cDNA文库的差异筛选与抑制性减数杂交相结合分离胡萝卜体细胞胚根发育相关基因

应用cDNA文库差异筛选与抑制性减数杂交相结合的技术程序,并通过反向Northern分析进一步验证,成功地从解调控12 h的胡萝卜体细胞胚的cDNA文库中,分离到7个在解调控12h特异表达的基因.其中4个含有完整的编码框,分别编码木质葡聚糖内转糖基化酶、脂肪酸去饱和酶、一种poly(A)结合蛋白和一种酰基转移酶.另外3个是5＇端部分缺失的cDNA基因片段,分别编码三磷酸甘油醛脱氢酶、一种糖蛋白和一种与单链RNA/DNA结合的蛋白.对其中部分基因的Northern分析结果显示,它们的表达量在蔗糖调控下的胡萝卜体细胞胚根发育的不同时期均有显著变化,说明它们都是与胚根发育相关的基因.

奶牛乳房炎抗性基因的反向Northern斑点杂交差异筛选

分别用地高辛标记患乳房炎奶牛和健康奶牛外周血白细胞cDNA探针,对已构建的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库应用反向Northern斑点杂交技术进行差异筛选,筛选出的50个差异表达克隆测序后获得48个EST序列。根据在GenBank非冗余核酸数据库(nr)和EST数据库中Blastn序列比对结果,将这些EST分为3类:第一类代表已知基因,共35个;第二类代表已知EST,共5个;第三类为新EST,共3个。35个代表已知基因的ESTs按照基因功能分为八类:信号转导与细胞间通信(8.57%)、细胞结构与运动(11.43%)、细胞凋亡(5.72%)、细胞与机体防御(20.00%)、物质转运(8.57%)、翻译与表达调控(20.00%)、代谢(14.20%)及其它(11.43%)。结合相关文献初步探讨了部分患乳房炎奶牛外周血白细胞差异表达基因的功能和意义,其中BNBD5、IgJ、MIP-3、MnSOD、AHCY、WIP等基因可能在奶牛乳房炎抗性中发挥重要作用。

菌落PCR差异筛选cDNA片段文库

目的探索菌落PCR差异筛选cDNA片段文库的可行性。方法在用抑制性PCR构建cDNA片段文库的同时,分别制备正、反向减法杂交探针并用碱性磷酸酶直接标记。随后用这些探针与菌落PCR的产物杂交,从而筛选出差异表达克隆,并再次用RT-PCR证实其差异表达。结果建立的菌落PCR反应体系经济实用,方法稳定,并成功地从500个克隆中筛选出差异表达克隆。结论菌落PCR可用于差异筛选构建于质粒载体的cDNA片段文库。

异双聚体电泳及其在遗传学差异筛选中的应用

介绍了一种灵敏、简便、快速测定双链PCR产物或DNA片断单个碱基差异的方法。该法借助常规PAGE电泳，能区分出有单个碱基错配而发生构型改变的异双聚体与碱基互补配对的同源双聚体双链DNA分子；并判断出序列中碱基错配的百分率。

肥胖症脂肪组织表达蛋白差异筛选初步研究

目的 :比较肥胖症患者和非肥胖对照者脂肪组织蛋白表达的差异。方法 :采用蛋白双向凝胶电泳技术分离脂肪组织总蛋白 ,PD Quest软件分析电泳结果 ,选择有显著差异的蛋白点做介质辅助的激光解吸飞行时间质谱 (MALDI TOF MS)分析。结果 :两种脂肪组织标本大部分蛋白点匹配 ,经MALDI TOF MS分析和数据库搜索有一个未知蛋白和两个已知序列蛋白在两种脂肪组织的表达差异有显著性。结论 :双向凝胶电泳技术和MALDI TOF MS是进行脂肪组织蛋白质组研究的有效手段 ,通过分析这些表达有差异的蛋白质可以进一步明确肥胖症的病因 。

差异筛选与基因克隆

1995年,科学家首次发表研究报告,证实受发育过程特异性诱导表达的启动子指导细菌异戊烯转移酶基因,导致转基因植物发育后期细胞分裂素含量显著提高,从而延缓植物叶片的衰老过程.1999年,又有人发表论文证实用上述启动子指导同源域转录调控因子基因Knotted1表达,也能明显延缓烟草叶片的衰老.与此同时,有学者撰文称在番茄中过量表达拟南芥己糖酸化酶基因,导致转基因植物衰老进程加快.此后,不少作者相续报道了不同基因或不同成份对植物生长发育的调控作用.

代表性差异筛选法的建立和改进

代表性差异筛选法的建立和改进欧晋平朱平马明信薛海鹏虞积仁血液系统肿瘤包含许多基因改变，如已知的ｍｙｃ，ｒａｓ，ｍｌ等癌基因变化，还有绝大部分的基因异常尚待人们去发现。新近发展起来的代表性差异筛选法（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｅｒｅｎｃｅａ...

差异筛选肝癌凋亡细胞cDNA文库的简便方法

目的差异筛选人肝癌凋亡细胞ｃＤＮＡ文库。方法消减杂交和点杂交相结合的噬菌斑原位杂交法筛选ｃＤＮＡ文库，首先采用（－）ｃＤＮＡ探针杂交，挑取（－）的噬菌斑克隆，再用（－）和（＋）两种ｃＤＮＡ探针与初筛出的噬菌斑克隆杂交的差异筛选方法。结果得到４个充分孤立的噬菌斑克隆，其插入片段长度为１．５ｋｂ左右。结论该方法简便、快速，是差异筛选ｃＤＮＡ文库的一种较为可行的简便方法。

差异表达基因筛选技术及其在缺血性心脏病中的应用

在后基因组时代,人类基因组计划的工作重点转移到对功能基因的研究,疾病基因组的研究将成为现代医学研究的热点。随着差异基因筛选技术的不断完善,对疾病的发生机制的研究也不断深入。本文以缺血性心脏病为例,概述差异基因筛选技术的发展及其在该病病理机制研究中的应用状况。

饲养方式对滩羊肌内脂肪沉积影响及相关基因表达差异研究

本试验基于转录组学技术探讨舍饲与放牧条件下,滩羊脂肪沉积的差异及相关表达基因的筛选及分析。试验采用随机区组的试验设计方法,将体况相近的12只4月龄滩羊羯羊随机分为2组,每组6只,分别采用放牧和舍饲的饲养模式。于6月龄屠宰取背最长肌与股二头肌。试验结果表明:舍饲滩羊背最长肌肌内脂肪(IMF)含量显著高于放牧组(P <0.05),放牧组滩羊背最长肌IMF含量为(1.4567±0.0987)%,舍饲组滩羊背最长肌IMF含量为(2.0700±0.1493)%。股二头肌IMF含量舍饲组较放牧组高,但差异不显著。与舍饲组滩羊相比,放牧组滩羊背最长肌与股二头肌饱和脂肪酸含量均低,其中背最长肌己酸(C6:0)、癸酸(C10:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、十五烷酸(C15:0)、棕榈油酸(C16:1)、十七烷酸(C17:0)、十七碳烯酸(C17:1)、硬脂酸(C18:0)含量显著低于舍饲组(P <0.05),股二头肌十五烷酸(C15:0)、棕榈油酸(C16:1)、十七烷酸(C17:0)显著低于舍饲组(P <0.05),碳原子数≥18的长链脂肪酸和不饱和脂肪酸含量以放牧组滩羊较高,其中背最长肌二十一烷酸(C21:0)和股二头肌十七碳烯酸(C17:1)含量显著低于舍饲组(P <0.05)。基于转录组学分析得知,与舍饲组相比,放牧组滩羊背最长肌脂肪代谢基因表达量显著下调的有酰基辅酶A硫酯酶7(ACOT7)、脂肪细胞分化转录因子(ADIG)与酰基辅酶A氧化酶2(ACOX2)(P <0.05),显著上调的有溶质载体家族7成员8(SLC7A8)、游离脂肪酸受体4(FFAR4)与胰岛素样生长因子2(IGF2)(P <0.05)。放牧组滩羊股二头肌脂肪代谢基因表达显著下调的有ACOT7、ADIG、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)与脂肪酶A(LIPA)(P<0.05),显著上调的有花生四烯酸15-脂加氧酶(ALOX15)与二酰基甘油O-酰基转移酶2(DGAT2)(P <0.05)。

几种基因差异表达分析技术在原核生物差异基因筛选中的应用

原核生物差异基因筛选方面,目前代表性差异分析方法(RDA)、消减抑制杂交法(SSH)、限制性酶切片段差异显示(RFDD-PCR)以及cDNA-AFLP等技术经改良后,可用于原核生物差异基因筛选的研究。论文对这几种方法的优缺点及应用进行了介绍。

布鲁氏菌野毒株A544与疫苗株104M的差异蛋白筛选

为给布鲁氏菌病自然感染与疫苗免疫鉴别方法的建立提供参考,采用比较蛋白质组学研究技术,以野毒株A544和疫苗株104M的菌体蛋白为研究对象,以双向电泳技术为分离手段,以基质辅助激光解吸飞行时间质谱为检测手段,利用生物学信息解析所得实验结果。双向电泳结果分析显示,野毒株A544和疫苗株104M之间约有20个差异蛋白点,经质谱成功鉴定了9种蛋白。通过蛋白数据库检索发现,这些蛋白主要参与了一些代谢调节等生物过程,其中有6个蛋白点在野毒株A544上高表达,3个蛋白点在疫苗株104M上高表达。

缺铁玉米根cDNA文库的构建及蛋白和cDNA差异比较

采用异硫氰酸胍酚氯仿法分离铁胁迫玉米根总ＲＮＡ，然后采用寡聚ｄＴ 纤维素层析柱法纯化Ｐｏｌｙ（Ａ） ＋ ＲＮＡ．用含有ＸｈｏＩ位点的ｌｉｎｋｅｒｐｒｉｍｅｒ 锚定合成ｃＤＮＡ 第一条链后，采用替代法合成第二条链，接着连接上ＥｃｏＲＩＡｄａｐｔｅｒ 以便定向重组到载体上．ｃＤＮＡ 经过ＸｈｏＩ消化和分级分离后，带有ＸｈｏＩ和ＥｃｏＲＩ粘性末端的ｃＤＮＡ 定向重组到λＺＡＰ表达载体的ＸｈｏＩ和ＥｃｏＲＩ位点上．经体外包装，重组的噬菌体转导宿主菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ ＭＲＦ，最终获得滴度为４－５ ×１０５ ｐｆｕ／ｕｇ 的λＺＡＰ 表达ｃＤＮＡ 文库．通过差异筛选法和质膜双向电泳验证了缺铁和加铁条件下ｃＤＮＡ

浸润性突眼相关基因/cDNA片段的筛选

筛选浸润性突眼相关基因／cDNA片段，为探究浸润性突眼发生的分子机制莫定基础。采用抑制消减杂交技术，以甲亢伴突眼患者甲状腺组织的cDNA为tester，甲亢不伴突眼患者甲状腺组织的cDNA为driver，经过两轮消减杂交和两轮PCR，获得二者之间的消减PCR产物，将产物插入至pCR2．1载体，转化感受态细胞E．coli DH5α，进行蓝白筛选。随机挑取48个白色菌落，经过Colony PCR，其中有1个转化子的扩增产物为双带，其余均为0．2～2kb之间的单一条带。将Colony PCR产物点样于同一尼龙膜上，一式两份，分别与地高辛标记的甲亢伴突眼和甲亢不伴突眼患者甲状腺组织的cDNA探针杂交。以与甲亢伴突眼患者甲状腺组织的cDNA探针有杂交信号，而与甲亢不伴突眼患者甲状腺组织的cDNA探针无杂交信号或信号明显弱的转化子为阳性克隆。筛选的阳性率为50％左右，阳性克隆中的插入片段即是与浸润性突眼相关的基因／cDNA片段。

mRNA差异显示法及其在水稻分子生物学中的应用

对mRNA差异显示法中人们比较熟悉的示差筛选、扣除杂交和DDRT PCR法 ,以及近几年新提出的RDA、SSH 5种主要的差异基因筛选法 ,从其原理、在分子生物学中的应用。

抑制性消减杂交分离苹果缺铁诱导的相关基因

以铁高效基因型植物——苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)为材料,利用抑制性消减杂交(SSH)方法,成功构建了小金海棠缺铁条件下的消减cDNA文库。该文库包含1 152个克隆,通过PCR检测插入片段大小在300 ～1 000 bp之间。对构建的消减cDNA文库进行差异筛选,得到差异表达片段(ESTs) 105个。GenBank上BLAST结果如下: 50个ESTs与其它物种同源性较高,视为已知基因,并根据其功能分为9个组; 32个ESTs在GenBank中无法查到对应的同源序列,可能代表了新基因;另外23个是与已知ESTs重复的基因片段。

不同品种水稻苗期硝态氮吸收与利用效率差异的筛选及研究

在人工气候箱培养条件下,对来自不同地域的60个水稻品种在高氮和低氮水平条件下培养,通过对其生物量以及氮含量进行测定将其分成4种类型,即高氮高生物量型、高氮低生物量型、低氮高生物量型、低氮低生物量型。经大规模的初步筛选,我们筛选出8种在生物量、氮素含量等方面差异比较明显的水稻品种。对8份水稻材料进一步分析发现,不同籼稻与粳稻水稻品种在氮的吸收与利用方面存在显著差异,尤其在氮的吸收效率方面籼稻品种明显高于粳稻品种,如‘南恢511’明显高于‘14CQ05’。通过设置不同的氮素水平,结合不同品种的生物量变化以及氮吸收利用的差异鉴定出了苗期氮利用高效的品种,如‘南恢511’在高氮下生物量、氮吸收和利用等方面都最高,但是在低浓度下不明显,可认为是高氮高效型品种;而‘14CQ011’在两种氮浓度下,从生物量、氮含量以及吸收利用方面都表现最差,可初步认为是氮低效品种。另外,通过相关指标关联分析发现无论在高氮和低氮条件下植株干重与氮素吸收效率都呈极显著正相关性,而地上部氮含量和地下部氮含量与氮素利用效率呈极显著负相关性,这为今后的氮高效育种提供一定的理论支撑。

应用抑制性消减杂交分离板栗短雄花序芽变相关基因

利用抑制性消减杂交技术分离了板栗正常花序与芽变花序之间表达的差异cDNA片段。以芽变板栗雄花序cDNA为试验方(tester),以对照板栗雄花序cDNA为驱动方(driver),构建了一个板栗芽变花序消减文库。菌落PCR显示插入片段主要在100～1000 bp,文库质量良好。通过对文库阳性克隆随机测序共得到了30个有效EST序列。利用Blast同源性比较,其中一些EST可能与板栗雄花序发育中变短的生物学形态形成密切相关,为后续板栗短雄花序芽变相关基因的研究奠定了基础。

冬小麦春化作用相关cDNA克隆Vrc79的分子克隆

在低温需求型植物的发育过程中，春化作用是诱导植物成花的必要因子。在冬小麦春化进程中存在着一个核酸代谢的关键期，为了探讨春化作用的分子机理，以不春化及脱春化的冬小麦京冬1号（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍＬ．ｃｖ．Ｊｉｎｄｏｎｇ Ｎｏ．１）胚芽的ｍＲＮＡ为对照，通过减法杂交构建了富集冬小麦春化相关基因的ｃＤＮＡ文库，经过差异筛选分离到了一个仅在春化２１ｄ这一关键期表达，而在不春化、春化４ｄ、脱春化不表达的春化相关。ｃＤＮＡ克隆Ｖｒｃ７９。Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交及同源性分析表明它是一个在植物中新发现的不同于低温胁迫诱导基因的春化特异克隆，其对春化需求型植物的成花诱导可能起重要的调控作用。

参附注射液对慢性充血性心力衰竭大鼠心肌miRNA表达谱的影响

目的:研究参附注射液(SFI)对慢性充血性心力衰竭(简称心衰)大鼠心肌微小RNA(miRNA)表达谱的影响,以明确SFI抗心衰的作用靶点。方法:将40只大鼠按随机数字表法分成假手术组(生理盐水,ip)、模型组(生理盐水,ip)、缬沙坦组(阳性对照,10 mg/kg,ig)和SFI组(0.75 m L/kg,im),每组10只,除假手术外的其余各组大鼠均复制心衰模型。造模成功后,各组小鼠每天给予相应药物1次,连续给药28 d后采用Affymetrix miRNA V4.0芯片技术对心衰大鼠心肌组织中miRNA表达进行分析,并筛选各组大鼠心肌组织中共同差异表达miRNA,以差异基因表达倍数大于或等于1.1为阈值分析心衰相关miRNA;利用基因本体论(GO)分析对差异表达基因进行功能分类及生物信号通路分析。结果:共筛选出29条共同差异表达miRNA,7条心衰相关miRNA(rno-miR-30c-1-3p、rno-miR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-199a-5p、rno-miR-221-3p、rno-miR-146a-5p和rno-miR-1-3p),SFI能显著下调心衰大鼠心肌组织中rno-miR-125b-5p、rno-miR-133a-5p、rno-miR-221-3p、rno-miR-1-3p表达(P<0.05或P<0.01)。GO分析结果显示,差异表达miRNA主要与信号通路转导、细胞质及核苷酸结合有关。结论:SFI参与下调心衰进展相关miRNA,进而经细胞质与核苷酸结合后影响相关信号通路的转导,从而发挥其抗心衰作用。