荧光差异显示PCR克隆大鼠脑缺血相关基因KIAA0280

【目的】研究大鼠急性局灶性脑缺血时缺血组织与非缺血组织中基因表达的差异,克隆出与脑缺血相关的基因。【方法】应用荧光差异显示PCR(FDDPCR)从同一例大鼠大脑皮层缺血组织和非缺血组织中筛选出有表达差异的基因片段,经反向Northernblot杂交,将杂交阳性的片段且经RT-PCR反复验证,选取差异明显的片段进行克隆测序;经生物信息学分析处理,选取同源性低的EST片段R6,利用cDNA5'端快速扩增PCR(5'RACE法)进行基因全长的克隆。【结果】利用5'RACE法成功地克隆EST片段R6至编码区,扩增并获取全长4821bp及完整的可读框(ORF),RT-PCR及Northernblot印迹结果证实了克隆的结果,同源性分析发现该基因ORF与人大脑中已知的KIAA0280基因高度同源,同源性96%,编码166个氨基酸,为结构及功能未明确蛋白质,该基因定位于大鼠第11号染色体长臂(11q.13)。【结论】应用荧光差异显示PCR成功地自大鼠体内克隆到与人KIAA0280相似的基因,其在大鼠急性局灶性脑缺血中明显上调,该蛋白质结构及功能均未见报道及研究,其显著地差异表达提示其在脑缺血病理过程中具有重要作用。

荧光差异显示PCR分离果蝇七氟醚敏感性相关基因

吸入麻醉药是临床上常用的一类全身麻醉药 .为深入研究吸入麻醉药的作用机理 ,以本实验室创建的对七氟醚敏感的果蝇品系 (F PS1 )和耐药 (F PR1 )的果蝇品系为研究模型 ,以野生型黑腹果蝇 (Drosophilamelanogaster)为对照 ,应用荧光mRNA差异显示PCR (fluorescentdifferentialdisplayreversetranscriptional PCR ,fluoroDDRT PCR)方法 ,分离与吸入麻醉药七氟醚敏感性相关的候选基因(EST) .在分离到的 32个差异片段中 ,经Northern印迹杂交鉴定后 ,得到 1个阳性片段 (No .4 1 ) ,其在敏感品系果蝇中表达较高 .通过cDNA末端快速扩增技术 (rapidamplificationofcDNAends ,RACE)克隆和拼接获得了 1 75kb的全长cDNA ,该基因位于Chr2R 4 5F3区域内 ,为一已知序列的新基因 .实验结果与前期工作用遗传学定位方法所得结果一致 ,从而可推测决定七氟醚敏感性的相关基因可能位于果蝇第 2号染色体上 .

用差异显示PCR技术克隆冬小麦春化设定cDNA克隆实验系统的建立

差异显示PCR技术是一种新近发展起来的在真核细胞中检测与克隆特异表达基因的手段。本文建立了用此技术克隆春化相关基因的研究系统,并提供了诸如总RNA的提取、污染DNA的去除、sscDNA的逆转录、PCR参数、扩增cDNA的电泳、特异cDNA的收集与重扩增等在方法上的细节。用这种技术分离了一个仅在春化20天这一特异时期表达的春化设定cDNA克隆VPC28。这些结果也适用于更加广泛的类似研究。

荧光差异显示PCR克隆参与胃腺癌转移的基因wcl1

使用来源于同一个胃腺癌病人的原发灶RF 1(ATCC编号CRL 186 4 )和转移灶RF 4 8(ATCC编号CRL 186 3)作为研究肿瘤转移的模型 .通过荧光差异显示PCR(FDD PCR)技术 ,克隆了 4 5个涉及胃腺癌转移相关基因 .和原发灶CRL 186 4相比 ,发现在转移灶CRL 186 3细胞中有 38个基因被显著上调 ,7个基因被显著下调 ,包括未被发现的基因 3个 .利用生物信息学技术对其中 1个在RF 4 8中高度上调的wcl1进行克隆和鉴定 ,发现wcl1的cDNA全长为 6 6 4bp ,含有 1个 2 4 0bp的完整阅读框 .用RT PCR和Northern印迹证实 ,结果与克隆拼接的大小完全一致 (NCBI数据库收录号AF36 4 86 3) .wcl1编码肽位于胞浆内含 79个氨基酸 ,理论上的pI Mr:5 2 8 896 1 72 .氨基酸序列分析发现 ,其N端 4～ 5 5氨基酸处为未知功能区UPF0 0 16蛋白 ,5 7～ 78处有一段亮氨酸拉链结构域 ,未发现与已知的蛋白质有高度的同源性 .该基因定位于 11q14.组织分布表明 ,wcl1除在分化差的胃腺癌中的表达要高于相应的正常胃组织 ,在微血管内皮中表达也明显高于乳腺管癌、脑纤维状星形细胞瘤 ,未检测到在其它组织有分布 .研究提示 ,Wcl1可能为胃腺癌转移过程中参与核内基因转录的相关蛋白质 .

mRNA差异显示PCR的研究进展

mRNA差异显示PCR技术是在基因转录水平上研究差异表达和性状差异的有效方法之一,该方法在生物的发育、性状和对各种生物、理化因子作用时应答过程基因表达的研究中应用十分广泛,笔者简述了mRNA差异显示PCR技术的基本原理、技术改进以及此技术在球虫抗药性研究中的应用。

差异显示PCR技术在念珠菌基因表达研究中的应用

目的探讨差异显示PCR技术(DD-PCR)在念珠菌基因表达研究中的方法学要点。方法将临床阴道来源的白色念珠菌氟康唑敏感菌株435体外诱导氟康唑耐药性,于诱导80d得到耐药子代435-2,采用长引物差异扩增、银染显示差异条带、反式点杂交预筛选及非放射性法标记探针的改良的DD-PCR,比较435与435-2在有药及无药培养基中的表达差异。结果在435-2含药培养组中得到较435-2、435无药培养组表达明显增强的片段N2、N3、N12,分别与数据库中白色念珠菌的醇脱氢酶基因ADH1、拓扑异构酶基因TOP2及多药耐药基因CDR1基因有高度同源性;半定量RT-PCR中证实了ADH1、CDR1基因在耐药株中的高表达。结论ADH1、CDR1基因的高表达与白色念珠菌氟康唑耐药性形成相关,ADH1可能是新的耐药基因;改良的DD-PCR技术降低了假阳性率的产生,使确证步骤更加便捷,在念珠菌研究领域有很好的应用前景。

mRNA差异显示PCR技术在水稻研究中的应用

mRNA差异显示PCR技术是在基因转录水平上研究基因差异表达和性状差异的有效方法之一,该方法在生物的发育、分化和对各种生物、理化因子作用时应答过程基因表达的研究中应用十分广泛。就mRNA差异显示PCR技术的基本原理、优点与不足、改进与完善等作了简要归纳,综述了该方法在水稻的发育分化、激素调控、抗逆性和抗病性等方面所取得的研究成果,并对该方法在水稻方面的应用前景作了简单分析。

通过荧光差异显示PCR法分离水稻中由ABA调节的基因

脱落酸(ABA)在植物种子发育以及植物细胞对外源环境因子(如逆境、胁迫等)反应过程中起着重要的作用,对其调节基因的分离将有助于了解其相关信号传导途径及作用机制。通过荧光差异显示PCR法我们由水稻中分离了部分ABA调节的cDNA片段,在所分离克隆的17个片段中,有14个片段被ABA诱导(2、4、8、12h),有3个片段被ABA抑制(8h)。测序及序列分析表明这些片段可能分别编码与植物光合作用(7)、信号传导(1)、转录调控(2)、代谢(6)相关的蛋白或未知蛋白(1)而且其表达可能受到ABA的调节或ABA参与了其作用,对其中可能编码α/β水解酶折叠蛋白、酪氨酸磷酸酶、液泡H^+-ATPase的mRNA进行的RT-PCR和Northern blot分析,确证了ABA对它们表达的调节作用。在此基础上对FDD-PCR技术及ABA作用的可能机制进行了讨论。

运用多种策略改良差异显示PCR

目的 :改进差异显示PCR技术 ,提高其在筛选差异表达基因方面的效率。方法 :①采用单碱基铆钉引物 ;②增加引物长度 ;③提高PCR反应的严谨性 ;④应用同步重复测序电泳。结果 :减少了经典方法的工作量 ,降低了非特异性和假阳性率。用改良技术研究热适应大鼠下丘脑基因的差异表达 ,发现了一个差异表达基因片段 ,斑点杂交证实为阳性片段。结论 :改进后的差异显示PCR技术是一种研究基因差异表达从而发现新基因或基因新功能的有效方法。

施氏假单胞菌75 mRNA差异显示PCR方法的建立

为丰富原核生物基因表达差异的研究方法,将应用于真核生物中的差异显示PCR方法应用于原核生物基因差异表达的研究,以1株有机磷农药乐果的降解菌施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzer)75为研究材料,以5′末端依赖性的RNA外切酶(Terminator Exonuclease)降解其中的16S rRNA和tRNA,并用随机引物替代锚定引物,改良真核生物差异显示PCR,建立原核生物mRNA差异显示PCR的试验体系。以LB培养基培养的菌株为对照组,以无机盐培养基(乐果为唯一碳源)为试验组。结果表明:提取总RNA,通过5′-磷酸基团依赖的核酸外切酶降解法获得mRNA,经逆转录,用双随机引物扩增获得253个差异基因,16S rRNA、tRNA的污染较少,其中之一为硫酸盐运输蛋白基因。

用差异显示反转录PCR银染技术研究植物基因表达的差异

通过调整差异显示反转录PCR (DDRT PCR)中总RNA、锚定引物、随机引物、cDNA和dNTP等关键试剂的用量 ,优化了适用于银染检测的DDRT PCR方法 .PCR扩增产物经 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离后 ,银染能检测到多而清晰的条带 .泳道中的条带数最少为 40个 ,最多达 80个 ,平均为 6 0个 ,条带大小分布在 10 0～ 90 0bp范围 ,灵敏度为 5pg/mm2 .此方法操作简便快速 ,灵敏度高 ,重复性好 .采用这个改良的方法 ,分析了拟南芥野生型和ast突变型基因表达的差异 .从 16 0 0 0个cDNA扩增产物条带中筛选出 2 8个差异条带 .二次PCR扩增后 ,进一步筛选出 13个差异条带 ,其中 7个是野生型特异表达的 ,6个是突变型特异表达的 。

限制性差异显示RT-PCR技术对大鼠脑缺血相关基因表达的研究

目的研究大鼠急性局灶性脑缺血时缺血与非缺血组织中基因表达的差异,以及差异表达基因随时间变化的规律,为临床寻找新的防治脑缺血的靶点奠定基础。方法采用线栓法制备大鼠不同时间脑缺血动物模型,采用限制性差异显示RTPCR技术(restrictiondisplayRTPCR,RDRTPCR),研究在大鼠局灶性脑缺血过程中差异基因的表达。结果在缺血后各时间点分别出现上调的EST片段有32条、下调的有13条。其中7条在缺血0.5、1.0、4.0小时均出现变化,分别系同一对引物所扩增且分子量相同,其在脑缺血中的表达具有一定的规律性。结论利用RDRTPCR技术成功获取了大鼠脑缺血过程中差异表达的基因,并揭示了部分基因在脑缺血过程中呈现的规律性变化,为进一步筛选、鉴定与克隆表达这些与脑缺血密切相关的基因,阐明脑缺血发病机制奠定基础。

苏太猪肌内脂肪沉积相关基因SRC-1的差异显示反转录PCR鉴定

采取90头180日龄去势苏太猪的背最长肌组织测定肌内脂肪含量,从中选取肌内脂肪含量差异极显著(P<0.01)的最高和最低各6头组成RNA池,采用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)鉴定两组间差异表达的基因,结果共获得14条表达序列标签(expressed sequence tags),即EST序列,通过GenBank比对发现其中3条为已知序列。为进一步验证这3个已知基因与肌内脂肪之间的关系,从90个个体中选取肌内脂肪最高和最低各15个个体进行实时定量PCR检测。结果表明,细胞核受体共激活因子1基因(SRC-1)mRNA表达水平与肌内脂肪含量存在负相关关系(r=-0.38,P<0.05)。提示:SRC-1蛋白有可能参与了肌内脂肪沉积的调节。

利用DD-PCR技术研究扬稻6号基因的差异表达

利用DD-PCR技术对扬稻6号参与的强优势组合(扬两优6号和两优培九)、明恢63参与的弱优势组合、R13参与的中强优势组合以及亲本的基因表达进行了分析。根据基因在杂交组合和双亲中的表达情况分为8种类型,统计30个引物组合在11个参试材料中的表现,获得314组差异条带,大小在250 bp至1 000 bp之间,其中强优势组合的差异表达带型UNP1、UNF1和ABF1明显低于弱优势组合,而DMP2和MONO则明显高于弱优势组合。用8种类型所占的比例对各参试材料进行聚类分析,结果显示,扬稻6号参与的强优势组合和明恢63参与的弱势组合明显被分为两类,两者在基因表达模型上存在一定差异。此外,在基因表达水平上探讨了扬稻6号杂种优势的特殊分子基础。

利用mRNA差异显示技术筛选丝羽乌骨鸡肝脏差异表达序列标签

为了找出可能与丝羽乌骨鸡独特性状形成相关的基因,本研究运用差异显示PCR技术等对丝羽乌骨鸡与快大型肉鸡肝脏组织中差异表达的基因进行筛选,并通过生物信息学方法对所筛选出的差异表达序列标签进行分析。结果,本研究共筛选得到10条丝羽乌骨鸡与快大型肉鸡肝脏差异表达序列标签（dbEST登录号：CN606328~CN606329、CN606331~CN606338）。生物信息学分析结果显示：10条ESTs中,CN606332和CN606336是家鸡的18S rRNA基因部分序列,CN606333与编码家鸡热休克蛋白70的基因（HSPA5）同源,CN606328、CN606331与家鸡已有核酸数据库中的cDNA克隆或EST具有较高相似性,但功能未知。其他5条表达序列标签在家鸡核酸数据库中未发现相似序列,但分别与其他物种的细胞膜蛋白基因、γ-谷氨酰转肽酶（gamma-glutamyl transpeptidase）基因、ATP-binding cassette transporter基因、推定蛋白MGC27019基因以及异常纺锤型小脑畸形症（abnormalspindle microcephaly,ASPM）蛋白基因有不同程度的相似性。本研究结果表明,丝羽乌骨鸡与快大型肉鸡可能在多种代谢途径上都存在差异表达的基因,通过进一步深入研究这些差异表达基因,可以为研究丝羽乌骨鸡独特性状的形成提供重要的信息。

反转录差异显示技术及其方法的改进

运用mRNA反转录差异显示技术可以了解不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下的基因表达状况 ,为研究生命活动过程提供重要信息。文章对差异显示反转录聚合酶链式反应技术的基本原理 ,优点与缺点 ,以及近年来对该技术涉及的RT PCR方法、引物设计、PCR反应参数、电泳及差异条带的显示方法以及杂交方式进行了论述和评价 ,并对其应用前景进行了简单分析。

应用mRNA差异显示技术筛选绵羊皮肤毛囊差异表达序列标签

为寻找与绵羊羊毛生长相关的基因,应用mRNA差异显示技术(DD-PCR)筛选拔毛皮肤与正常皮肤表达水平有差异的cDNA,用Northern blot证实差异显示基因片段,对差异基因进行测序和同源比较。经差异显示分析,共找到差异表达的序列片段21个;经2次扩增、克隆、Northern Blot分析,最终确定2个差异条带SQ70和SQ75。对这两个差异条带进行测序及生物信息学分析,发现SQ70是绵羊皮肤中与组织修复相关的EST片段,而SQ75是绵羊皮肤或者是毛囊中高表达的未知EST片段。以上结果表明,SQ70和SQ75可能是与绵羊羊毛生长密切相关的基因表达产物,对于这两个ESTs具体的生物学功能有待于进一步研究。

差异显示逆转录PCR技术及其应用和进展

差异显示逆转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）技术是一种筛选和克隆差异表达基因的新方法。该方法利用ｃＤＮＡ逆转录技术、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）的高效扩增和凝胶电泳分离技术，能同时显示多种来自相关细胞的ｍＲＮＡ样品。可用于多种研究目的，如鉴别和观察基因表达的改变；差异表达基因的迅速测序并与基因库比较；单个的差异表达基因片段能迅速克隆并制成探针从ｃＤＮＡ文库或基因组文库中分离基因等。ＤＤＲＴ－ＰＣＲ技术具有迅速、简便、灵敏和高效等优点，已被广泛地应用于癌症、心脏疾病、细胞分化、衰老及其它领域的研究中，并且在应用中被不断地改进和发展而更趋合理和完善。