脓毒症并发急性肾损伤患者外周血单个核细胞中微小RNA-16-5p、干扰素诱导跨膜蛋白3表达及临床意义

目的检测脓毒症及脓毒症并发急性肾损伤(sepsis-associated acute kidney injury,S-AKI)患者外周血单个核细胞中微小RNA-16-5p(microRNA-16-5p,miR-16-5p)、干扰素诱导跨膜蛋白3(interferon-induced transmembrane protein,IFITM3)表达情况,分析两者对S-AKI患者的临床意义。方法本研究以2019年2月至2021年2月武汉市蔡甸区人民医院确诊的脓毒症患者为研究对象,共纳入106例,将合并急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的脓毒症患者作为AKI组(52例),未合并AKI的患者为非AKI组(54例)。收集所有患者的血液样本3 mL并分离单核细胞,利用实时荧光定量技术检测外周血单个核细胞中miR-16-5p、IFITM3 mRNA的表达水平,酶联免疫吸附法测定外周血中白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)水平,全自动生化分析仪检测外周血中胱抑素(cysteine,Cys)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平;比较两组间的临床指标及miR-16-5p、IFITM3 mRNA表达水平,Pearson法分析miR-16-5p、IFITM3 mRNA分别与BUN、Cys水平的相关性,以及miR-16-5p与IFITM3 mRNA表达水平的相关性,采用多元线性回归分析S-AKI患者miR-16-5p、IFITM3 mRNA表达水平的影响因素,受试者工作特性曲线(receiver operator characteristic curves,ROC)评估miR-16-5p和IFITM3 mRNA对脓毒症患者发生S-AKI的诊断价值。结果AKI组患者急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluationⅡ,APACHEⅡ)评分(15.67±4.39比13.31±3.56)、序贯器官衰竭评分(sequential organ failure assessment,SOFA)评分(5.62±1.28比4.89±1.41)、IL-1β[(22.03±5.78)mg/L比(10.44±3.05)mg/L]、Cys[(2.72±0.45)mg/L比(1.98±0.31)mg/L]和BUN[(7.93±2.24)μmol/L比(4.49±2.07)μmol/L]水平均高于非AKI组患者(P<0.05),AKI组患者的miR-16-5p(1.64±0.30比1.17±0.28)表达水平显著上调,IFITM3 mRNA(2.87±0.62比4.06±0.92)及蛋白(1.63±0.41比3.15±0.85)(r=0.560,P<0.05)水平呈正相关,IFITM3 mRNA表达水平与IL-1β(r=-0.754,P<0.05)、Cys(r=-0.554,P<0.05)、BUN(r=-0.695,P<0.05)水平呈负相关,miR-16-5p与IFITM3 mRNA的表达水平呈负相关(r=-0.496,P<0.05);多元线性回归分析结果显示,IL-1β升高、Cys升高是miR-16-5p、IFITM3 mRNA表达水平的影响因素(P<0.05);miR-16-5p、IFITM3 mRNA单一检测诊断脓毒症患者发生S-AKI的曲线下面积(area under the curve,AUC)分别为0.876(95%CI:0.809~0.944)、0.874(95%CI:0.811~0.938),miR-16-5p和IFITM3 mRNA联合检测的AUC为0.956(95%CI:0.929~0.992)。结论S-AKI患者中miR-16-5p表达上调,IFITM3表达下调,与S-AKI的病理过程密切相关,可能通过促进炎症反应加重肾损伤,有助于早期诊断S-AKI,为临床治疗S-AKI提供了有希望的靶点。

包虫囊液干预的肝细胞Foxp3与IFITM3表达变化及其与干扰素刺激蛋白相关性分析

目的观察包虫囊液干预的肝细胞核转录因子Foxp3、干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)表达变化并分析其与干扰素刺激蛋白IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15的相关性。方法从包虫病羊肝脏包囊中抽取囊液,将人肝癌细胞HepG2分为高浓度组、中浓度组、低浓度组及对照组,分别加入1∶10、1∶100和1∶1000浓度比例的囊液及不加囊液,采用Western blotting法及荧光定量PCR法检测各组干预后及低浓度组在干预后0、12、24、36、48、60、72 h细胞中的Foxp3、IFITM3及相关干扰素刺激蛋白IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15蛋白及mRNA表达,采用Spearman分析Foxp3、IFITM3与IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15的相关性。结果不同囊液浓度干预下,IFITM1、IFITM2、IFITM3、Foxp3、ISG15蛋白及mRNA表达随着干预囊液浓度降低逐渐升高,IFIT3蛋白表达中浓度组>低浓度组、高浓度组(P均<0.05),IFIT3 mRNA高、中、低浓度组差异无统计学意义。低囊液浓度干预下各时点IFITM1、IFITM2、IFIT3蛋白表达随囊液干预时间延长而降低,IFITM3、ISG15蛋白表达随囊液干预时间延长先升高后降低,Foxp3蛋白表达随囊液干预时间延长而升高;IFITM2、IFIT3、ISG15 mRNA表达随囊液干预时间延长而降低,IFITM3、IFITM1 mRNA表达随囊液干预时间延长先升高后降低,Foxp3 mRNA表达随囊液干预时间延长而升高。Spearman相关分析结果显示,不同囊液浓度干预下Foxp3表达与IFITM3表达呈正相关(P=0.004);Foxp3 mRNA、IFITM3蛋白及mRNA表达与IFITM1、IFITM2、ISG15 mRNA表达均呈正相关(P均<0.05),与IFIT3 mRNA表达无相关性;Foxp3蛋白表达与IFITM1、ISG15蛋白表达呈正相关(P均<0.05),与IFITM2和IFIT3蛋白表达无相关性。低囊液浓度干预下各时点Foxp3表达与IFITM3表达呈负相关(P均<0.05);Foxp3表达与IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15表达呈负相关;IFITM3表达与IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15表达呈正相关(P均<0.05)。结论在低浓度包虫囊液干预下,HepG2细胞IFITM1、IFITM2、IFITM3、Foxp3及ISG15表达升高,且Foxp3表达与IFITM3表达呈正相关;随着囊液干预时间的延长,HepG2细胞IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFIT3、ISG15表达降低、Foxp3的表达升高,且Foxp3表达与IFITM3表达呈负相关。

基于Tet-On 3G的IFITM3诱导表达MDCK细胞系的建立及功能分析

利用Tet-On 3G系统构建了含人IFITM3基因的真核表达质粒pTRE3G-IFITM3,并将其与调控质粒pLVX-Tet3G共转染犬肾细胞(MDCK),转染后48 h用G418和嘌呤霉素进行筛选,用多西环素(Dox)对获得的细胞系进行诱导表达鉴定,并进行Dox敏感性分析、IFITM3^+细胞百分数及定位分析.用含萤光素酶(Luciferase)报告基因的禽流感病毒H5/H7蛋白或VSV G蛋白包裹的假型慢病毒颗粒进行感染实验,检测萤光素酶活性.结果表明,筛选获得了携带人IFITM3的MDCK诱导表达细胞系,且IFITM3表达量与Dox剂量和诱导时间相关;确定Dox工作浓度为2.5μg/mL,诱导12 h时IFITM3^+细胞数达75%以上,且IFITM3在晚期内体/溶酶体存在分布;假型病毒感染及萤光素酶活性分析表明,IFITM3可显著抑制禽流感病毒H5,H7和VSV G蛋白介导的病毒进入,为深入探究其具体的抑制机制奠定了基础.

Ifitm3敲除抑制小鼠神经干细胞增殖和分化

目的建立干扰素诱导跨膜蛋白3基因(Ifitm3)敲除小鼠模型,探究Ifitm3对小鼠神经干细胞增殖和分化的影响。方法利用CRISPR/Cas9技术,建立Ifitm3敲除小鼠模型,通过基因型鉴定和Western Blot检测IFITM3的敲除效果;利用苏木素-伊红(HE)染色和流式细胞术等方法分析Ifitm3敲除小鼠和野生型小鼠的表型差异。分离并培养野生型和Ifitm3敲除小鼠成体神经干细胞,统计神经球数量和大小,qRT-PCR、Western Blot、免疫荧光技术检测神经干细胞增殖和分化的能力。结果成功建立Ifitm3敲除小鼠模型,Ifitm3敲除小鼠发育正常,组织病理学及免疫系统未见明显异常。体外实验显示Ifitm3敲除抑制小鼠神经干细胞的自我更新潜能,导致神经干细胞增殖能力下降,并且抑制神经干细胞向未成熟神经元和星形胶质细胞分化。结论IFITM3缺失导致神经干细胞增殖和分化能力下降,IFITM3可能参与了神经干细胞的功能调节。

番鸭IFITM3基因真核表达载体的构建和表达

为了研究番鸭干扰素诱导跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)在抗病毒感染过程中的作用,试验采用PCR扩增、酶切、连接、转化和质粒提取等方法,将番鸭IFITM3基因构建到真核表达载体p Flag-CMV-5a上。测序正确的质粒转染293T细胞,运用RT-PCR和Western-blot方法鉴定IFITM3的表达情况。结果表明:构建的p Flag-CMV-Anas-IFITM3真核表达载体在293T细胞中可以进行mRNA的正常转录和蛋白的大量表达。说明番鸭IFITM3基因成功构建到p Flag-CMV-5a真核表达载体上,可以在293T模式细胞中大量表达番鸭IFITM3蛋白,并对该蛋白的抗病毒功能和分子机制进行研究。

芦花鸡IFITM3基因克隆及生物信息学分析

本研究旨在对芦花鸡的干扰素诱导的跨膜蛋白-3(interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)基因进行克隆及生物信息学分析。根据GenBank中鸡IFITM3基因序列(登录号:NM_001350061.1)设计特异性引物,利用RT-PCR技术对芦花鸡IFITM3基因进行克隆、测序和生物信息学分析。结果表明,芦花鸡IFITM3基因片段大小为414bp,与GenBank中发表的鸡IFITM3基因序列(登录号:NM_001350061.1)同源性为99.9%;编码137个氨基酸。IFITM3基因理论分子质量为14.95ku,理论等电点(pI)为6.89,不稳定系数为33.98,脂肪系数为103.14,平均疏水指数为0.300,存在3个明显的疏水区,无信号肽,存在2个跨膜区,分别位于第46-68、101-123位氨基酸处;二级结构预测显示,IFITN3蛋白主要以无规则卷曲为主,存在多个α-螺旋和β-折叠区域。本研究成功克隆了芦花鸡IFITM3基因,为进一步研究IFITM3蛋白功能及阐明其抗病毒分子机制奠定了理论基础。

干扰素诱导跨膜蛋白3 rs12252单核苷酸多态性与乙型流感临床严重程度的相关性研究

为了研究干扰素诱导的跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM 3)rs12252单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)与乙型流感临床严重程度的相关性,在吉林省和湖南省收集了181名乙型流感轻症病例和83名乙型流感重症病例全血标本,提取两组病例基因组DNA并扩增相应的目的片段后,采用Sanger测序的方法对ITIM3rs12252SNP进行基因分型。同时选用千人基因组103名中国北京地区汉族人(CHB)为一般人群对照。统计分析结果表明,轻症病例IFITM 3rs12252基因型频率分布与一般人群对照无显著性差异,但重症病例rs12252CC基因型频率显著高于一般人群对照组。乙型流感重症病例IFITM3rs12252C等位基因频率显著高于轻症病例(P<0.05),携带rs12252-C等位基因发展为乙型流感重症的风险是rs12252-T等位基因的1.818倍(Odds Ratio=1.818,95%CI:1.241~2.664)。并且重症病例中rs12252CC基因型频率显著高于轻症病例(P<0.05),表明rs12252CC基因型与乙型流感重症相关。

干扰素诱导跨膜蛋白3基因多态性对儿童副流感病毒性肺炎病情程度及胸部影像学的影响

目的探讨干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)基因多态性对儿童副流感病毒性肺炎病情程度及胸部影像表现的影响。方法选择海南医学院第一附属医院2019年5月-2021年5月因副流感病毒性肺炎入院治疗患儿76例为研究对象。按照1∶1随机选择同期医院进行体检健康儿童76名为对照组。所有入组儿童在入院当天采集外周静脉血并提取外周血DNA。针对IFITM3基因rs12252位点设计特异性引物采用聚合酶链式扩增反应(PCR)扩增目的片段,将产物经胶回收纯化后送公司进行测序,确定分型结果。使用小儿危重症病例评分(PCIS)评估患儿入院后24 h内病情严重程度,通过胸部X线平片以及CT平扫结果评估副流感病毒性肺炎患儿影像学改变。结果两组实际频数和理论频数分布比较差异无统计学意义,符合哈迪-温伯格平衡,表明样本具有群体代表性;研究组IFITM3基因rs12252位点CC基因型、C等位基因频率高于对照组,TT基因型、T等位基因频率低于对照组(P<0.05);研究组IFITM3基因rs12252位点携带CC型患儿CPIS评分低于TC+CC组、呼吸机使用时间高于TC+CC组(P<0.05);研究组IFITM3基因rs12252位点携带CC型患儿节段性实变发生率高于TC+CC组(P<0.05),但两组间质性改变和小叶性实质浸润发生率差异无统计学意义。结论IFITM3基因rs12252位点CC基因型显著增加儿童副流感病毒性肺炎病情程度,且与肺节段性实变有关。

干扰素诱导跨膜蛋白3基因敲除Caco2细胞株的构建及其对水泡性口炎病毒复制的影响

通过CRISPR/Cas9系统,旨在构建干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)基因敲除的人结直肠腺癌细胞Caco2,并探究IFITM3基因敲除对水泡性口炎病毒(VSV)复制的影响。针对人IFITM3基因靶向设计sgRNA,合成后连接至pLentiv2载体中获得重组质粒,经测序后将正确连接sgRNA的重组质粒及辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装并感染Caco2细胞,然后进行嘌呤霉素加压筛选,利用有限稀释法获取IFITM3基因敲除单克隆细胞。利用DNA测序和Western blot对所获得单细胞克隆进行鉴定,鉴定正确的细胞命名为Caco2-△IFITM3。用表达绿色荧光蛋白的VSV(VSV-EGFP)感染Caco2-△IFITM3细胞,通过荧光显微镜观察IFITM3敲除对VSV复制的影响。基因组DNA测序结果表明,在IFITM3基因开放阅读框产生了碱基缺失,细胞中IFITM3蛋白表达消失,但细胞活性未受明显影响。病毒感染试验可观察到Caco2-△IFITM3细胞感染比例显著高于Caco2细胞,表明敲除IFITM3使其抗病毒功能减弱。本研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了基于肠道细胞敲除IFITM3基因的Caco2单细胞克隆,验证了IFITM3敲除对细胞抗VSV感染的影响,为进一步深入研究IFITM3与肠道病毒的互作及其功能奠定基础。

干扰素诱导跨膜蛋白3在H7N9中的研究进展

截至2014年5月16日，高致病性禽流感病毒H7N9已引起国内122人死亡。干扰素诱导跨膜蛋白3是干扰素诱导的跨膜蛋白家族的一分子，具有广泛的抗病毒作用，在甲型流感病毒感染中可以早期抑制病毒的复制从而发挥作用。本文对干扰素诱导跨膜蛋白3在禽流感病毒H7N9中的研究进展进行了简要阐述。

IFITM1克隆测序及生物信息学分析

目的研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因（interferon induced transmembrane protein 1．IFITM1）克隆、测序，对序列进行分析，并获取生物学信息。方法以IFITM1的cDNA为模板，用Pfu酶做PCR扩增，在EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后，将IF—ITM1的cDNA片段克隆到pUCm—T质粒，对重组的pUCm—T-IFITM1测序后，采用All GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDBSe—quences Database和Simple Modular Architecture Research Tool（SMART）对IFITM1的eDNA进行生物信息学分析。结果扩增后，含有IFITM1基因eDNA的PCR产物约1000bp，IFITM1的eDNA成功克隆到pUCm—T质粒并进行测序。序列分析结果显示，IFITM1结构cDNA全长683bp，有2个外显子。IFITM1的mRNA编码的氨基酸在37～57和87～107有2个跨膜区，编码125个氨基酸的多肽，其蛋白相对分子质量为14kDa。结论，IFITM1基因的成功扩增、克隆、测序，获取了IFITM1基因的eDNA、mRNA以及编码蛋白质氨基酸的生物学信息，有利于研究IFITM1基因与大肠癌的关系。

病毒感染时IFITM3与TRIM22和Foxp3表达及关联基因的富集分析

目的病毒感染时对IFITM3、TRIM22和FOXP3及基因进行富集分析。方法利用STRING作出IFITM3、TRIM22和FOXP3及其关联的50个基因互作网络图;利用DAVID数据库和KOBAS数据库对其进行GO分析和KEGG分析。应用荧光定量PCR对3基因的mRNA相对表达量进行相关性分析。结果通过STRING数据库分析得到3基因互作网络图,关联性大小与图中代表基因节点的圆圈大小呈正比(P<0.05)。经基因功能富集分析表明基因相关的信号通路与基因有关联的可信度较高(P<0.05)。在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和甲型流感病毒感染患者的外周血白细胞(P<0.05)分别为(4.462±3.441)、(4.406±4.415)和(4.013±0.081)中的IFITM3的mRNA与健康对照组差异有统计学意义(t=2.987,P<0.01)。结论机体感染病毒后,IFITM3与TRIM22之间、FOXP3与TRIM22之间可能存在着一定的相互作用,并参与机体对病毒感染的应答进程。

甲型流感病毒感染野生型和Ifitm3^-/^-小鼠的纵膈淋巴结的转录组学研究

干扰素诱导的跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)敲除小鼠(Ifitm3^-/^-小鼠)感染流感病毒后,表现出更为严重的病理损伤和死亡率。最近的研究发现,IFITM3蛋白表达也会影响机体针对流感病毒的适应性免疫反应效果。由于空间效应,纵膈淋巴结在机体抵抗流感病毒急性期感染的适应性免疫应答过程中发挥重要功能,本研究欲探究使用流感病毒鼠肺适应株A/PR/8/H1N1进行感染后,野生型和Ifitm3^-/^-小鼠的纵膈淋巴结中与免疫相关的差异表达基因。本研究对流感病毒PR8感染后第3d的纵膈淋巴结进行RNA-Seq测序。高通量测序共检测到有1312个差异表达基因,其中上调和下调差异表达基因分别为904和408个。这些差异表达基因主要参与炎症反应与细胞凋亡信号通路、T细胞和B细胞受体信号通路、T细胞和B细胞激活与细胞因子分泌等信号通路。采用荧光定量PCR对部分免疫相关的差异表达基因进行验证,结果与RNA-Seq测序结果一致。本研究为进一步阐明IFITM3在适应性免疫应答中拮抗流感病毒的分子机制奠定了基础。

IFIT 1和IFITM 3在子宫内膜异位症病灶中的表达研究

目的检测子宫内膜异位症(以下简称内异症)患者异位、在位内膜组织中干扰素诱导蛋白-1(interferon-induced protein with tetratricopetide repeats 1,IFIT 1)、干扰素诱导跨膜蛋白-3(interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM 3)表达,并探究其对子宫内膜间质细胞的增殖作用。方法选取2018年3月至2019年10月于武汉市第一医院就诊并行腹腔镜或开腹手术治疗、术后经病理证实为内异症的患者86例为研究对象,选取其在位内膜及异位内膜组织分别为在位内膜组与异位内膜组;选取同期因子宫肌瘤或宫颈病变行子宫切除术、病理证实为正常子宫内膜的患者74例为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测组织中IFIT 1 mRNA、IFITM 3 mRNA表达水平,免疫组织化学法检测各组织中IFIT 1、IFITM 3蛋白表达,采用CCK-8法检测IFIT 1、IFITM 3在子宫内膜异位间质细胞分裂增殖中的作用;分析内异症患者在位内膜组织、异位内膜组织中IFIT 1 mRNA、IFITM 3 mRNA表达水平相关性。结果内异症异位内膜组中IFIT 1 mRNA、IFITM 3 mRNA表达水平及其蛋白阳性表达率高于内异症在位内膜组和对照组,内异症在位内膜组中IFIT 1 mRNA、IFITM 3 mRNA表达水平及其蛋白阳性表达率高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);内异症患者在位内膜组织、异位内膜组织中IFIT 1 mRNA、IFITM 3 mRNA表达水平均呈正相关(r=0.534、0.574,P<0.05);IFIT 1、IFITM 3可促进子宫内膜间质细胞的增殖和分裂,该作用随着IFIT 1、IFITM 3剂量的增加而增强;当IFIT 1、IFITM 3剂量增加到10μg/L时,其促进子宫内膜间质细胞的增殖和分裂作用是对照组的1.86和1.88倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论IFIT 1、IFITM 3在内异症异位内膜组织、在位内膜组织中表达明显高于正常子宫内膜组织,且对子宫内膜间质细胞的增殖和分裂有促进作用。

IFITM3调控流感病毒感染小鼠肺组织NLRP3炎症小体活化的研究

目的探讨干扰素诱导的跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)在流感病毒感染过程中对肺组织NLRP3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症小体活化的调控作用,为流感的防治提供新的思路。方法构建IFITM3敲除小鼠(Ifitm3^(-/-)小鼠),用A/AiCHi/1968/2(H3N2)病毒分别感染Ifitm3^(-/-)小鼠与野生型小鼠,连续14 d记录体重变化并计算存活率。在感染后第0、1、3和5 d采集小鼠肺组织,通过病理组织切片考察小鼠肺组织的病理损伤,采用Western blot、RT-qPCR、Elisa法检测小鼠肺组织的NLRP3炎症小体激活状况。采用SPSS 20.0软件进行独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果经A/AiCHi/1968/2(H3N2)病毒感染后,Ifitm3^(-/-)小鼠相比野生型小鼠表现出高的死亡率和更严重的肺组织炎症反应。较野生型小鼠而言,Ifitm3^(-/-)小鼠肺组织中NLRP3炎症小体效应蛋白NLRP3和caspase-1的基因和蛋白表达水平显著上升(P<0.05),同时NLRP3炎症小体下游因子IL-1β的mRNA拷贝数及分泌含量亦明显升高(P<0.05)。结论敲除IFITM3基因促使流感病毒感染小鼠肺组织NLRP3炎症小体的活化程度升高,首次发现在流感病毒感染时IFITM3参与了NLRP3炎症小体活化的调控过程,为IFITM3拮抗流感病毒的分子机制提供了新的线索。