猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。

牛病毒性腹泻病毒巢式RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)巢式RT-PCR方法,试验通过对我国近5年流行的BVDV毒株的全基因序列进行比对分析,选择BVDV的保守5′端非编码区(5′UTR)片段作为靶点,设计巢式RT-PCR引物,对内外套引物进行筛选,优化反应条件,并分析建立的巢式RT-PCR方法的敏感性和特异性,同时利用该方法对172份临床样品进行检测并与实时荧光定量PCR方法进行比较。结果表明:巢式RT-PCR方法的敏感性为1.8×10^(1)copies/μL,敏感性是仅使用一对引物进行一轮PCR扩增的100倍;该方法对BVDV具有较好的特异性,与水疱性口炎病毒(VSV)、猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)及蓝舌病病毒(BTV)均无交叉反应。从172份临床样品中共检出27份BVDV阳性样品,阳性率为15.70%,与实时荧光定量RT-PCR方法比较,符合率为81.82%。说明试验建立的BVDV巢式RT-PCR方法特异性、敏感性较好,可作为基层检测机构中诊断BVD的辅助检测方法。

沙地葡萄茎痘伴随病毒双重巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank数据库中的沙地葡萄茎痘伴随病毒(grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPaV)全基因组序列设计了2组巢式RT-PCR检测引物repF1/R1→repF2/R2和cpF1/R1→cpF2/R2,扩增片段分别为902 bp和438 bp。通过对第1轮PCR扩增中引物组合repF1/R1-cpF1/R1、dNTPs、Taq DNA聚合酶和cDNA用量的优化,以及第2轮PCR扩增中引物组合repF2/R2-cpF2/R2、dNTPs和Taq DNA聚合酶用量的优化,建立了GRSPaV双重巢式RT-PCR检测方法。采用该方法对109份葡萄样品进行检测,结果显示,2对普通PCR引物RSP 52/53和RSP 9F/9R的合计检出率为65.1%,2组单一巢式PCR引物repF1/R1→repF2/R2和cpF1/R1→cpF2/R2的检出率总和为93.6%,而双重巢式PCR引物组合repF1/R1-cpF1/R1→repF2/R2-cpF2/R2的检出率也达到93.6%。该技术在保证检测效率的基础上降低了检测成本,适用于大量田间样品的检测。

动物狂犬病病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

以GenBank收录的多基因型狂犬病病毒(RV)N基因序列为参考,设计了简并的PCR引物,建立了能够有效扩增7种基因型RV基因组片段的巢式RT-PCR(nested RT-PCR)方法,命名为RVN371。该方法能够检测到4.6个TCID50的SRV9固定毒,对犬、猪、蝙蝠及牛的狂犬病阳性脑组织样品均表现出良好的特感性:扩增产物目的带位置正确,未见非特异性扩增条带。对比试验表明,RVN371对街毒脑组织样品检测的灵敏度较乳鼠脑内接种试验(MIT)高出100倍;在对3种鼠脑固定毒、12种犬脑街毒样品的检测中,与RV检测的金标方法——免疫荧光试验(FAT)完全符合。RVN371为动物狂犬病的实验室诊断和流行病学研究提供了有利的工具。

用巢式RT-PCR检测精神分裂症患者血液标本中博尔纳病病毒p24基因

目的 :检测精神分裂症患者外周血单个核细胞 ( peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)标本中博尔纳病病毒 ( Borna Disease Virus,BDV) p2 4基因 ,探讨 BDV感染与精神分裂症的关系。方法 :用巢式 RT- PCR方法检测黑龙江省精神分裂症患者及正常人 PBMCs中 BDV- p2 4基因片段 ,同时扩增 β-肌动蛋白 ( β- actin)作为内参照。结果 :6 6例精神分裂症患者中 ,BDV- p2 4基因的阳性检出率为 2 8.8% ( 19/6 6 ) ;4 7例正常人中 ,BDV- p2 4基因的阳性检出率为 6 .3% ( 3/47) ,经比较两者间阳性率差异有显著性 ( P<0 .0 5 )结论 :证实中国存在 BDV感染 ,黑龙江省精神分裂症的发生可能与

柑橘碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法建立及应用

柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)是威胁柑橘生产的重要病原之一。本研究在柑橘碎叶病毒一步法RT-PCR检测体系的基础上建立了CTLV的巢式RT-PCR检测方法,并对其检测灵敏度及特异性进行了分析。结果表明,该方法检测灵敏度比一步法RT-PCR至少提高100倍,检测模板总核酸的最低浓度约1.27μg·L-1,具有良好的特异性。在对142个田间样品、24个茎尖苗及20个接毒的腊斯克枳橙的检测中,巢式RT-PCR的CTLV检出率最高,为21.5%,比半巢式RT-PCR检出率高3.2%,比一步法RT-PCR检出率高2.1%。该方法灵敏度高,特异性强,适用于对无病毒苗木生产的监控和田间样品的快速检测。

应用巢式RT-PCR结合RFLP、SSCP对山东肾综合征出血热病人血清中HV基因检测和分型研究

目的探讨山东肾综合征出血热重疫区病人血清中HV分子生物学特征,同时寻找准确、简便、迅速的HV检测与分型方法,从而为制定防治决策提供科学根据。方法从山东肾综合征出血热重疫区临沂市费县收集病人早期血清,应用巢式RT-PCR对病人血清中的HV进行基因扩增,采用RFLP、SSCP分型,并进行序列测定与分析。结果48份临床和ELISA检测确诊的HFRS病人血清经巢式RT-PCR扩增后,41份阳性,阳性率85.42%。41份阳性标本巢式RT-PCR产物经HindIII、HinfI酶切后,呈现2种不同的RFLP图谱:33份显示与R22株相似的酶切图谱,应属SEOV型;另外8份显示出与HTN76-118株相似的图谱,属HTNV型,这8份HTNV型标本均为10-12月间收集的病人血清。41份阳性标本巢式RT-PCR产物经SSCP分析,亦呈现2种不同的图谱:33份具有与R22株相似的SSCP图谱,应属SEOV型;而另8份则与HTN76-118株具有相似的SSCP图谱,属HTNV型。对部分扩增产物序列采用系统进化树分析也得出类似的结果:sdp1、sdp2、sdp3与HTN型76-118株亲缘关系相近,属同一簇,而sdp22、sdp37与SEOV型Z37、R22株亲缘关系相近,属另外一簇,这与RFLP和SSCP获得的结果相一致。结论山东肾综合征出血热重疫区病人基因型以SEOV型为主,但在秋冬季节也存在HTNV型。巢式RT-PCR结合RFLP、SSCP法可对HV准确分型,而且简便、迅速,适合于大规模流行病学调查。

巢式RT-PCR方法检测胃癌病人周围静脉血癌细胞及其意义

探讨胃癌患者外周血癌细胞的检测及其意义。方法：以CK19作指标，用巢式RT-PCR方法检测42例胃癌患者术前外周血中癌细胞。结果：健康人外周血中不能检测出CK19mRNA表达，用巢式RT-PCR方法检测外周血中胃癌细胞的敏感性可达1/106；42例胃癌病人外周血中检测出CK19mRNA阳性表达13例，阳性率30.9%，阳性结果与肿瘤大小、浸润深度和肿瘤分期密切相关。结论：巢式RT-PCR方法检测胃癌外周血癌细胞具有高度的特异性和敏感性，检测外周血癌细胞有助于判断肿瘤的进展程度。

柯萨奇病毒B5巢式RT-PCR检测方法的建立

目的:建立一种快速、灵敏、特异的柯萨奇病毒B5(CVB5)检测方法。方法:根据GenBank发表的CVB5河南分离株全基因组序列,在其VP1区设计并合成巢式RT-PCR引物,优化PCR反应条件,建立检测CVB5的巢式RT-PCR方法。将已测得TCID50的病毒标准株进行10倍梯度稀释后用上述方法检测,以评价该方法的灵敏性;将5株不同的CVB5毒株和EV71等4株其他肠道病毒毒株及阴性对照用该方法进行扩增,以检测其特异性。用建立的巢式RT-PCR方法对52份病毒性脑炎病例样本进行检测。结果:该方法对CVB5的两轮PCR扩增敏感性分别为10TCID50和10-4TCID50;所有CVB5毒株用该方法扩增结果均为阳性,所选其他肠道病毒扩增结果均为阴性。52份临床病例样本中检出10份CVB5阳性,阳性率为19.23%。结论:所建立的CVB5巢式RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异度。

多重巢式RT-PCR对骨髓增殖性肿瘤中PDGFRα融合基因的快速检测

本研究旨在探讨多重巢式RT-PCR在骨髓增殖性肿瘤(MPN)中快速检测血小板衍生生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRα)融合基因的应用价值。利用多重巢式RT-PCR方法对146例MPN患者的骨髓或外周血标本进行PDGFRα融合基因的快速检测。结果表明,146例MPN患者的骨髓或外周血标本中,有6例出现PDGFRα融合基因,其阳性率为4.11%,其中4例患者服用酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼治疗,均获疗效。结论:本研究建立的多重巢式RT-PCR方法具有灵敏度高、特异性好、检测快速等优点,可以准确快速确定MPN的分子类型,并为该病提供诊断和治疗的理论依据。

半巢式RT-PCR法检测呼吸道合胞病毒

目的 建立快速、敏感、特异的人呼吸道合胞病毒 (Respiratorysyncytialvirus ,RSV)检测方法。 方法 根据RSVF基因的保守序列设计 3条引物 ,建立半巢式RT -PCR(semi-nestedRT -PCR)检测方法。用该方法检测12 5例患急性下呼吸道感染的婴幼儿的鼻咽吸引物 (nasopharyngealaspirates,NPA)标本 ,同时对标本进行病毒分离和直接免疫荧光法检测。结果 该半巢式RT -PCR灵敏度为 0 .1TCID50 ,用该方法在 12 5例标本中共检出RSV阳性标本 6 3例 ,阳性率 5 0 .4 %。结论 建立快速、敏感、特异的RSV半巢式RT -PCR检测方法 。

巢式RT-PCR检测胃癌患者外周血循环癌细胞的研究

目的 分析胃癌患者外周血中CK 2 0mRNA及CEAmRNA的异常表达及意义。方法 采用RT PCR方法检测 5 2例胃癌患者术前外周血中CK 2 0mRNA及CEAmRNA的表达。结果 胃癌患者外周血中CK 2 0mRNA、CEAmRNA阳性表达率分别为 42 .3 % (2 2 /5 2 )及 5 1.9% (2 7/5 2 ) ,CK 2 0mRNA和CEAmRNA两者中至少 1个基因为阳性的表达率为 63 .5 % (3 3 /5 2 )。胃癌患者外周血中CK 2 0mRNA表达与胃癌的远处转移有关 ,CEAmRNA表达、CK 2 0mRNA和CEAmRNA都表达、CK 2 0mR NA和CEAmRNA两者中至少 1个表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移和远处转移相关 (P <0 .0 5 )。结论 胃癌患者外周血CK 2 0和CEA的RT PCR检测有助于患者预后的判断 ;联合检测CK 2

巢式RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的意义

目的探讨巢式RT-PCR技术在检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML/RARα融合基因的价值。方法采用巢式RT-PCR检测218例初诊为APL患者的PML/RARα融合基因的表达水平及在部分患者的动态变化;随机选择39例APL完全缓解(CR)的患者,分别用流式细胞术(FCM)和巢式RT-PCR监测外周血或骨髓中的微小残留病(MRD)白血病细胞。结果在确诊的167例APL患者中PML/RARα融合基因阳性率为90.4%(151/167);39例APL-CR患者中PML/RARα融合基因阳性率76.9%(30/39);FCM和巢式RT-PCR监测APL-CR患者MRD有很好的一致性(P>0.05)。结论巢式RT-PCR对APL的诊断有高灵敏度和高特异性;对APL的疗效及预后判断有重要临床意义。

猪诺如病毒巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

为了解中国猪群中猪诺如病毒感染情况,本研究根据猪诺如病毒保守的RNA依赖性RNA多聚酶(RNA Dependent RNA Polymerase,RDRP)基因序列设计了一套巢式RT-PCR引物,用该引物从猪粪便样品中扩增出与预期目的产物大小一致的条带,经克隆、测序后获得的序列与GenB ank数据库序列比对,证明所扩增的序列属于猪诺如病毒,表明本研究成功建立了猪诺如病毒巢式RT-PCR检测方法。该检测方法具有高特异性和敏感性,应用该方法检测某猪场健康育肥猪粪便样品,阳性率为54.5%。通过RDRP基因进行核苷酸同源比对发现本文获得的猪诺如病毒Wuning 1株属于GII群诺如病毒,与美国猪诺如病毒毒株OH-QW101/03/US、中国猪诺如病毒毒株Norovirus pig/GII/Ch6/China/2009核苷酸序列同源性最近。值得注意的是猪诺如病毒Wuning1毒株与武汉人诺如病毒毒株E2120/CHN/2010核苷酸同源性高达77.1%,说明猪诺如病毒Wuning 1毒株与武汉人诺如病毒基因组上亲缘性较近。本研究成功建立了一种检测猪诺如病毒的巢式RT-PCR方法,并应用于临床猪粪便样品的检测,为猪诺如病毒的诊断与监测提供了可供借鉴的方法、为猪诺如病毒的进化、分子病毒学及与人诺如病毒关系的深入研究提供依据。

巢式RT-PCR技术检测肺癌患者外周血及淋巴结中微量转移癌细胞

目的 建立检测肺癌患者外周血及淋巴结中微转移癌细胞的敏感分子检测方法 ,并探讨其临床应用价值。方法 采用巢式反转录聚合酶链反应 (RT- PCR)技术特异引物扩增细胞角蛋白 19(CK19) m RNA,检测76例肺癌患者外周血及淋巴结中 CK19m RNA的表达情况。结果 76例肺癌患者中 39例外周血 CK19m RNA阳性 ,阳性率为 5 1.3% (39/ 76 ) ,2 7例肺良性病变中仅 1例阳性 ,阳性率 3.7% ,15例健康对照者均为阴性。全部肺癌患者 15 7枚淋巴结中 CK19m RNA阳性率 38.9% (6 1/ 15 7) ,常规病理方法检测淋巴结阳性率 14 .6 % (2 3/15 7) ,两者相比 ,P<0 .0 5 ;HE染色阴性的 134枚淋巴结中 ,经巢式 RT- PCR技术检测证实存在癌转移的阳性率为 2 8.3% (38/ 134) ,两者相比 ,P<0 .0 5。结论 巢式 RT- PCR技术是一种特异性和敏感性均较高的微量癌细胞转移检测方法 。

巢式RT-PCR技术检测肺癌76例微量癌细胞转移分析

目的 :建立检测肺癌患者外周血及淋巴结微转移癌细胞的敏感的分子检测方法 ,并探讨其临床应用的意义。方法 :采用巢式逆转录聚合酶链反应 ( RT- PCR)技术特异引物扩增 CK19- m RNA,以检测肺癌患者外周血及淋巴结中 CK19- m RNA的表达情况。分析CK19- m RNA扩增结果与患者临床指标的关系。结果 :76例肺癌患者外周血标本中 39例CK19- m RNA阳性 ,阳性率为 5 1 .3% ,2 7例肺良性病变中仅 1例阳性 ,阳性率为 3.7% ,1 5例健康对照者均为阴性。全部患者 1 5 7枚淋巴结中 CK19- m RNA检测出阳性率为 38.9%( 61 / 1 5 7) ,常规病理方法检出阳性率为 1 4.6% ( 2 3/ 1 5 7) ,两种方法比较 ,有显著性差异 ( P<0 .0 5 ) ,且 HE染色阴性的 1 34枚淋巴结中 ,经 RT- PCR法证实存在癌转移的阳性率为 2 8.3% ( 38/ 1 34) ,两组比较有显著性差异 ( P<0 .0 5 )。结论 :巢式 RT- PCR是一种特异性和敏感性均较高的癌细胞微量转移检测方法 ;可能有助于肺癌细胞微转移的早期诊断。

采用半巢式RT-PCR检测兰州地区住院肺炎患儿下呼吸道分泌物中的RSV

从人呼吸道合胞病毒(hRSV)基因序列中高度保守的N基因处,设计了特异性半巢式引物,以反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法随机检测了46份兰州地区2007年春季住院肺炎患儿下呼吸道分泌物样本。结果46份样本中有19份扩增出了预期目的片段,对所有扩增产物进行基因序列测定。结果表明19份样本均有RSV感染,其检出率为41%,而且序列分析结果显示,所有RSV阳性样本均与RSVA亚型的同源性高于B亚型。

巢式RT-PCR检测外周血中前列腺特异膜抗原mRNA

目的 :应用巢式逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)检测外周血中前列腺特异膜抗原 m RNA(PSM- m RNA)并探讨其临床意义。 方法 :取 4 0例不同分期前列腺癌患者及对照组 30例 (15例良性前列腺增生患者 ,15例健康青年男性 )周围静脉血各 10 ml,用巢式 RT- PCR检测 PSM- m RNA,并培养 L NCa P细胞进行阳性对照。 结果 :共有 2 4例前列腺癌血标本检测出PSM- m RNA (6 0 .0 % ) ,前列腺增生及健康对照组中无 1例阳性 ;19例伴有远处骨转移的前列腺癌患者中 16例检测到PSM- m RNA (84 .2 % ) ,未发现远处转移的 2 1例中 8例阳性 (38.1% )。在 10 m l正常血液中加入 10个 L NCa P细胞 ,可检出PSM- m RNA。结论 :PSM- m RNA可作为前列腺癌的辅助诊断指标 ,PSM- m RNA的检出率与前列腺癌分期 (ABCD)、转移与否、血清 PSA水平有相关性。