺锤体尚不能与皮质接触,则细胞阻滞在分裂中期I(MI期),没有极体排出。另外,降调GM130的表达也会影响磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2(p-MEK1/2)在纺锤体极的定位,用丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)的抑制剂U0126处理MI期的卵母细胞则发现GM130不再在纺锤体两极聚集,而是散在分布于胞浆。结论 GM130可能参与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在小鼠卵母细胞纺锤体迁移及不对称分裂中起重要作用。

脑源性神经营养因子及其受体在小鼠卵母细胞第一极体释放中的作用

目的:探讨脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体酪氨酸蛋白激酶受体B(TrkB)在卵母细胞第一极体释放中的作用。方法:用Affymetrix基因芯片分析在模拟卵母细胞成熟过程中BDNF及其受体TrkB在卵巢组织中的表达变化,用实时定量荧光PCR(RT-PCR)分析卵泡组织中BDNF及其受体TrkB的表达,并利用TrkB抑制剂K252a探讨BDNF在卵母细胞释放第一极体中作用。结果:在模拟卵母细胞成熟过程中,BDNF的表达出现2个峰值,第2个峰值比第1个峰值显著;TrkB的表达同样也出现2个峰值,但峰值均非常低。BDNF在卵丘细胞、壁层颗粒细胞和卵母细胞中均有表达,而TrkB仅在卵母细胞中表达。不同浓度(1,3,10,30ng/ml)BDNF均促使卵母细胞第一极体释放率升高(P<0.05),以3ng/ml组升高更显著。体内实验发现不同剂量K252a均能抑制卵母细胞第一极体释放率(P<0.05),但不同剂量组无统计学差异。结论:BDNF在卵母细胞的第一极体的释放过程中发挥重要作用。

小鼠卵母细胞去核时间对卵丘细胞核移植的影响

对超数排卵的小鼠分别在注射HCG后14～16,16～18,18～20和20～22 h采小鼠卵母细胞用于核移植,观察小鼠卵母细胞的去核时间在体细胞核移植中的作用.结果显示,在注射hCG后14～16,16～18,18～20和20～22 h,小鼠卵母细胞去核效率分别为80.09%(338/422),73.12%(283/387),55.02%(230/418)和48.74%(193/396);重构胚激活率分别为66.20%(190/287),75.43%(175/232),84.78%(156/184)和85.14%(126/148);重构胚的囊胚发育率分别为13.94%(40/287),7.33%(17/232),3.80%(7/184)和1.35%(2/148).试验证实小鼠卵母细胞在注射hCG后14～16 h进行去核较为适宜.

改良玻璃化冷冻法对小鼠卵母细胞影响的研究

目的探讨改良玻璃化冷冻法对小鼠卵母细胞复苏率和解冻后胚胎发育潜能的影响。方法以小鼠卵母细胞为实验材料,分别采用改良和传统玻璃化冷冻方法冻存小鼠卵母细胞,通过解冻后卵子复苏率、受精率、卵裂率及优胚率等分析判断冻存效果。结果改良玻璃化冷冻组的复苏率、卵裂率及优胚率均高于传统玻璃化冷冻组(P<0.05),两组的受精率无显著性差异(P>0.05)。结论相较于传统玻璃化冷冻方法,改良玻璃化冷冻法更有优势,值得推广。

小鼠卵母细胞wee 1和cdc25 mRNART-PCR方法的建立

在没有现成的哺乳动物卵母细胞 wee l、cdc 2 5m RNA的 RT-PCR方法可借鉴的情况下 ,经过反复摸索 ,终于选出了 1对适宜的 wee l c DNA引物和 1对 cdc2 5c DNA引物 ,并对 RT-PCR条件进行了优化试验 ,成功地建立起了一套稳定的 wee l、cdc2 5m RNA的 RT-PCR方法 ,为研究哺乳动物卵母细胞 。

卵巢低温保存时间与不同培养液对小鼠卵母细胞体外发育的影响

为了探讨在4℃条件下,保存卵巢时间与不同培养液对小鼠卵母细胞体外发育的影响,试验比较了在4℃条件下,小鼠卵巢不同保存时间对后续卵母细胞发育的影响,同时对M2和M16两种不同培养液对小鼠卵母细胞体外培养发育效果进行比较。结果表明:随着卵巢保存时间的延长,待成熟受抑制状态的生发泡期(GV期)的卵子所占比例呈上升趋势,减数分裂Ⅱ期(MⅡ期)的卵子所占比例呈下降趋势,4℃低温不同保存时间小鼠卵子体外发育存在差异,4℃保存可延长到18 h,但到24小时时所得卵子发育能力急剧下降。在运用M2和M16两种不同培养液进行卵母细胞体外培养时,M16培养液培养效果略好于M2培养液。

钙离子信号对非细胞体系中小鼠卵母细胞游离生发泡减数分裂启动的影响

本文构建了包括HeLa裂解液和游离小鼠卵母细胞生发泡的实验体系,用于研究Ca^(2+)及其下游信号对小鼠卵母细胞减数分裂启动的影响。游离的卵母细胞生发泡可以在M期细胞裂解液中发生减数分裂启动,表现为染色质的凝集。进一步的研究表明,Ca^(2+)信号的存在对G_2期细胞裂解液促进减数分裂启动是至关重要的,G_2期中期的细胞裂解液只有经Ca^(2+)诱导后才具有启动生发泡减数分裂的作用,而G_2期晚期无论Ca^(2+)存在与否均诱发减数分裂的启动,但是G_2期早期的裂解液无启动减数分裂的作用。卵母细胞的体外培养实验分析也表明,抑制CaM和CaMKⅡ的活性可以阻止GVBD和抑制第一极体的释放。免疫沉淀及Western Blotting结果显示,HeLa细胞裂解液中的MPF从G_2期中期到M期均存在,且Cdc2亚基的Tyr由磷酸化向去磷酸化转变。结果进一步证明,卵母细胞减数分裂的启动可能是通过一种Ca^(2+)/CaM依赖的途径来推动的。

顺式高尔基体蛋白GM130影响小鼠卵母细胞纺锤体组装

目的确定顺式高尔基体蛋白GM130对小鼠卵母细胞纺锤体组装的影响。方法免疫荧光法检测GM130在小鼠卵母细胞发育不同时期的亚细胞定位,并用免疫印迹法半定量检测其表达水平;接着用微管解聚药物诺考达唑处理小鼠MI卵母细胞,明确GM130与微管动力的关系。免疫印迹检测注射GM130特定的寡聚核苷酸(morpholino,MO)后卵母细胞中GM130的表达水平,免疫荧光法检测纺锤体的形态变化及中心体相关蛋白γ-tubulin和Plk1的定位。结果 M130在卵母细胞减数分裂成熟的不同阶段有不同的特异性定位,主要集中分布在生发泡周围、纺锤体的两极和中体及分散于胞浆。GM130在MI和MII期与中心体相关蛋白p-MEK1/2共定位并与纺锤体的组装密切相关。免疫印迹试验表明GM130在卵母细胞发育的各个时期均有表达。降调GM130的表达后,纺锤体组装异常比例升高,且大多数为拉长的纺锤体;第一极体排出率下降,在排出的极体中,大极体的比率升高,并影响γ-tubulin和Plk1的正确定位。结论 GM130可能作为一种微管组织中心相关蛋白调节纺锤体的组装。

三种生育调节剂对雌性小鼠卵母细胞及受精卵染色体的诱变作用

生育调节剂已广泛应用于计划生育领域,与育龄妇女及其后代的身体健康息息相关,因此对该类药物的遗传安全性问题必须给予足够的重视。

化学物质对小鼠卵母细胞染色体影响的研究

应用检测动物卵母细胞染色体异常改变的方法来观察有毒物质的遗传毒性,在国外已被采用。工业生产中有害化学物质能否引起卵母细胞染色体畸变,对阐明生殖损伤的机理,进行女工劳动保护有重要的意义。既往的研究表明,二硫化碳。

RNAi在小鼠卵母细胞和胚胎发育研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)介导的、序列特异地引起转录后基因沉默的现象,是生物体内抵御转座子和病毒感染的重要保护机制之一,也是在生长发育过程中调节内源基因表达的重要途径。RNAi可作为一种简单有效的代替基因剔除的工具应用于功能基因组学和疾病的基因治疗研究。现综述RNAi机制、作用特征及RNAi相关技术在小鼠卵母细胞和胚胎发育研究中的应用。