生物统合加工嵌合纤维小体组装模块反应机制探究

为探究生物统合加工嵌合纤维小体中重组蛋白粘连模块与对接模块的分子相互作用及其对嵌合纤维小体组装效率的影响,采用酿酒酵母细胞分泌表达支架蛋白和酶分子催化模块,在胞外通过非变性蛋白凝胶电泳和等温滴定量热法测定分析二级支架蛋白、纤维素酶分别与一级支架蛋白结合时的相互作用反应。结果显示,分别连接二级支架蛋白和纤维素酶蛋白的对接模块与粘连模块的亲和力常数增大,亲和力减小,组装反应为焓变驱动的放热反应并产生氢键,证明这些蛋白分子间亲和力减小是导致二级支架蛋白与一级支架蛋白组装效率较低的主要影响因素。

自组装嵌合纤维小体酿酒酵母菌群的乙醇发酵研究

在可共代谢葡萄糖木糖的二倍体酿酒酵母Y6细胞表面,通过组成型强启动子（PGK）控制的a凝集素表面展示系统,构建一个可共代谢纤维素半纤维素的双支架纤维小体。通过免疫荧光、流式细胞术及酶催化活性的测定,证明纤维小体结构能正确组装并以活性形式固定在细胞表面。以纤维素和半纤维素为底物进行乙醇发酵实验,60 h时最大乙醇产量达1.98 g/L,乙醇产率为0.33 g/g,相当于理论值的65%。结果证明,表面展示嵌合纤维小体的酿酒酵母可实现共降解纤维素和半纤维素生产乙醇的目标。

嵌合纤维小体酵母菌群同步糖化发酵木质纤维素产乙醇的研究

为探究CBP酿酒酵母菌群表面展示嵌合纤维小体的协同作用,该文通过组装纤维素酶和半纤维素酶进行木质纤维素乙醇发酵的性能,构建由分别可表面展示纤维素酶嵌合纤维小体(由支架蛋白ScafI,内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶构成)和半纤维素酶嵌合纤维小体(由支架蛋白ScafII,内切木聚糖酶和外切木糖苷酶构成)的重组酿酒酵母菌EBY100株组成的CBP菌群。通过蛋白质的SDS-PAGE、Western Bolt验证、酶活性测定、细胞表面定位和纤维小体组装效率分析,证明了融合蛋白能够以活性形式组装成2种形式的嵌合纤维小体。以蒸汽爆破玉米秸秆为底物进行同步糖化发酵产乙醇,96 h时最大乙醇产量达到0.673 g/L,消耗每克碳水化合物的乙醇产量0.255 g,相当于乙醇产率理论值的50.1%,协同因子为1.06。结果证明两株酵母细胞表面的不同类型嵌合纤维小体在水解木质纤维素过程中存在明显的协同促进作用。

嵌合纤维小体的空间结构与汽爆玉米秸秆酶解动力学特征研究

为探究嵌合纤维小体的空间结构对其酶解动力学性能的影响,通过胞外自组装,将纤维素酶分别锚定在不同支架蛋白上,从而构建出具有不同空间结构的人工纤维小体。对比分析嵌合纤维小体和游离酶的热稳定性差异,并以汽爆玉米秸秆为底物进行酶解动力学分析,获得米氏常数(K_(m))、最大反应速率(V_(max))和底物反馈抑制常数(K)。结果显示,纤维素酶与支架蛋白的结合能使其热敏感度降低且热稳定性提高。此外,二级支架蛋白嵌合纤维小体水解汽爆玉米秸秆的K_(m)=0.02 mg/m L、V_(max)=19 mg/(m L·min)、K=0.04 mg/L,说明二级支架蛋白使酶与底物的亲和力比简单结构嵌合纤维小体提高19.8%,进而证明嵌合纤维小体的复杂空间结构能优化其酶解动力学特征、提高纤维素酶的热稳定性。