序列特异性引物联合RT-PCR在LRRK2基因多态性分型中的应用

目的建立帕金森病(PD)相关基因LRRK2疾病易感位点R1628P、G2385R的新检测方法。方法设计序列特异性引物,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)的方法,对已知基因型的标准品进行分型检验;检测100例未知基因型的PD样品,并用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RLFP)的方法对待检样品基因型进行验证。结果标准品分型结果完全正确,待检的100例样品分型结果与PCR-RLFP分型结果完全吻合。结论序列特异性引物联合实时荧光定量PCR可成功实现对LRRK2疾病易感位点R1628P、G2385R的基因型分型。

建立序列特异性引物PCR检测儿茶酚胺氧位转移酶与单胺氧化酶基因多态性的方法

目的建立用PCR-SSP检测儿茶酚胺氧位转移酶(COMT)与单胺氧化酶(MAOA)的基因多态性的方法。方法根据COMT与MAOA的基因序列,采用针对变异位点的点突变方式设计出顺序特异性引物(SSP)进行PCR扩增,并借助常规电泳确定基因型。结果用PCR-SSP来研究COMT与MAOA基因多态性的方法特异性强,重复性好,而且简便、经济、快速。结论PCR-SSP可对具有单核苷酸突变的基因分型,应用前景良好。

序列特异性引物PCR法检测MN血型基因型

目的 建立MN血型系统基因分型的方法 ,检测人群中MN基因的频率。方法 用快速盐析法抽提样本DNA ,序列特异性引物PCR法检测MN基因。结果 115例汉族人群中MM基因型为 2 5例 ,MN基因型为 6 0例 ,NN基因型为 30例。M基因频率为 0 .4 78,N基因频率为 0 .5 2 2。结论 该方法可以检测MN血型基因型。

聚合酶链反应-序列特异性引物方法检测儿科疾病基因多态性

目的建立多个基因多态性分型的聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)的方法,以推广其在儿科疾病分子水平研究中的应用。方法应用PCR-SSP的方法分析以下基因的多态性,TNF-α-308A/G和-238G/A变异,IL-6-174G/C变异。结果应用同一个PCR扩增程序,可同时对多个基因、多个临床样本的多态性进行分析,基因型清晰,且基因分型快速、准确。结论PCR-SSP适合对大样本、多基因的多态性进行分析,成本低、快速、准确,在儿科疾病分子水平研究中前景良好。

羊水细胞ABO血型序列特异性引物-PCR法基因定型研究

目的探讨羊水细胞采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-sequence specific primers,PCR-SSP)法进行胎儿ABO血型基因定型检测的可靠性。方法 28例孕妇羊水细胞采用PCR-SSP法进行胎儿ABO血型基因定型检测,对应胎儿出生后进行ABO血型血清学定型。结果 28份羊水细胞中27份ABO基因定型结果与胎儿出生后血清学定型结果相符。结论 PCR-SSP方法检测羊水细胞ABO基因型能较准确判定胎儿ABO血型,可用于产前胎儿ABO血型检测。

改良型序列特异性引物PCR用于脂联素基因单核苷酸多态性的检测

目的运用序列特异性引物PCR技术(SSP-PCR)研究基因单核苷酸多态性。方法根据GenBank中人脂联素基因(APM1)序列及SNP信息,利用Primer5.0设计引物,通过PCR技术检测APM1的SNPs。结果建立并优化了序列特异性引物PCR(SSP-PCR)技术,并可快速、直观、准确地进行基因分型。结论改良的SSP-PCR技术是一种特异性更高、操作简便的SNP检测方法。

聚合酶链式反应-特异性序列引物基因定型在新生儿溶血病ABO血型定型中的应用

目的研究聚合酶链式反应-特异性序列引物(PCR-SSP)基因定型在新生儿溶血病(CHDN)ABO血型定型中的应用。方法收集20例来自广东省肇庆市第一人民医院新生儿溶血病(HDN)的样本,对这些样本进行ABO血型鉴定等一系列血型血清学方法进行检测,然后用PCR-SSP基因定型技术进行样本的基因分型。结果与其血型的血清学分型结果进行比较,新生儿溶血病ABO血型的定型是新生儿输血的必要保障,而PCR-SSP基因分型较血型血清学方法更快捷、准确。结论 PCR-SSP基因正型技术将不再局限于疑难血型的鉴定中,并会越来越多地应用于HDN的鉴定中。

血小板特异性抗原HPA-17bw基因分型及基因频率调查

目的对HPA-17bw基因分型并调查其在部分汉族人群中的分布。方法采用PCR-SSP方法对无亲缘关系的健康无偿献血者HPA-17bw进行基因分型,采用基因计数法进行基因频率、基因型频率的计算。结果259名正常人的HPA-17bw基因频率为0.000;HPA-17bw/bw的基因型频率为0.000。结论HPA-17bw为低频抗原,259份汉族样本中尚检测不出HPA-17bw。

二球悬铃木花粉变应原特应性体质与HLA-DRB1等位基因相关性分析

目的建立对二球悬铃木花粉过敏的特应性体质者的HLA-DRB1等位基因的PCR-SSP检测方法,探讨江苏汉族人二球悬铃木花粉变应原特应性体质者与HLA-DRB1等位基因的相关性。方法用酚-氯仿法提取全血DNA,合成8对等位基因特异性引物,用PCR-SSP方法检测20例江苏汉族二球悬铃木花粉过敏体质者和36例健康人HLA-DRB1*0401,*0402,*0403,*0404,*0405,*0406,*0407,*0408等位基因。结果经优化实验条件,建立了HLA-DRB1的8个等位基因的PCR-SSP检测方法,获得了患者组和健康人组上述HLA-DRB1等位基因的分布资料。二球悬铃木花粉变应原特应性体质者DRB1*0405和*0406基因频率高于健康人对照组而DRB1*0402基因频率低于健康人对照组。其他5个等位基因频率二组间无显著性差异。结论HLA-DRB1*0406和*0405可能是对二球悬铃木花粉变应原过敏的I型变态反应特应性体质者的可疑候选易患等位基因,而DRB1*0402基因可能是与之相关的具有抵抗作用的等位基因。

中国南方汉族和西藏藏族RHCE基因109bp插入序列和733C>G多态性研究

目的研究中国南方汉族人群和西藏藏族人群RHCE基因内含子2中109bp插入序列缺失情况和外显子5中733C>G多态性,并比较2民族间有无差异。方法收集186例中国南方汉族人样本和50例西藏藏族人样本,应用PCR-SSP方法对内含子2的109bp插入序列和外显子5的733C>G多态性进行检测,并用测序方法验证。结果在中国南方汉族人群中携带RhC抗原个体其RHCE基因内含子2中109bp插入序列的缺失率为1.08%,在西藏藏族人群中缺失概率为0,二者缺失率相比无统计学差异(χ2=0.02,P>0.05)。2民族所有样本RHCE基因外显子5的733位核甘酸均为G,未发现该位点存在733C>G多态性。结论 2民族在内含子2的109bp插入序列缺失和外显子5的733C>G多态性方面未发现二者有差异。在南方汉族人群中针对RHCE基因内含子2的109bp插入序列来检测RHCc基因会因缺失而导致假阴性错误。

特发性扩张型心肌病与HLA-A*基因的关联研究

目的探讨特发性扩张型心肌病(idiopathicdilatedcardiomyopathy,IDC)易感的分子机制和确立一种人类主要组织相容性复合体(HLA-A*)基因的检测方法。方法采用聚合酶链式反应和顺序特异性引物(PCR-SSP)基因分析方法,对31例特发性扩张型心肌病患者及29例无血缘关系的健康人的HLA-A*各等位基因及亚基因进行检测分析,并将该方法与其他检测HLA等位基因的方法进行对比。结果HLA-A*03基因与IDC呈正相关(RR=4.697,P<0.05),其他HLA-A*各等位基因未见异常。结论HLA-A*03基因可能是北方汉族人IDC的致病易感基因之一。采用的方法(PCR-SSP)具有快速、简便、敏感、准确和可靠等优点,值得推广。

HLA新等位基因HLA-A*11∶230序列分析及确认

目的对人类白细胞抗原(HLA)-A*11新等位基因核苷酸序列分析及确认。方法采用多聚酶链反应-测序(PCR-SBT)在对2015年中国造血干细胞捐献者资料库(CMDP)入库数据进行HLA常规分型中,应用组序列特异性引物(GSSP)单链测序方法针对常规SBT检测中A位点无匹配结果的2例无亲缘关系陕西汉族供者样本进一步进行确证实验,并运用聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针技术(PCR-SSO)进行对照实验。结果经确证实验发现2例无亲缘关系供者携带同一HLA-A新等位基因序列,与同源基因HLA-A*11∶01序列相比,均在第2外显子98位置发生A>G突变,该突变造成氨基酸序列9位由酪氨酸(TAC)变成半胱氨酸(TGC);而2例样本的PCR-SSO结果均显示为HLA-A的常见等位基因组合,未见异常反应格局。结论经WHO HLA因子命名委员会正式命名的新等位基因HLA-A*11:230的发现和鉴定表明,对于常规测序无匹配结果的样本应进一步深入分析,即使以常见等位基因组合为分型结果的SSO方法仍存在HLA新等位基因漏检的可能,需引起注意。

中国人群Kell血型K阳性的分子特征及分型试剂盒的研制和应用

目的了解中国人群Kell血型中K+型的分子生物学特征,并研制序列特异性引物-聚合酶链(PCR-SSP)试剂盒,为制订血型检测策略提供依据。方法测序分析血清学鉴定K+标本,确定K+突变类型,根据突变类型分别设计K、k基因型的特异性引物,研制PCR-SSP扩增试剂盒,同时分析100名上海地区献血者、23名外籍献血者、72名新疆地区维吾尔族献血人群的K/k基因型,并随机抽取阳、阴性标本进行测序。结果血清学鉴定为K+的突变类型为C698T突变;经研制的K/kPCR-SSP试剂盒可以特异性扩增K基因和k基因。1例新疆标本基因型为K+k+;3例外籍献血者标本基因型为K+k+,其余均为K-k+。结论本研究中所有中国人K+的分子生物学特征与西方人一致,经研制的PCR-SSP试剂盒可直观有效地检测KELK/k基因型。不同种族、不同地区献血者K+频率的差异有显著性,制订相关检测法规或条例时应有所考虑,建议外国人献血、产前检查时加做K+检测。

WHO HLA命名委员会命名的新等位基因HLA-A*24:327序列分析及确认

目的：发现一个人类白细胞抗原（HLA）-A新等位基因并对其核苷酸序列进行分析及确认。方法采用序列特异性寡核苷酸探针技术（SSO）对2015年中国造血干细胞捐献者资料库（CMDP）陕西分库入库数据进行 HLA常规检测，针对罕见结果进一步选择多聚酶链反应-测序（PCR-SBT）和组序列特异性引物（GSSP）进行确证试验，明确突变位点。结果 SSO分型结果显示为罕见等位基因，经PCR-SBT复核无完全匹配结果，提示疑似新等位基因，经 GSSP确证发现该基因与同源基因 HLA-B＊24∶02∶01∶01相比，在第3外显子544位置发生碱基变异由 G＞A，该突变造成氨基酸序列158位由丙氨酸（GCC）变成苏氨酸（ACC）。结论确认了一个新的 HLA-A等位基因，2015年12月31日被世界卫生组织HLA命名委员会正式命名为 HLA-A＊24∶327。

应用完整外显子2/3序列解决HLA-DRB1座位基因分型的歧义结果

背景:人类白细胞抗原基因测序分型中,当等位基因的差异碱基位于测序范围之外或不同等位基因对的杂合序列相同时,无法得到清晰的结果。目的:通过完整外显子2/3序列的测定,解决常规HLA-DRB1基因分型中的高比例歧义结果。方法:初次分型采用常规的测序方法检测320份样本的HLA-DRB1外显子2第一高变区以外的序列,测序反应设置codon86。后期采用一次性扩增外显子2/3,测序反应针对外显子2设置组特异性引物:DRB1*04/07/09为一组,其它基因家族为一组,设置conden86,对初次分型后为歧义结果的样本重新分型。结果与结论:初次分型有180份样本为歧义结果,占总样本数的56.25%。其中A类为差异碱基位于测序范围之外,共114例;B类为等位基因对的杂合序列相同,共17例;C类为两种情况同时存在,有49例。3种类别的歧义等位基因数分别为119个、34个、98个,占等位基因总数的33.06%、9.44%、27.22%。完整外显子2/3序列的测定使歧义结果比例从56.25%下降到14.37%,其中A类103例、B类8例、C类23例样本的等位基因得到确认。此次研究中发现了一个新等位基因,与跟它最相近的等位基因DRB1*110101相比,其外显子3的第381位碱基G>T,导致第98位氨基酸AAG(赖氨酸Lys)>AAT(天冬酰氨Asn)。序列已提交Genbank,编号HM807583,2010-08被世界卫生组织HLA因子命名委员会命名为HLA-DRB1*1197(编号HWS10010999)。提示,完整外显子2/3序列的测定能大幅降低歧义分型结果的比例。

上海地区汉族人群中性粒细胞抗原的基因频率与其分子特征研究

目的:了解上海地区汉族人群人类中性粒细胞抗原(Human neutrophil antigens,HNA)的基因频率分布与其分子特征。方法:使用序列特异性引物聚合酶链反应(Polymerase chain reaction-sequence specific primer,PCR-SSP)对上海地区326名随机健康献血者的HNA-1(-a,-b,-c),HNA-3(-a,-b),HNA-4a(+,-)和HNA-5a(+,-)进行基因分型,测序和PCR-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)验证其分子特征;并使用流式细胞术分析另外91份随机健康样本HNA-2a抗原表达。结果:本研究成功分析HNA-1、3-5各系统基因型。发现3例FCGR3B的变异体,其中2例为FCGR3B*01等位基因发生227 A→G和349 G→A的突变,另1例为一条染色体上的FCGR3B*02等位基因发生277 A→G的突变。HNA-1a、1b、1c、3a、3b基因频率分别为0.620、0.380、0、0.653和0.347,HNA-4a(+)、4a(-)、5a(+)、5a(-)基因频率分别为1、0、0.896和0.104,流式结果证实HNA-2a抗原频率为1,所测个体均具有HNA-2a阳性粒细胞,但不同个体具有不同比例的阳性粒细胞。这些分布与高加索人群相比有非常显著的差异,而与广东人群相比,主要是HNA-3系统分布有差异。结论:中国上海人群HNA具有独特的多态性,需要引起输血实践的注意。

孝感地区RhD阴性个体分子生物学特征初步研究

目的分析孝感地区RhD阴性个体的分子生物学特征。方法对血清学检测为RhD阴性的标本,通过PCRSSP的方法对RHD特异性外显子7及内含子4,启动子及外显子10进行筛查。阳性标本进一步筛查RHD基因特异性外显子3、4、5、6、7、9及RHD1227A,即DEL。结果在94例RhD阴性标本中,66.0%(62/94)为RHD基因完全缺失,23.4%(22/94)含完整的RHD基因,其中21例为RHD1227A,占22.3%(21/94),10.6%(10/94)为RHD基因部分缺失。结论 RHD基因缺失为孝感地区RhD阴性个体的主要分子生物学特征,DEL为次主要分子生物学特征。

HLA新等位基因HLA-B*13:68的序列分析

目的:分析确认中国人群中HLA-B位点的1个新等位基因。方法:应用PCR-SBT对中华骨髓库供者样本进行HLA分型,对可能的HLA-B新等位基因采用组序列特异性引物(GSSP)进行测序,并与已知同源性最高的等位基因进行序列比对,分析二者之间的差异。结果:其中1例样本HLA-B位点与目前已知的HLA-B基因序列均不一致,与其同源性最高的HLA-B*13:01:01序列相比,第2外显子137位碱基T>C,导致第22位密码子由苯丙氨酸(TTT,Phe)变为丝氨酸(TCT,Ser)。结论:该基因为HLA-B位点的新等位基因,已被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*13:68。

B(A)04/O01亚型分子遗传特征研究

ABO血型的正确解读是临床输血安全的前提,通过对B(A)04亚型从血清学表现、PCR-SSP及测序等分子方面进行全面分析,旨在为临床疑难样本的血型鉴定提供新的方法,同时为输血安全提供必要的专业建议。