多引物对巢式PCR法检测HBV基因型的流行病学分析

目的:掌握我国北方地区乙型肝炎病毒(HBV)感染者HBV基因型分布情况,为了解其流行病学及临床意义提供基础. 方法:首先采用巢式PCR法对801份血清进行HBV DNA检测,其中包括154份健康人血清、594份HBV感染的各类肝病患者及53例抗HCV阳性血清标本.再采用HBV A- F六个主要基因型特异性多引物对巢式PCR法对HBV DNA 进行基因型检测及分析. 结果:在801例血清标本中有464例(57.9%)检测到HBV DNA,其中154名健康人血清阳性率为8.4%(13/154), 594例不同临床表现的乙肝患者血清HBV DNA总检出率为74.4%(442/594),二者相比差异显著(P<0.01);抗HCV阳性血清中检出HBV DNA占17%(9/53).464例HBV DNA阳性标本中,HBV基因型检出率分别是:A型为5.2%(24/464), B型为7.1%(33/464),C型为77.2%(358/464),D型2.4% (11/464),未检出E和F型,但尚有14例(3%)同时检出B型和C型,有24例未检出型别.急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、原发肝癌各不同临床表现组间基因型分布无统计学差异. 结论:结果看出,我国北方地区感染的HBV基因型存在A、B、C、D四个型别,其中C型为主(77.2%),各临床表现组基因型分布也均以C型为主,组间无统计学差异.

巢式PCR法检测不同类型标本中p16基因启动子过甲基化

目的 介绍一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法,即巢式甲基化特异性PCR法(nested-MSP,nMSP),探讨该方法最佳应用条件,并用该法分析新鲜癌组织、石蜡包埋组织及肿瘤患者血清中p16基因启动子的甲基化状态。方法 将基因组DNA变性成为单链,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA,所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物,进行巢式PCR扩增,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果 在3种类型的标本中都检测出了p16基因启动子的甲基化,比普通的甲基化特异性PCR法具有更高的灵敏度。结论 巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化分析。

通用引物巢式PCR法对哈萨克族食管鳞癌HPV感染的检测

目的:应用通用引物巢式PCR技术检测新疆哈萨克族食管鳞癌人乳头瘤病毒(HPV)的感染率,并探讨HPV与新疆哈萨克族食管鳞癌的关系.方法:提取新疆哈萨克族食管鳞癌及正常食管组织的DNA,应用通用引物HPV MY09/11及HPV G5+/6+进行巢式PCR,检测新疆哈萨克族食管鳞癌中HPV的感染率.结果:巢式PCR法扩增后检测到食管鳞癌中HPV感染率为66.67%,正常对照组为12.12%,两者差异有统计学意义(P<0.05).结论:本实验结果表明HPV可能是新疆哈萨克族食管癌发生的一个重要病因学因素,结合通用引物巢式PCR法可以更加方便可靠的检测HPV-DNA.

人野生型抑癌基因PTEN/MMAC1的巢式PCR法克隆、测序及表达载体的构建

目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为表达质粒 pc DNA- w P。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确。结论 :利用 RT- nested PCR法成功克隆了人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1c DNA序列并构建了表达质粒 pc DNA- w P。

巢式PCR法构建人细胞色素P4501A1基因cDNA全长T载体

目的构建含限制性内切酶位点KpnI,XhoI的人细胞色素氧化酶(CYP1A1)基因cDNA全长的pGEM -T载体。方法从培养的MCF-7细胞中抽提总RNA并根据人细胞色素P4501A1(CYP1A1,GeneBank NM- 000499)开放阅读框设计两对引物,采用巢式-PCR方法扩增CYP1A1 mRNA全长,凝胶分离并回收扩增的DNA片断,与T载体连接后转化大肠埃希菌DH5α,挑选3个阳性克隆,扩增培养后抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定, 再行测序分析。结果重组质粒PCR扩增得到1568 bp的片段,KpnI,XhoI限制性内切酶消化质粒证实目的片断成功插入至载体,测序分析也进一步证明了目的片段与GeneBank中CYP1A1 mRNA的序列同源性为99.9%。结论该实验成功地构建了含CYP1A1基因cDNA全长区域的T载体克隆,巢式-PCR是一种简便、特异、灵敏的方法, 可用于基因的检测和载体的构建。

逆转录—巢式PCR法分析胃癌活检组织CD44拼接变异体

目的 改进CD44基因异常表达检测方法，探讨该方法对胃癌早期诊断、转移监测的意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)结合巢式PCR(Nested PCR)技术，检测了89例胃镜活检标本，其中70例胃癌、19例癌前病变(11例非典型性增生、8例肠上皮化生)及其相应的病变旁正常组织活检标本CD44v(CD44拼接变异体)以及CD44v8—10(CD44外显子8—10拼接变异体)的表达。并对巢式PCR产物测序验证其可靠性。结果 建立了逆转录巢式PCR检测胃镜活检标本CD44异常拼接变异体方法。对巢式PCR产物测序证实符合相应的CD44核苷酸序列，结果可靠且更为简便。全部标本均有CD44s(CD44标准型)的表达。胃癌组织CD44v表达阳性率88．6％(62／70)，其中CD44v8—10阳性率72．9％(51／70)。癌前病变组织CD44v表达阳性率为81．8％(非典型性增生9／11)和37．5％(肠上皮化生3／8)，CD44v8—10阳性率在非典型性增生为72．7％(8／11)。病变旁正常组织CD44v阳性率16．9％(15／89)，其中CD44v8-10阳性率13．5％(12／89)。胃癌和非典型性增生组显著高于正常组。本研究对35例在我院行手术治疗的CD44v阳性患者进行了追踪，有2例胃癌患者第1次胃镜检查为非典型性增生，CD44v强阳性表达。分别在第二、三个月后再次行胃镜检查确诊为胃癌。结论 RT—巢式PCR方法灵敏度高、特异性好，应用此法检测CD44v及CD44v8—10在胃癌及非典型性增生活检组织中呈现高表达，可作为胃癌诊断和判断预后的标志之一。

镜检和疟原虫抗原快速检测(RDT)胶体金法及巢式PCR法在疟疾诊断中的价值

目的探究镜检、疟原虫抗原快速检测(RDT)胶体金法、巢式PCR法在疟疾诊断中的价值。方法选取2019年2月至2020年2月本中心收治的疑似疟疾患者50例作为研究对象,所有患者均接受镜检、RDT胶体金法、巢式PCR法,以实验室检测结合临床特征结果为金标准,比较3种方式检测结果。结果实验室检测结合临床特征结果显示,50例疑似疟疾患者中,阳性36例,阴性14例。经镜检法检出疟疾28例,检出率为46.67%;经RDT胶体金法检出疟疾35例,检出率为58.33%;经巢式PCR法检出疟疾30例,检出率为50.00%;RDT胶体金法准确度及灵敏度均高于镜检法、巢式PCR法,差异有统计学意义(P<0.05);3种诊断方法特异度、阳性预测值、阴性预测值比较差异无统计学意义。结论在疟疾临床诊断中,RDT胶体金法具有较高的灵敏度及检出率,且与镜检、巢式PCR法联合诊断,可进一步提高检出率,为临床治疗提供依据。

采用多对型特异性引物巢式PCR法研究江西省HBV基因型分布及其临床相关性

根据HBV全基因序列的差异≥8％或者S区基因序列差异≥4％可将其分为A、B、C、D、E、F等基因型。HBV基因型的分布具有地域性，东南亚地区慢性乙型肝炎病毒感染者中以B和C基因型为主。在我国，北方地区以C型为主，南方以B型为主。

阿胶的半巢式-多重PCR鉴别方法研究

采用半巢式-多重PCR(聚合酶链式反应)法鉴别阿胶中是否掺杂有马、猪和牛源性成分。首先采用液氮研磨法从阿胶中提取高质量的DNA(脱氧核糖核酸),以通用引物P1和P2进行第一轮扩增,并将扩增产物作为第二轮PCR的模板;再以包含通用引物P1和4种物种(驴、马、猪和牛)特异性引物A、B、C和D的混合引物进行第二轮多重PCR扩增;最后电泳检测第二轮扩增产物,根据电泳条带的分子量大小,判断阿胶产品的动物原材料是否掺假。结果表明,采用本方法可观察到不同动物DNA分子量之间的明显差异,通过DNA电泳结果直接判断阿胶产品中是否掺假。

荧光标记杂交双探针PCR融解曲线法在临床的应用评价

目的:对国产荧光标记杂交双探针PCR融解曲线法(FH—PCR—MC)检测乙型肝炎病毒聚合酶酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸基序(HBVYMDD)变异的试剂进行临床应用评价.方法:慢性乙型肝炎患者外周血浆标本217份,分别采用荧光标记Taqman探针定量PCR法(FT—PCR)和荧光标记杂交双探针PCR融解曲线法(FH—PCR—MC)检测HBVDNA含量和YMDD及其变异;其中78份HBVDNA阳性标本采用基因型特异性多引物对巢式PCR法进行基因分型(A—F),30份标本用PCR产物克隆测序法检测HBVYMDD及其变异.结果:血浆标本HBVDNA阳性率(≥1.0×106copies/L)为75.6%(164/217).YMDD及其变异检出率为67.7%(147/217).其中YMDD44.9%(66/147),YIDD22.5%(33/147).YVDD17.7%(26/147),YIDD/YVDD混合株10.9%(16/147),其他混合株4.0%(6/147);结合HBVDNA含量,HBVYMDD及其变异的检出下限为HBVDNA=5.0×106copies/L,但在106copies/L时检出率较低,仅为36.4%,随着HBVDNA含量增高,检出率显著增高(>80%),且在107copies/L时即有显著增高(χ2=7.177,P<0.01).在基因分型的78份标本中,C基因型占89.8%,B和D基因型分别占8.9%和1.3%,YMDD及其变异总检出率为100%,变异总检出率为59.0%;1份D基因型YMDD及其变异检测为YIDD/YVDD混合变异;B,C两种基因型变异检出率分别为71.4%和55.7%,但二者无统计学差异.以测序法的检测结果为相对标准,则FH—PCR—MC法检测HBVYMDD及其变异的相对敏感性、特异性和符合率分别为96.3%(26/27),100%(3/3)和96.7%(29/30);对于HBVYMDD及其变异的类型,两种方法检测结果一致.结论:FH—PCR—MC法是一种快速、特异的HBVYMDD及其变异检测方法,具有较高的检出率,且能区分YMDD及其变异的类型.

巢式MSP法检测胃癌患者血浆p16、MGMT基因甲基化

目的:探讨胃癌患者血浆p16和MGMT基因启动子区甲基化状态.方法:采用巢式甲基化特异性PCR法(nested methylation-specific PCR,nMSP)对69例胃癌患者血浆中p16和MGMT基因启动子区甲基化状态进行研究.同时以16例健康体检作为对照.结果:在受检的69例胃癌患者中,p16、MGMT基因启动子区甲基化率分别为30.4%(21/69)、17.4%(12/69).对照组未见p16、MGMT基因启动子区甲基化.胃癌患者血浆中存在p16和MGMT基因启动子区甲基化,其中p16基因启动子区甲基化与对照组相比差异显著,具有统计学意义.结论:检测血浆循环DNA中p16、MGMT基因启动子区的甲基化状态,可为胃癌的早期分子诊断提供了有用信息.

隐孢子虫病两种诊断方法的应用比较

目的对目前常用的两种检测隐孢子虫感染方法进行估价。方法取上海某牧场随机采集的20头奶牛粪便用改良抗酸染色法和巢式PCR(Nested PCR)法检测。结果两种方法均能检测出粪便中的隐孢子虫卵囊,改良抗酸染色法阳性检测率55%,Nested PCR法阳性检测率70%。结论:两种方法均能从感染隐孢子虫的奶牛粪便中捡出隐孢子虫卵囊,可根据需要选择。

新型冠状病毒巢式PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立一种检测新型冠状病毒的巢式PCR方法,作为实时荧光PCR法检测新型冠状病毒的补充,并探讨该方法在临床样本检测中的初步应用价值。方法根据新型冠状病毒基因保守序列,利用在线软件设计N、S基因引物,构建巢式PCR反应体系,N基因巢式PCR及产物测序用于定性检测,S基因PCR产物测序用于型别初步鉴定。检测梯度稀释新型冠状病毒阳性样本评价检测灵敏度,检测流感病毒和人冠状病毒OC43、229E、HKU1、NL63等样本评价其特异性。分别检测Ct值>33与Ct值<33的各15份新型冠状病毒阳性样本,对扩增产物进行测序及比对分析,对检测方法进行验证。结果所建立的巢式PCR法可扩增出355 bp N基因片段及449 bp S基因片段的特异性条带,冠状病毒229E、OC43、HKU1、NL63、H3N2亚型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、乙型流感病毒阳性样本无扩增条带。N基因片段最低检测限可达Ct值37.21。30份新冠核酸阳性样本中,巢式PCR检测的N基因阳性符合一致率达100%(30/30);S基因阳性符合一致率达60%(18/30)。28份样本N基因片段测序成功,BLAST与新型冠状病毒相似性100%。12份样本S基因片段可获得位点突变特征结果。结论建立了可特异检测新型冠状病毒的巢式PCR方法,并可通过对PCR扩增产物测序分析其位点突变特征,可作为实时荧光PCR法的补充。

人外周血心肌肌钙蛋白Ⅰ基因表达水平与心肌损伤程度的关系

目的:分子生物技术的发展,使监测心肌微小损伤成为可能。探讨外周血心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiactroponinⅠ,cTnⅠ)-mRNA对心肌损伤诊断的临床价值。方法:以电镜观察心肌损伤时的超微结构改变;从心肌组织和外周血中制备总RNA,以随机引物和反转录酶合成cTnⅠ-cDNA,再以巢式PCR扩增和测序分析;将cTnⅠ-mRNA扩增法用于临床诊断,与心肌酶谱(CK,CK-MB,AST,LDH)及cTnⅠ定性比较,以探讨其临床价值。结果:心肌损伤组织超微结构表现为心肌线粒体肿胀、嵴断裂、严重空泡样变及细胞核异形变、染色质浓缩边聚。巢式PCR法扩增cTnⅠ-mRNA片段的灵敏度为2μg/L,测序分析证实从心肌组织及外周血中扩增基因片段与原序列完全一致。对62例慢性心脏病患者外周血cTnⅠ-mRNA的扩增分析,其阳性率明显高于酶谱或cTnⅠ定性分析(P<0.05)。结论:心肌损伤时cTnⅠ-mRNA释放进入外周血,为心肌损伤诊断的敏感基因标志物。

厦门市乙型肝炎患者病毒基因型的分析

目的:采用多对型特异性引物,通过巢式PCR法检测厦门市乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情况.方法:收集250例HBV感染患者血清,提取血清中HBV DNA作为模板,设计HBV前S1基因和S基因中区域内设计出10条内外引物,并将其中8条型特异性内引物分成A,B两组,分别扩增A,B,C和D,E,F型HBV,然后将第2轮PCR产物以用30g/L琼脂糖进行电泳,根据PCR产物电泳显示的产物长度判定HBV基因型,以了解厦门HBV基因型分布情况.结果:共120例确定了HBV基因型.患者群中慢性乙型肝炎90例,占75.0%,急性乙型肝炎、肝炎肝硬化、原发性肝癌分别占5.8%(7/120)、6.7%(8/120)和12.5%(15/120).分型结果:B型58例(48.3%)、C型30例(25.0%),B/C混合型32例(26.7%).HBeAg阳性患者中B基因型占63.8%,B/C型混合感染21.9%;抗-HBe阳性患者中以B/C型混合感染68.8%,B型25.9%,HBeAg阳性组与抗-HBe组之间比较发现B型和B/C混合型之间(P<0.05).结论:厦门乙型肝炎患者HBV基因型以B型为主,B/C混合感染是一个值得重视的问题.

非甲～戊型肝炎患者血清HCV RNA测定及基因型分析

目的 探讨临床诊断为“非甲～戊型肝炎”患者中丙型肝炎病毒感染状况及基因型分析。方法 应用逆转录巢式 PCR(n PCR)法检测 HCV RNA,并对 HCV RNA核心区部分序列克隆测序分析。结果 6 0例临床诊断为“非甲～戊型肝炎”患者中 ,应用 n PCR法检测有 3例阳性 ,检出率为 5 %。3个 HCV北京分离株与 HCV 型核苷酸同源性为 94 %～ 96 %。基因进化树分析显示 3个北京分离株为 HCV 型。结论 临床诊断为“非甲～戊型肝炎”患者中 ,存在少数丙型肝炎病毒感染 ,其基因型以 HCV

肝癌细胞中γ-谷氨酰转肽酶基因甲基化研究

目的:研究肝癌细胞中γ-谷氨酰转肽酶(GGT)甲基化的改变。方法:纯化人肝癌及癌旁组织中总GGT及RNA,观察总GGT、膜结合和可溶性GGT的表达,并以逆转录巢式PCR扩增GGT非编码区基因片段,分析M_3位点的甲基化状态。结果:肝癌、癌旁和远癌组总RNA浓度呈明显的梯度升而趋势(P<0.05);癌组织总GGT、膜结合和可溶性GGT均高于癌周又远癌组织(P<0.05);在癌、癌旁及远癌组织中,特定基因片段的扩增检出率分别为100％、85％、75％,M_3位点低甲基化频率分别为75％、55％、50％。结论:肝癌组织中GGT呈异常表达与基因低甲基化状态有关。