兼抗4种烟草病毒病弱毒疫苗的构建与效果分析

为解决单靶标疫苗无法同时防治多种烟草病毒病的现状,以黄瓜花叶病毒Fny株系(Cucumber mosaic virus Fny,CMV_(Fny))为疫苗载体,利用重叠PCR技术在CMV_(Fny) RNA2弱毒突变体基础上以不同排列顺序插入TMV、PVY和TVBMV的部分基因组保守片段,构建了6种在本氏烟中交叉保护效果好、遗传稳定,并且对CMV、TMV、PVY和TVBMV 4种病毒均具有一定抗性的重组型病毒。6种重组型病毒对CMV单独侵染的防效均超过87%,对其他3种病毒单独侵染的防效为22.2%~46.2%,对4种病毒混合侵染的防效维持在16%~37%。本研究为烟草病毒病的防治提供了疫苗材料,丰富了植物病毒弱毒疫苗创制的实践。

黄芪多糖对鸡免疫禽传染性支气管炎弱毒疫苗免疫效果的影响

试验探究黄芪多糖(APS)对禽传染性支气管炎弱毒疫苗的免疫调节作用,以期发掘黄芪多糖用作疫苗佐剂的应用潜力。将120只14日龄蛋鸡随机分为3组,每组4个重复,每个重复10只蛋鸡,分别设置为APS+H120联合免疫组、H120疫苗组以及PBS阴性对照组。各组蛋鸡共进行3次免疫,每次间隔2周,每次鼻腔接种100μL/只。最后一次免疫14 d后经鼻腔攻毒禽传染性支气管炎病毒M41株,观察鸡的临床症状,检测肺脏和肝脏载毒量。结果显示,与H120疫苗组相比,APS+H120疫苗联合免疫能够诱导14日龄蛋鸡产生传染性支气管炎病毒(IBV)特异性免疫球蛋白G(IgG)和分泌型免疫球蛋白A(sIgA),有效保护蛋鸡抵抗同种异源毒株的攻击,蛋鸡存活率为100%。攻毒后APS+H120组蛋鸡未出现禽传染性支气管炎典型临床症状,蛋鸡生产性能未受到影响。研究表明,APS对禽传染性支气管炎H120弱毒疫苗的免疫效果具有促进作用。

牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性研究

本试验旨在评估牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性。12头4~6月龄犊牛随机分成3组,每组4头,各组分别肌肉注射牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗、牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗或疫苗稀释液,2 mL/头。试验结果表明,免疫后所有试验用牛无牛病毒性腹泻病毒引起的发热和临床症状,也不引起白细胞水平的下降;仅1头牛在免疫牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失疫苗后第7 d检测到病毒血症和鼻腔排毒,在其他时间点均为阴性。所有犊牛均无大体病理学和组织病理学变化。综上所述,牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因弱毒疫苗对4~6月龄的犊牛安全性良好。

罗非鱼无乳链球菌弱毒疫苗不同免疫途径最适宜免疫温度的研究

为了获得罗非鱼无乳链球菌弱毒疫苗不同接种途径最适宜的免疫温度,试验将罗非鱼(Oreochromis niloticus)饲养于4个水温(22℃、26℃、30℃、35℃)中,每个饲养水温分为4组,分别为浸泡组、注射组、口服组和空白对照组,每组40尾。浸泡组罗非鱼链球病疫苗浸泡浓度为1×10^(7)cfu/mL,浸泡时间为15 min;注射组腹腔注射疫苗,疫苗菌液浓度为1×10^(8)cfu/mL,0.2 mL/尾;口服组将疫苗均匀喷洒至饲料表面,晾干投喂,分别于试验第1,3,7天口服接种,疫苗菌液浓度为1×10^(8)cfu/mL,0.2 mL/尾。于免疫后第5,10,15天每组随机选取3尾采集血液及脏器组织,检测免疫后疫苗抗原组织分布、血清抗体水平和溶菌酶活性,计算疫苗相对免疫保护率。结果表明:注射组免疫后第5,10,15天罗非鱼脾脏组织均可检测到疫苗抗原;饲养水温为35℃时,注射组免疫后第5,10,15天血清抗体水平极显著高于空白对照组(P<0.01);饲养水温为22℃时,浸泡组、注射组和口服组血清溶菌酶活性显著或极显著高于空白对照组(P<0.05或P<0.01)。随着饲养水温的升高,浸泡组相对免疫保护率逐渐降低,22℃时为52.33%;注射组相对免疫保护率逐渐升高,与饲养水温呈正相关,饲养水温为22℃、26℃、30℃、35℃时相对免疫保护率分别为21.53%、68.25%、85.64%和90.43%;口服组相对免疫保护率先升高后下降,26℃饲养水温罗非鱼免疫效果最好,相对免疫保护率为54.51%。说明罗非鱼链球病疫苗浸泡免疫接种最适饲养水温为22℃,注射免疫接种最适饲养水温为35℃,口服免疫接种最适饲养水温为26℃。

牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗在怀孕母牛中垂直传播能力评价

本研究通过对怀孕母牛免疫牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗后检测胎牛组织中是否存在疫苗病毒,以评价该疫苗的垂直传播能力。试验将16头牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原和抗体阴性,怀孕60~90 d的母牛随机分成2组,第1组6母牛肌肉注射2.0 mL牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗;另外2头牛不做任何接种作为哨兵牛同群饲养。第2组6母牛肌肉注射2.0 mL牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗;另外2头牛不做任何接种作为哨兵牛同群饲养。母牛免疫后血清抗体转阳,BVDV抗体明显升高。免疫后第56 d剖取免疫牛的胎牛,采集胎牛脑、胸腺、肠系膜淋巴结和脾脏组织用病毒分离方法检测牛病毒性腹泻病毒。结果显示,所有怀孕母牛在整个试验期内无任何临床症状,也无流产现象。试验结束时胎牛发育良好,且未在胎牛的脑、胸腺、肠系膜淋巴结和脾脏组织中分离到牛病毒性腹泻病毒。综上所述,牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对怀孕母牛和胎牛都是安全的,无垂直传播。

兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒弱毒疫苗的创制

黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯X病毒(PVX)在烟草中普遍存在、危害严重,对烟草产业健康发展有重大影响。为预防田间烟草上黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒,需要构建能够同时预防CMV和PVX的弱毒疫苗。本研究首先构建了CMV RNA2的2b蛋白提前终止突变体pCB301-CMVFny-R2-2bPT,在此突变体中插入200 bp的PVX保守序列(5890-6089)获得突变体质粒pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089。该突变体质粒与含野生型CMVFny RNA1和CMVFny RNA3的质粒等量混合后通过农杆菌浸润方法分别接种中烟100、红花大金元和林烟草,接种后烟草症状与野生型CMVFny-RNA1+RNA2+RNA3混合接种烟草症状相比显示弱侵染性。疫苗遗传稳定性检测证实疫苗载体中插入的PVX 200 bp保守片段稳定存在,CMV和PVX强毒株系攻毒试验表明该弱毒疫苗在中烟100上对CMV和PVX同时具备交叉保护作用。

山羊痘弱毒疫苗(AV41株)接种途径和剂量对牛抗体反应的影响

为评估山羊痘弱毒疫苗(AV41株)经皮下和皮内接种牛体后的抗体产生规律,优化牛体免疫程序,选取25头健康成年肉牛分为5组,每组5头,标准单头份剂量为含量1.0×10^(3.5)TCID_(50) AV41株,分别以5倍和10倍羊用剂量进行皮下和皮内免疫,于接种后0、15、30、45和60 d,利用病毒中和试验(VNT)和ELISA试剂盒检测血清抗体水平。结果显示:鼻咽拭子和血液PCR结果均为阴性,未出现排毒;VNT与ELISA抗体检测结果相似,免疫后第30天,皮下接种5倍剂量组中有60%牛抗体转阳,中和抗体滴度最高达1∶640。同时,皮内和皮下10倍剂量组各有40%牛抗体转阳,皮内5倍剂量组有20%牛抗体转阳。VNT中和指数与ELISA的S/P值呈现显著正相关。上述结果表明,类似于国际上相关疫苗的接种途径和剂量,皮下注射5倍羊头份剂量山羊痘弱毒疫苗是安全和有效的,可作为临床预防牛结节皮肤病的免疫接种方案。

3种非猪瘟病毒单独或混合感染对猪瘟弱毒疫苗免疫效力的影响

将 2 0头 9月龄左右猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合征抗原、抗体阴性猪分成 6组 ,分别利用猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒 (PRV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 (PRRSV)单独或混合感染。 7d后连同对照猪 4头 ,免疫接种猪瘟兔化弱毒疫苗 (HCL V) ,13d后连同 4头阴性对照猪一起攻击猪瘟石门强毒。整个试验期间分别每天测温 ,观察临床症状 ,每周采集扁桃体和血样做各种病毒抗原及抗体检测。结果表明 ,非猪瘟病毒感染 7d后 ,所有各组猪均从体内检测到了相应感染的病原 ,表明 3种非猪瘟病毒感染成功。在攻击猪瘟石门强毒后 2周 ,感染了非猪瘟病毒后接种 HCL V疫苗的 4个免疫组 12头猪除 1头外 ,11头全为猪瘟病毒 (HCV)抗原检测阳性 ,且多呈强阳性 ;而单一 HCL V疫苗免疫组在猪瘟强毒攻击后检测不到 HCV;所有 HCL V疫苗免疫猪均存活 ,而非免疫对照组 4头猪全部在攻毒 16 d内死亡。

猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联弱毒疫苗的研究

用TGE及PED克隆化弱毒株以1：1配比制成TGE、PED二联弱毒疫苗，毒价为107.0-7.5TCID50／0.3ml，主动免疫与被动免疫的保护率为97.7％及98％。弱毒株毒力稳定，符合制苗标准。免疫期7个月，疫苗保存期一年，疫苗接种猪对同圈饲养的非免疫猪有低效价（16～32倍）的水平感染。6个猪场的田间试验保护率为95％-98％，对紧急预防接种的防制效果更为明显。

荧光定量PCR作为猪瘟兔化弱毒疫苗效价检验替代方法的研究与应用

【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)的荧光定量PCR方法(FQ-PCR),为猪瘟兔化弱毒疫苗的效力检验提供一替代方法。【方法】在猪瘟兔化弱毒疫苗基因组3′非编码区设计一对针对猪瘟兔化弱毒株的特异性引物和一条MGB探针,并进行反应体系及反应条件优化,以及特异性、灵敏度、稳定性及符合性试验。将此方法用于部分批次疫苗厂疫苗半成品的定量检验,与兔热反应进行比较,寻求两方法的相关性。【结果】试验结果证实,CT值与模板之间呈现良好的相关性,相关系数为0.9998,扩增效率为101.14%;该方法仅扩增HCLV,不扩增HCLV以外的其它病原,显示良好的特异性;具有较高的灵敏度,能检测模板中4.35个cDNA拷贝量,比CSFV-RT-nPCR高1个数量级。将此方法应用于4个厂家17个批次的34份猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验,两只兔子均无热反应(不合格)样品共11份,FQ-PCR CT值为21.15—27.30;两只兔子一只呈现定型热,一只无热反应的样品12份,CT值为17.47—23.70;两只兔子都呈现定型热或者一只呈现定型热一只呈现轻热反应(合格品)样品共11份,CT值为17.10—20.8。【结论】建立的HCLV-FQ-PCR方法能特异性的检测疫苗核酸含量,与家兔热反应测定结果存在良好的相关性,可以用于猪瘟疫苗半成品中HCLV定量检测。

草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗的制备及其免疫效果

本文报道经筛选的ＧＣＨＶ－８４１毒株在草鱼吻端成纤维细胞系（ＰＳＦ）中进行适应性培养，弱毒驯化，细胞培养弱毒疫苗的制备，安全性观察，不同稀释度和剂量的免疫保护率测定及保存试验。ＧＣＨＶ－８４１毒株在ＰＳＦ细胞中继代驯化至５３代达到减毒目的。筛选得５３～５９代作毒种制备的细胞弱毒疫苗使用安全。用稀释１０～１０４倍的疫苗，０．１～０．３毫升／尾剂量注射草鱼，其免疫保护率均在８５％以上。生产上使用疫苗的适宜浓度和剂量是稀释１０２倍和０．２毫升／尾。冻干疫苗宜保存于４℃以下。较合适的保存期是６个月（４℃）和１８个月（－２０℃）。

猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾

猪瘟是一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。20世纪50年代中国首创了举世闻名的猪瘟兔化弱毒疫苗(即C株),随后创制了不同的疫苗制造工艺,如细胞培养苗、乳兔组织苗和牛体反应组织苗等。C株是一株非常安全的弱毒疫苗,对各种年龄和品种的猪都没有副作用,并且有良好的免疫效力,它能同时诱导体液免疫和细胞免疫应答,对不同基因型的猪瘟病毒株均能提供有效的免疫保护。免疫母猪通过母乳可对仔猪提供被动免疫保护,但过高水平的母源抗体会影响仔猪对C株疫苗的主动免疫应答。目前已经完成了包括C株及其亲本株在内的几十株猪瘟病毒的全基因组序列测定和注释,建立了猪瘟病毒的反向遗传操作系统,初步解析了猪瘟病毒主要基因的结构与功能,并构建了不同的反向遗传操作标记疫苗,赋予了C株疫苗新的生命和内涵。C株疫苗可以用于猪瘟的控制和根除,借助于C株疫苗密集接种和综合控制措施,有关国家有效地控制了猪瘟,甚至消灭了猪瘟。尽管如此,要在全球范围内根除猪瘟,今后依然有漫长的路要走,这可能有赖于对C株进行进一步改造和利用。

法氏囊活性肽对鸡传染性法氏囊病弱毒疫苗免疫效果的影响

将不同剂量的法氏囊活性肽 (BS)冻干粉与鸡传染性法氏囊病 (IBD)弱毒疫苗混合 ,对 2 1日龄SPF鸡滴鼻点眼 ,另设免疫对照组和生理盐水对照组 ,于免疫后 7d、10d、14d、2 1d、2 8d、45d、6 0d、75d和 90d采血 ,测定AGP抗体效价 ,并于免疫后 7、14、2 1、2 8d ,每组剖杀 2只 ,计算试验组囊指数与空白对照组囊指数之比 (BBIX) ,免疫后 30d用IBD JS株攻毒。结果表明 :免疫后 7d ,0 48mgBS IBD弱毒苗组AGP抗体阳性率为 5 2 9% ,比免疫对照组高 2 5 % ,BBIX数值也稍大 ;免疫后 45d抗体水平达到高峰时 ,0 96mgBS IBD弱毒苗组的抗体效价比免疫对照组高2个滴度 ,BBIX数值也稍大于免疫对照组。 30d后攻毒 ,各免疫组的攻毒保护率均为 10 0 %。整个试验期间 ,1 92mgBS IBD弱毒苗组的AGP抗体效价及BBIX数值与免疫对照组相比差异不显著。结果表明 :BS在增强机体免疫应答、提高对法氏囊的保护及损伤后的修复作用方面与其剂量有一定的关系。

苜蓿多糖对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫效果的影响

用苜蓿多糖作为猪瘟兔化弱毒疫苗的强化剂对60日龄体重18～20 kg的仔猪进行免疫试验研究.B淋巴细胞和抗体水平监测结果表明,苜蓿多糖可使猪外周血液的B淋巴细胞增多,血清抗体水平提高.攻毒试验表明,参试的2批猪,试验组潜伏期(34～72 h和36～68 h),明显长于对照组(12～48 h和14～48 h),发热温度试验组为(40.5～40.9℃和40.6～40.8℃)低于对照组(41.4～42.0℃和41.2～41.7℃),高热期试验组为(30～96 h和46～98 h)低于对照组(72～148 h和72～146h).说明苜蓿多糖对猪瘟疫苗免疫效果具有明显的强化作用.

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。

RT-LAMP可视化检测猪瘟病毒及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗

【目的】建立可视化检测猪瘟病毒(CSFV)及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),为临床检测CSFV野毒株及特异性鉴别HCLV毒株提供技术支持。【方法】根据Gen Bank中CSFV非结构蛋白NS5B基因的保守序列,设计两套针对CSFV和HCLV的特异性引物,并优化RT-LAMP反应条件,同时用LA-320C浊度仪实时监测其浊度变化。【结果】优化的RT-LAMP仅需在63℃水浴锅中反应50 min即可完成检测,且能通过肉眼观察反应液的颜色变化直接判定结果;所有CSFV样本的检测结果均为阳性(翠绿色),其他非CSFV样本的检测结果均为阴性(桔红色),且能特异性鉴别HCLV毒株,与实时浊度监测结果一致。该方法对CSFV和HCLV的最小检测限分别是100和101 copies,敏感度分别是常规RT-PCR的100倍和10倍。【结论】建立的RT-LAMP特异性强、灵敏度高、方法简便,尤其适合基层进行CSFV感染的快速检测及特异性鉴别HCLV,对有效防控CSF具有重要意义。

猪瘟强毒株与兔化弱毒疫苗株的LAMP鉴别检测

为了鉴别猪瘟病毒(CSFV)野毒感染和疫苗接种,系统比较分析CSFV标准强毒株、疫苗株、不同基因亚型的野毒株的全基因组序列差异,设计一套分别针对猪瘟强毒与弱毒NS5B基因的环介导等温扩增(LAMP)引物,建立特异性的猪瘟强毒株与疫苗株的LAMP检测方法.LAMP扩增产物用罗丹明B指示剂或者琼脂糖凝胶电泳进行检测.该方法特异性好,比RT-PCR灵敏度高出1 000倍,且重复性稳定性良好,为快速准确地鉴别CSFV野毒感染和疫苗接种提供了有效的方法.

马传染性贫血病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建

采用PCR方法分 3段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株 (EIAVDLA)的前病毒DNA ,这 3个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组 ,PCR产物经克隆后顺次连接 ,获得 1个含有EIAV全基因 (8.0kb)的重组质粒 ,将其命名为p8.0。将此 8.0kbEIAV全基因再亚克隆到含有一完整EIAVDLA株长末端重复序列的质粒中 ,获得一含有EIAV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒 ,将其命名为p8.2 ,经核苷酸序列分析 ,证明p8.2含有EIAV前病毒的全基因。用p8.2转染驴白细胞 ,将其作为种毒进行传代 ,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶活性 ,说明在驴白细胞中由p8.2衍生出了EIA病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后 ,第 4天出现病变 ,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子 ,进一步证明p8.2具有感染性 ,笔者获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆 。

小鹅瘟病毒VP3真核表达质粒与弱毒疫苗诱导鹅体免疫应答的比较

【目的】比较小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)和弱毒疫苗免疫鹅体内的免疫应答,以期为进一步研究和阐明pcDNA-GPV-VP3免疫发生机理、免疫持续期等提供基础数据。【方法】将pcDNA-GPV-VP3和小鹅瘟弱毒疫苗分别免疫30日龄四川白鹅,用免疫组织化学方法检测免疫鹅体内GPV抗原的分布,用淋巴细胞增殖实验和间接ELISA分别检测免疫鹅的细胞免疫水平和血清抗体滴度,比较GPV基因疫苗与弱毒疫苗诱导鹅体免疫应答的能力。【结果】①弱毒疫苗组于免疫鹅的心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、胸腺、哈氏腺、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠、胰腺、大脑及注射部位肌肉均中检测到GPV抗原;基因疫苗组于免疫鹅的心、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠及注射部位肌肉中检测到GPV抗原。②弱毒疫苗免疫雏鹅外周血T淋巴细胞14 d后对ConA的反应开始增强,35 d达到最高值后下降;基因疫苗免疫雏鹅外周血T淋巴细胞OD值先下降,14 d后开始上升并高于空白质粒对照鹅和PBS对照鹅,35 d时达最大值,以后又逐渐下降,第21-63天极显著(P<0.01)高于PBS对照鹅和空白质粒对照鹅,第21-63天时极显著(P<0.01)高于弱毒疫苗免疫鹅。③弱毒疫苗免疫鹅血清抗体第3天开始高于PBS对照鹅,第28天达到最大值后逐渐下降;基因疫苗免疫鹅血清体从第14天开始高于PBS对照组,第28天达最大值,第21-217天显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于PBS和空白质粒对照鹅;基因疫苗免疫鹅血清抗体除第28天极显著(P<0.01)高于GPV弱毒疫苗免疫鹅外,其余时间与弱毒疫苗免疫鹅差异不显著。【结论】pcDNA-GPV-VP3免疫雏鹅后能在免疫部位皮肤、心肌和各肠段中表达并能够诱导鹅体产生良好的细胞免疫和体液免疫,基因疫苗诱导鹅体产生免疫应答的能力优于弱毒疫苗,结果为阐述pcDNA-GPV-VP3的免疫机制和临床应用提供了数据资料。

应用复合多聚酶链反应方法快速鉴别伪狂犬病弱毒疫苗与野毒

本研究根据伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）共有ｇＢ和疫苗株缺失的ｇＥ基因序列分别设计并合成１对通用（ＰＢ１／ＰＢ２）和１对鉴别引物（ＰＥ１／ＰＥ２），以在我国广泛使用的疫苗株Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１及从国内外收集的野毒株Ｓ、ＳＵ、Ｆ、Ｌ、Ｙ、Ｍｉｎ－Ａ、Ｓｈｏｐｅ、Ｓ（川）、ＳＬ１、１０＃、ＥＡ（鄂Ａ）ＤＮＡ为模板在同一反应管中同时扩增ｇＢ和ｇＥ基因序列建立了复合多聚酶链反应（ＰＣＲ）方法。ＰＣＲ产物经２．０％琼脂糖凝胶电泳显示，从所有１１株野毒ＤＮＡ中都扩增出３７２ｂｐ和５２６ｂｐ两个片段，而Ｂａｒｔｈａ－ｋ６１只扩增出３７２ｐｂ一个片段。酶切分析证明ＰＣＲ产物是特异性的。ｇＢ基因是ＰｒＶ主要保护性抗原基因，是病毒复制必需的，强弱毒都有此基因；Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株是ｇＥ基因缺失的弱毒。所以，本实验建立的方法通过１次ＰＣＲ即可有效鉴别疫苗毒与野毒。这一方法将在今后根除伪狂犬病计划中发挥重要作用。