干血斑中34种苯二氮卓类物质的实时直接分析-串联质谱快速筛查研究

该文通过优化仪器条件和前处理方法建立了实时直接分析-串联质谱快速筛查干血斑(DBS)中34种苯二氮卓类物质(BZDs)的方法。首先将50μL血液沉积在采血卡上形成DBS,DBS经溶剂充分提取后取上层溶液,使用DART 12Dip-It^(TM)模块进样5μL,在多反应监测模式下检测。结果表明:选用400℃作为载气加热器温度,以乙酸乙酯-水(体积比3∶1)混合溶剂提取DBS样品,所得响应强度较高且建立的筛查方法选择性良好,无延迟效应影响,除阿地唑仑、奥沙西泮和α-羟基三唑仑外,其他物质的检出限均在5~50 ng/mL。所建方法可在90.3%的阳性检材中成功筛选出BZDs物质,方法快速、简便、有效,适用于服药自杀等类案件中DBS检材的快速筛查检验。

适用于法庭科学毒物分析的干血斑检验体系的建立——以5种常见药(毒)物为例

干血斑技术能够方便地对血液样品中的违禁药物进行快速分析,在酒后驾驶检查、滥用药物检测、兴奋剂检测等毒物分析场景具有显著优势。然而在我国法庭科学毒物分析领域,因缺少标准化检验体系,其稳定性和可靠性未得到深入研究论证,限制了其在司法实践中的运用。本研究以甲基苯丙胺、利多卡因、氯胺酮、芬太尼和地西泮为典型药(毒)物,使用整个干血斑进行分析,建立了适用于法庭科学领域毒物分析的超高效液相色谱-串联质谱分析方法,形成了以干血斑样品制作、前处理、分析、储存和效用性评价为主要内容的检验体系,并为干血斑中其他药(毒)物的分析方法开发提供参考。结果表明,干血斑中利多卡因和芬太尼在0.5~100 ng/mL内线性关系良好,甲基苯丙胺、氯胺酮、地西泮在2~100 ng/mL内线性关系良好,方法检出限为0.2~0.5 ng/mL。干血斑中5种目标物可以在60天内保持稳定,目标物测定含量与理论值的偏差在15%以内。干血斑中5种目标物的测量结果与全血一致,没有显著的系统误差和比例误差,芬太尼、地西泮、氯胺酮、利多卡因和甲基苯丙胺的测量浓度的相对偏差分别为4.44%、3.50%、7.66%、5.10%和5.25%。干血斑样品前处理方法简单,样品用量小,能够实现血液样品保存的轻量化和规范化且与全血样品具有高度定量一致性,可为公安实践工作中分析、保存血液检材提供新方案。

干血斑保存温度对新生儿遗传代谢病筛查结果的影响

目的探讨血斑卡在不同储存温度条件下对筛查标志物检测结果的影响,为提高新生儿遗传代谢病筛查前样本质量提供参考依据。方法纳入宜宾市妇幼保健院新生儿100例,每例采集干血斑3份,分别放置于2~8℃冷藏、20~24℃常温及37℃孵箱三种不同温度,储存48小时后进行新生儿遗传代谢病筛查,对不同储存条件下的结果进行分析。结果TSH、Phe、17α-OHP及G-6-PD四项指标的在不同保存条件下的检测结果均存在差异(P<0.05)。以低温存储的样本作为参考,发现37℃储存样本检测结果的精密度、及与参考值的相关性相对于常温存储均有所下降。从筛查结果的角度,37℃样本检测中产生了大量的假阳性结果,尤其是在G-6-PD缺乏症的检测中,假阳性率达到了90%。结论样本保存不当可能影响检测精密度、增加检测假阳性率。干血斑样本应尽量在低温运输及存储,尤其应当避免暴露于37℃及以上的环境,避免因保存不当产生假阳性结果。

滤纸片干血斑在HIV-1 BED-CEIA新发感染检测方法中的应用

目的探讨在HIV-1 BED-CEIA新发感染检测中应用滤纸片干血斑的价值。方法研究纳入22个艾滋病自愿咨询检测(VCT)中心10226名咨询者血浆及干血斑样本作为目标实施HIV抗体检测,对通过免疫印迹法(WB)明确诊断为350例HIV感染患者的血浆样本及干血斑样本需同时实施BED-CEIA检测,观察滤纸片干血斑在HIV-1 BED-CEIA新发感染检测方法中稳定性、重复性,对两种样本检测结果存在的差异性进行对比。结果在HIV-1 BED-CEIA新发感染检测中应用滤纸片干血斑稳定性、重复性较高,重复性R^(2)值可高达0.9551。350例HIV感染患者样本检测结果中,其中295例患者样本被同时评估为长期感染,53例患者样本被同时评估为新近感染,两种样本对HIV BED-CEIA新发感染评估判定结果呈一致性(R^(2)值=0.95),一致性为99.42%。血浆样本及干血斑样本得到不同结果,样本An值均处于临界值附近(P<0.05)。结论在HIV-1 BED-CEIA新发感染检测中应用滤纸片干血斑的价值较高,检测结果稳定性、重复性较好,虽然部分样本检测结果存在一定的差异,但与血浆样本检测结果两者之间存在较佳的等效性,可广泛应用于临床HIV-1 BED-CEIA新近感染检测中。

干血斑标本珠蛋白生成障碍性贫血基因检测方法的建立

目的建立并优化干血斑标本基因组DNA提取方法和流程,以适用于临床进行珠蛋白生成障碍性贫血(又称地中海贫血,以下简称"地贫")基因诊断,并对干血斑打孔标本间可能的交叉污染和保存的稳定性进行分析。方法收集150份血液标本制备干血斑后,采用打孔仪打孔,用洗脱裂解液对血斑进行洗脱,并对洗脱方法进行优化,采用磁珠法提取血斑DNA,再进行地贫基因检测,判断干血斑和全血的地贫基因检测结果是否相符。干血斑采用2种地贫基因检测方法进行检测,以验证其是否适用于多种方法。地贫阳性标本间打空白孔,对空白孔进行地贫基因检测确定打孔是否存在交叉污染。将干血斑常温干燥保存6、9个月后进行地贫基因检测,以判断其稳定性。结果采用5个3mm直径的干血斑在55℃振荡洗脱1h,可以获得DNA浓度10~20ng/μL(50μL DNA溶解液),DNA质量好。干血斑和全血的地贫基因检测结果完全一致,干血斑的2种地贫基因检测方法的结果也完全一致。打孔仪连续对干血斑打孔,地贫基因未检测出交叉污染。干血斑标本存放6、9个月后依然能够稳定地进行地贫基因检测。结论干血斑标本可以准确、方便、稳定地进行地贫基因检测,是地贫基因检测标本转诊的理想方式。

超高效液相色谱-串联质谱检测干血斑中29种β_(2)-受体激动剂

该研究建立了干血斑中29种β;-受体激动剂的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法,分别对流动相、干血斑提取溶剂种类及比例进行了优化。采用甲醇对干血斑进行提取,Phenomenex Kinetex F5(3.0 mm×100 mm,2.6μm)色谱柱进行分离,以1 mmol/L甲酸铵-0.01%甲酸水溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱,提取液直接进行UPLC-MS/MS分析。结果表明,干血斑中29种β_(2)-受体激动剂在一定的质量浓度范围内线性关系良好,相关系数(r^(2))为0.995 8~0.999 9,方法检出限(LOD)为1~10 ng·mL-1;除非诺特罗外,其余化合物的加标回收率为60.9%~124%,相对标准偏差(RSD)均小于10%。制备的干血斑样品在-20℃冰箱保存8周后,干血斑中化合物的稳定性与全血加标样品相比无明显变化。该方法简单准确,样品用量小,且保存和运输便利,可为法庭毒物分析提供新的方法和思路。

滤纸片干血斑用于HIV-1 DNA检测的评价

目的探索滤纸固定艾滋病病毒Ⅰ型核酸(HIV-1 DNA)的稳定性、均一性,评价滤纸片干血斑HIV-1DNA检测方法的敏感性、特异性。方法套式PCR扩增HIV-1的env、gag、pol三区。不同环境条件下保存的滤纸片干血斑,分别在不同的时间段检测;滤纸片干血斑的中心及圆斑的上下左右4个边缘,随机打取5个2.5mm圆片用于检测。采自新疆现场的94份阴性样本和90份阳性样本,分别制成滤纸片干血斑样本和全血样本,比较两者的HIV-1DNA检测结果。结果滤纸片干血斑-20℃或4℃放置1年或室温放置3个月,或在37℃放置两天或冻融2次,实验的敏感性未见下降;37℃放置3天或冻融3次,已经有样本不能检出。滤纸干血斑不同位点随机打取圆片扩增,4个样本中,中点均阳性,但在上点、左点、右点分别出现一份阴性结果。滤纸干血斑法和全血法检测HIV-1前病毒DNA比较,敏感性是96.1%,特异性是98.9%。结论滤纸干血斑在室温条件下运输是可行的,推荐尽量靠近滤纸干血斑的中间位点打取圆片扩增;该方法操作简便、经济、敏感、特异。

滤纸片干血斑HIV-1 DNA检测方法的建立

目的探索用滤纸片作血液样本的载体,建立一种简单、经济、敏感的滤纸片干血斑艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)DNA检测方法。解决HIV-1感染者全血样本采集、运输和储存过程中存在的实际困难。方法首先用滤纸片FTA卡收集血液制成滤纸片干血斑,处理提取DNA后,针对HIV的env、gag、pol区,设计三对高度保守引物,套式PCR扩增HIV-1 DNA。进一步用HIV-1质粒DNA检测该方法的最低检测限。结果摸索出扩增滤纸片干血斑HIV-1 DNA的最佳扩增条件;滤纸片干血斑样本pol区最低检测限是6拷贝/μl,env区8拷贝/μl,gag区10拷贝/μl。结论可以用滤纸片FTA卡收集HIV-1感染者的血液,制成滤纸片干血斑后检测HIV-1 DNA。该方法操作简便、经济、敏感,建议作为HIV-1抗体检测的辅助诊断方法。

甘肃地区孕妇孕中期干血斑产前筛查结果分析

目的通过检测孕妇的干血斑甲胎蛋白(AFP DBS)、干血斑游离绒毛膜促性腺激素-β亚基(free-βhCG DBS)浓度,对孕中期胎儿患唐氏综合征(DS)、18-三体综合征(ES)和神经管畸形(ODNT)的风险进行评估。方法运用时间分辨荧光法定量测定孕妇干血斑中AFP DBS、Free-βhCG DBS浓度,采用Life cycle 3.2软件计算风险。结果 5 001例孕妇中高龄65例,占总筛查人数的1.3%,其中DS、ES和ONTD的阳性筛查率分别为3.7%(185/5 001)、0.4%(20/5 001)和4.3%(215/5 001)。确诊阳性病例8例,其中高龄5例。结论孕妇孕中期干血斑DS产前筛查对实现质控统一管理,提高筛查覆盖度,降低出生缺陷有重要意义。

茂名地区新生儿地中海贫血应用干血斑毛细管电泳技术筛查结果分析

目的研究并探讨干血斑毛细管电泳技术在新生儿地中海贫血筛查中的应用价值。方法选取2015年1月至2016年6月,茂名地区出生的81011例新生儿作为研究对象,于新生儿出生后3天后7天内采集其足跟血1滴制成干血斑,采用全自动毛细管电泳分析系统对干血斑中的血红蛋白进行电泳定量分析,统计血红蛋白电泳异常标本。对血红蛋白电泳异常标本进行进一步的聚合酶链反应结合DNA测序,以基因检测结果作为金标准,计算干血斑毛细管电泳检测对α-地中海贫血、β-地中海贫血、异常血红蛋白病的诊断符合率。结果 81011例新生儿的干血斑标本经毛细管电泳检测出13405例血红蛋白异常,其中疑似α-地中海贫血9588例,疑似β-地中海贫血3527例,疑似异常血红蛋白病共290例。其中有3513例筛查阳性病例召回经基因检测确诊,α-轻型地贫2493例,β-轻型地贫724例,α-中间型地贫(Hb-H)85例,β-重型地贫31例,其中正常180例,干血斑毛细管电泳检测对α-地中海贫血的诊断符合率为95.06%,对β-地中海贫血的诊断符合率为94.26%。结论在新生儿地中海贫血的筛查中,采用干血斑毛细管电泳技术进行筛查可对地中海贫血有效检出,具有显著的应用价值,在大力开展人群筛查的基础上加强产前诊断,指导合理婚配,降低重型和中型地贫儿即Hb-Bart’s水肿胎和Hb-H病β-重型的出生,提高出生人口的素质。

新生儿遗传代谢性疾病筛查干血斑制备及储存影响因素研究

目的:探讨不同制备温度、紫外线污染及不同储存温度对新生儿遗传代谢性疾病筛查干血斑中氨基酸和肉碱含量影响。方法:通过标准化制备干血斑,利用Waters-TQD串联质谱仪,采用非衍生化法对干血斑中氨基酸及肉碱含量进行测定,比较分析不同制备温度、紫外线污染及不同储存温度条件下干血斑中氨基酸及肉碱含量的变化。结果:首先,与25℃制备相比,4℃制备时干血斑中精氨酸(ARG)含量无显著性差异,但是37℃制备干血斑时,血斑中精氨酸(ARG)含量增加,且有统计学差异(P<0.05)。干血斑中精氨酸(ARG)含量与鸟氨酸(ORN)含量4℃制备与37℃制备时存在统计学差异(P<0.05)。其次,与25℃制备相比,25℃制备过程中受到紫外线污染的干血斑中精氨酸(ARG)含量高且具有统计学差异(P<0.05)。最后,在4℃、-20℃及-80℃条件下对制备的干血斑保存90d时,4℃密封储存干血斑时,氨基酸中甘氨酸(GLY)、蛋氨酸(MET)、鸟氨酸(ORN)以及肉碱中乙酰肉碱(C2)、丁酰肉碱(C4)均有显著性降低(P<0.05),但是游离肉碱(C0)表现出显著性升高(P<0.05)。结论:新生儿遗传代谢性疾病筛查干血斑制备过程中温度变化对于干血斑中精氨酸(ARG)与鸟氨酸(ORN)含量影响显著,但是制备温度及紫外线污染对血斑中肉碱含量影响未有统计学差异。同时,-20℃条件对制备的干血斑密封保存能很好保证干血斑中氨基酸及肉碱含量的稳定性,满足日常实验检测质控需求。

干血斑和血清样本用于检测乙型肝炎病毒DNA及耐药突变的比较

目的：验证干血斑（DBS）样本替代静脉血血清样本用于检测乙型肝炎病毒（HBV）基因诊断的可行性。方法选择慢性乙型肝炎患者100例，血清HBV的病毒载量〉1×10^2拷贝/mL，抽取静脉血同时制备DBS样本和血清样本，进行HBV DNA定量检测，比较DBS与血清样本检测结果的相关性。选取73例基因型主要为B、C型的患者，进行DBS和血清样本基因型检测的比较。同时随机选取56例乙型肝炎患者的DBS和血清样本，采用实验室自建的套式聚合酶链反应（PCR）扩增HBV的逆转录酶（RT）区段，通过geno2pheno数据库进行结果分析，比较二者耐药性的检测结果。结果 DBS样本HBV DNA的检测范围为2-8 log10拷贝/mL，与血清样本HBV DNA的检测结果高度相关（r^2=0.82，P〈0.05），DBS样本HBV DNA定量值比血清样本低1个数量级。2种样本HBV耐药性检测结果的总符合率为95.83%；DBS和血清样本耐药状态的检出率分别为82.14%和85.71%（P〉0.05）。2种样本HBV基因分型结果的符合率为100.00%。结论 DBS样本可用于HBV DNA的定量及耐药性的检测。

滤纸干血斑新生儿三种遗传代谢病筛查(广州地区初步报)

新生儿筛查即在新生儿期对某些引起严重危害的先天性代谢性疾病进行普查,目的在于早期检出,早期治疗,以免引起体格和智能发育障碍。该类疾病在新生儿期常缺乏特异性症状,一旦出现症状常已形成不可逆的损害,失去治疗良机,故需要在新生儿期以实验方法作出诊断。我院加一中儿童健康基金会新生儿筛查中心自1989年4月成立以来,先后对广州地区九问医院产科的新生儿进行先天性甲状腺功能减退(简称甲低),苯丙酮尿症(PKU)及红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)缺陷症的筛查。现初步报告如下。

LC-MS/MS法同时测定干血斑中伏立康唑及其主要代谢产物氮氧化伏立康唑的质量浓度

目的建立一种同时测定干血斑中伏立康唑及其主要代谢产物氮氧化伏立康唑质量浓度的LC-MS/MS法。方法将2滴血滴在Whatman 903滤纸上制备干血斑,干血斑经甲醇萃取后直接进样分析。色谱柱为Hypersil GOLD aQ,流动相为甲醇-1 mL·L^-1甲酸溶液,梯度洗脱。正离子检测,扫描方法为选择性反应监测,伏立康唑、氮氧化伏立康唑和内标酮康唑的检测离子对分别为m/z 350.1→281.0,365.8→224.1和531.3→489.2。结果干血斑中伏立康唑和氮氧化伏立康唑的质量浓度在0.01~10.00μg·mL^-1范围内线性关系良好,二者的最低定量下限为0.01μg·mL^-1。伏立康唑和氮氧化伏立康唑的日内和日间精密度均小于15%,日内和日间相对误差均在-15%~15%范围内,伏立康唑和氮氧化伏立康唑的提取回收率分别为84.65%~90.49%和85.41%~95.72%,二者无显著基质效应。红细胞压积对二者的测定无显著影响,二者在室温下保存24 h和-80℃保存1个月的条件下稳定。该方法成功应用于伏立康唑和氮氧化伏立康唑在ICU患者体内的药物动力学研究。结论建立的LC-MS/MS法具有采血无创伤、易于操作和仅需微量血液等优点。

滤纸片干血斑技术在婴儿HIV感染早期诊断中的应用

[目的]探讨滤纸片干血斑HIV-1DNA检测技术在婴儿HIV早期感染诊断中的应用。[方法]于2009至2011年在云南省红河州5所妇幼保健院,用滤纸片干血斑和罗氏HIV-1 DNA检测技术分析HIV母婴阻断项目下未满18个月的婴儿的HIV感染状况。[结果]检测249名婴儿,其中10名婴儿HIV-1 DNA阳性,与病毒载量或18月龄后的HIV抗体结果相吻合。采取母婴阻断干预措施后的婴儿感染率为3.7%,如果从孕期就开始采取干预措施的,婴儿感染率可降到0.65%,未采取任何干预措施的,婴儿感染率为16.6%。[结论]滤纸片干血斑的HIV-1 DNA检测技术的简便、快速,其定性结果与病毒载量一致,可以作为HIV母婴传播早期诊断的检测方法,可及时评估母婴阻断的效果。

电喷雾串联质谱法检测干血斑中谷氨酰胺、谷氨酸及其临床初步应用

目的建立一种采用电喷雾串联质谱法(ESI-MS/MS)检测干血斑样品中谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸(Glu)含量的方法,评价其用于筛查新生儿鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症和氨甲酰磷酸合成酶缺乏症的可行性。方法收集2020年6—9月新生儿筛查足跟血干血斑样品,用非衍生化串联质谱检测试剂盒萃取样品,完成常规串联质谱检测项目后,将残余样品作为Gln和Glu的检测对象,复溶后选择正离子扫描模式进行分析测定,统计分析ESI-MS/MS检测Gln和Glu的正确度、精密度和稳定性,并评价其临床应用。结果Gln在125~1250μmol/L浓度范围内回收率和正确度均良好,回收率为98.01%~107.24%,偏倚为0.56%~4.8%;Glu在250~1250μmol/L浓度范围内回收率良好,回收率为102.06%~113.65%,在250~1250μmol/L浓度范围内正确度良好,偏倚为0.09%~7.67%。Gln精密度良好,Glu精密度稍差。稳定性实验证实在样品复溶前后,Gln差异无统计学意义,但Glu差异有统计学意义。结合Gln和Glu检测结果,6份鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症确诊患儿干血斑样品检出率为100%,并确定Gln的参考区间为<106.63μmol/L,Glu的参考区间为<188.24μmol/L。结论成功建立了检测Gln和Glu的ESI-MS/MS法,该方法操作简单、成本低,不影响临床常规检测。

微量明胶颗粒凝集试验检测干血斑HIV-1抗体方法的建立与评价

目的建立微量明胶颗粒凝集试验检测滤纸片干血斑HIV-1抗体的方法,评价其敏感性和特异性。方法采集某吸毒哨点106份全血样本,制成滤纸片干血斑样本和血清样本;摸索微量明胶颗粒凝集试验中抗原明胶颗粒最佳稀释倍比;比较微量明胶颗粒凝集试验检测滤纸片干血斑和ELISA检测血清HIV-1抗体的结果。结果微量明胶颗粒凝集试验检测滤纸片干血斑HIV-1抗体的结果与ELISA检测血清HIV-1抗体的结果一致。结论微量明胶颗粒凝集试验检测滤纸片干血斑HIV-1抗体的方法,可信度较高、操作简便成本低,为大规模开展HIV-1流行病学调查提供了另一种良好的实验室方法。

干血斑滤纸片检测Leber’s视神经萎缩线粒体突变

目的 建立干血斑滤纸片分析Leber's遗传性视神经萎缩(LHON)线粒体DNA(mtDNA)的方法,为更加广泛开展LHON的基因诊断和为进一步研究LHON积累资料。方法 收集了81例视神经炎、视神经萎缩或临床怀疑LHON患者的干血斑滤纸片,提取DNA,用突变特异性引物PCR(MSP-PCR)和异源双链-单链构象多态性(HA-SSCP)检测其mtDNA的三个常见原发致病突变位点。结果 81例受检者中,检出51例11778位点突变阳性;1例3460位点突变阳性;14484位点突变全部阴性。结论 应用干血滤纸片检测LHON的mtDNA,具有微量、准确、有效、邮寄方便的特点,值得推广。

干血斑毛细管电泳技术在新生儿地中海贫血筛查中的应用价值

目的:分析筛查新生儿地中海贫血时应用干血斑毛细管电泳技术的临床价值。方法:选取2019年1月至2019年8月在肇庆市第二人民医院及下属各机构出生的25780例新生儿为观察对象,对其足跟血血斑标本予以采集,采用干血斑毛细管电泳分析系统进行筛查,对初筛阳性的标本召回抽血行聚合酶链反应结合DNA测序确诊。结果:25780例新生儿α–地中海贫血初筛阳性2574例,阳性率9.98%,β–地中海贫血初筛阳性910例,阳性率3.52%,异常血红蛋白(Hb)初筛阳性58例,阳性率0.22%。初筛阳性召回人数554例,经基因确诊阳性524例,符合率为94.5%。结论:干血斑毛细管电泳与基因确诊联合筛查新生儿地中海贫血可为临床早期诊治地中海贫血提供科学依据。

聚合酶链反应扩增干血斑中乙肝病毒DNA的研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对乙肝病毒特异性基因片段进行扩增，４０个循环可检测出１０个病毒颗粒，５０个循环可检出１个病毒颗粒。用本法同时检测８０例干血斑和血清标本，其阳性率分别为７１．２５％和７３．２２％，两者无显著性差异，而干血斑的采集，贮存和转运较后者简便安全，且需血量很少，尤适于大量人群的普查和筛选。