橡胶树形成层组织的酵母双杂交cDNA文库构建及HbHDA6互作蛋白筛选

次生乳管是天然橡胶合成和贮存的场所,是由橡胶树树干树皮中维管形成层细胞分裂分化而来。次生乳管的数量与天然橡胶产量直接相关,而这些乳管的数量取决于形成层分化次生乳管的频率(乳管分化能力),是橡胶树产量育种的主要指标。前期研究中,我们发现组蛋白去乙酰化酶(HDA)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)能诱导橡胶树乳管分化且组蛋白去乙酰化酶基因(HbHDA6)能够参与橡胶树乳管分化调控。由于组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制尚未阐明,因此该文使用冠菌素(COR)诱导橡胶树形成层分化产生次生乳管的实验系统,以分离形成层组织为材料,构建酵母双杂交cDNA文库,以HbHDA6基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库,确定与HbHDA6相互作用的蛋白。结果表明:(1)利用Gateway技术构建的均一化COR诱导橡胶树形成层组织的酵母双杂交cDNA文库,初级文库的容量为6.34×10^(6)CFU·mL^(-1),总单克隆数为1.27×10^(7),文库重组率为100%;次级文库的容量为7.72×10^(6)CFU·mL^(-1),总单克隆数为1.54×10^(7),文库重组率为100%。初级文库和次级文库的插入片段平均长度分别为1.1 kb和1.2 kb。(2)成功构建了筛选HbHDA6互作蛋白的pGBKT7-HbHDA6诱饵载体,并确认无自激活活性。(3)使用该诱饵载体对构建的酵母双杂交cDNA文库进行筛选,并通过NCBI_BLAST比对和去除重复以后,获得了22个与HbHDA6发生互作的蛋白,包括CLP1、ERF3、ERF4、HSP82、LARP6a、APT5、PP2A、FBA6等。该研究成果为解析组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制提供了理论基础,为转基因改良橡胶树的产胶潜力提供了候选基因,为高性能天然橡胶遗传改良育种提供了新线索。

冠菌素诱导橡胶树次生乳管分化的形成层细胞CUT&Tag文库构建和初步分析

CUT&Tag技术是一种研究蛋白质-DNA互作的新方法,使用超高活性的新型pG-Tn5转座酶,在抗体引导下精准靶向切割目的蛋白附近的DNA序列,从而进行cDNA建库和测序分析。此技术在人类和动物研究中应用广泛,由于植物细胞结构特殊,该技术在植物研究中应用较少。在前期研究中,我们发现组蛋白乙酰化修饰参与茉莉酸诱导橡胶树次生乳管分化的调控,但其分子机制尚未阐明。本研究利用冠菌素(COR)诱导橡胶树萌条维管形成层分化次生乳管的实验系统,通过酶解法获取高质量的形成层区细胞原生质体,使用组蛋白H3乙酰化修饰抗体对次生乳管分化过程中发生组蛋白乙酰化修饰的区域进行原位识别,采用CUT&Tag技术成功构建COR处理橡胶树树皮形成层细胞的cDNA文库。对构建cDNA文库进行质检和测序分析,发现文库质量较好,并通过差异基因的GO和KEGG富集分析,发现生长素、类黄酮代谢和蛋白质泛素化等相关基因得到富集。本研究结果为使用CUT&Tag技术构建植物组织的cDNA文库提供操作方法,为解析组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制提供理论基础。

木本植物形成层活动的分子调控机制

维管形成层位于木质部和韧皮部之间,负责诸多生长和发育过程,在木材生产上也起重要作用。开展木本植物形成层活动的内部分子机制研究,对木本植物径向生长和林木生物量的增加具有重要的理论价值。深度成像结合基因表达分析技术是一种前沿研究方向,数学建模和仿真结合实时成像在模拟形成层生长和潜在的分子过程中有重要应用前景。基于该技术,总结了当前形成层活动分子层面的部分代表性成果,并对未来研究提出展望。目前植物形成层活动的分子研究主要集中在:(1)形成层活动受到植物激素信号的调控;(2)转录因子、肽受体信号调控形成层活动;(3)形成层活动受到受体激酶信号的调控。主要结论为:WOX4、WOX14、HB4、HB7、HB8、ANT等正向调控树木形成层活动,可作为木材增粗育种转基因的首选。未来通过计算机模型剖析形成层内细胞间通信联系,能够更全面地解析木本植物维管形成层发育分子机制。

核桃枝条形成层活动周期及其淀粉贮量的变化

为了确定核桃的适宜嫁接时期、提高嫁接成活率,以核桃1年生枝条为试材,采用番红-苏木精I、2-KI染色方法,对形成层活动周期及淀粉贮量的变化进行了研究。结果表明：3月中旬—4月中旬,形成层带细胞层数由2-3层增加到4-5层,经I2-KI染色的薄壁组织细胞颜色逐渐变浅,枝条中淀粉逐渐减少,形成层进入活动期;5月中旬—6月中旬,细胞层数由6-7层逐渐增加到11-12层,薄壁组织细胞未见蓝色出现,枝条中淀粉全部消失,形成层进入活动旺盛期;7月—9月中旬,细胞层数由9-10层逐渐减少到5-6层,薄壁组织细胞颜色逐渐变深,淀粉开始逐渐增多,形成层活动减弱;9月中旬—9月底,细胞层数由5-6层逐渐增加到8-9层,薄壁组织细胞颜色逐渐变浅,淀粉逐渐减少,形成层活动加强;9月底—11月中旬,细胞层数由8-9层逐渐减少到2-3层,枝条中薄壁组织细胞颜色逐渐变深,淀粉开始逐渐增多,形成层活动减弱。

刺桐(Erythrina arborescens Roxb.)原形成层向维管形成层转化的研究

作者对刺桐原形成层向维管形成层转化的研究表明 ,刺桐的维管形成层为叠生形成层 ,由分散的、排列成环的原形成层束转化而来 ,其转化过程是渐进的 .在初生生长的很早阶段就出现了长、短两类细胞 ,即原初的纺锤状原始细胞和原初的射线原始细胞 .它们分别发育转化为维管形成层中的纺锤状原始细胞和射线原始细胞 .在转化过程中 ,长细胞的端壁由平截转变为尖削 ,短细胞则由短的长方形转变成近等径的多边形 .原初的射线原始细胞和射线原始细胞皆含有淀粉粒 ,纺锤状原始细胞的叠生状态直到次生生长出现以后才由于连续的径向垂周分裂而获得 .在 1～ 4年生枝中 ,随着年龄的增长 ,射线高度减小 ,宽度增加 .射线原始细胞可以伸长而转变成纺锤状原始细胞 ,从而将轴向的高射线隔分成矮射线 ,纺锤状原始细胞也可以由于横分裂而产生新的射线 .纺锤状原始细胞的长度一般为 170～ 2 90 μm ;射线原始细胞的长度一般为 2 8～ 5 3μm .

喜树原形成层到形成层转化的研究

观察了枣树茎中原形成层到形成层的转化过程。距茎端0．5mm处，节间开始伸长之前，横切面上4—5个原形成束及束间的分生组织组成原形成层环。径向切面观，原形成层环呈现出较均一的结构。随着节间开始伸长，由于原形成层细胞发生假横向分裂，出现了长短两类细胞，长细胞多数端壁倾斜，短细胞多数端壁平截。以后，长细胞发育为纺缍状原始细胞，短细胞发育为射线原始细胞，部分射线原始细胞可以伸长井侵入生长而转化为纺缍状原始细胞。在节间伸长将停止时，此种转化基本完成。喜树为非叠生形成层，纺缍状原始细胞和射线原始细胞都有多核现象发生。

美洲黑杨维管形成层发生发育的解剖学观察

利用常规石蜡切片技术，观察研究了美洲黑杨维管形成层的发生和发育，结果表明：（１） 从顶端分生组织至原形成层，以及由原形成层向维管形成层的转化是随着茎的发育逐渐向顶进行的，而且叶迹与维管组织的发育密切相关；（２） 维管形成层为叠生型，并在芽萌动前已开始活动，４ 月中旬进入活动旺盛期，分裂形成的薄壁细胞迅速分化为导管参与构成次生木质部。

湿地松树木形成层恢复活动期、活动期和休眠期原始细胞超微结构变化

【目的】以树木形成层细胞分生分化活动为主线,探讨湿地松木材形成过程,为湿地松人工林培育、材性材质改良和森林资源利用提供科学依据。【方法】制作超薄切片,采用透射电镜观察湿地松年生长不同活动期形成层原始细胞超微结构变化及其木材形成过程。【结果】湿地松形成层纺锤形细胞的出现标志着细胞打破休眠期进入恢复活动期。2月底至3月底为形成层细胞恢复活动期,部分自溶现象发生于形成层细胞径向壁,尤其在细胞壁连接处,纺锤形细胞径向壁和弦向壁厚度差异不显著,呈椭圆形或近圆形,形成层纺锤形细胞出现少许质壁分离现象,淀粉颗粒出现明显电子透明区。4月初至10月底为形成层细胞活动期,整个形成层带细胞高度液泡化,细胞形状变得不规则,径向壁和弦向壁均变薄,弦向壁更薄且变得不明显,油滴和淀粉颗粒急剧减少。6月中旬为形成层细胞活动旺盛期,形成层带细胞层数明显增加,次生壁开始加厚,原生质体基本瓦解并消失。10月底至次年2月底形成层细胞处于休眠期,形成层带细胞层数明显减少,只含有1~2层扁平的厚壁纺锤形细胞,径向壁和弦向壁明显增厚,细胞内含物开始积累。整个活动期内形成层细胞径向壁明显比弦向壁厚,休眠期这种差异更明显,细胞壁特别是径向壁变薄是形成层恢复活动的主要特征。整个生长季均出现松针脱落现象,休眠期也有新的松针产生,松针产生和脱落与形成层细胞的休眠和激活无明显关联。次生木质部中成熟的射线细胞一直含有较多内含物,其原生质体没有出现衰退现象,说明次生木质部中的射线薄壁细胞多年内仍保持较高生理活性,以备在形成层细胞受伤后射线薄壁细胞转化为形成层细胞进行新的分裂分生活动。【结论】湿地松形成层细胞层数基本为1~2层,其年活动期内具有明显的休眠期和活动期变化。2月底至3月底为形成层细胞恢复活动期;4月初至10月底为形成层细胞活动期,是木材形成的主要阶段;6月中旬为形成层细胞活动旺盛期;10月底至次年2月底为形成层细胞休眠期。各时期内,形成层细胞层数、径向壁和弦向壁厚度、细胞内含物差异很大。

植物的形成层

木本双子叶植物和裸子植物在生活的整个过程中,根、茎得以不断长粗,是由于维管形成层的产生和周期性地进行分裂,向内形成木质部,向外形成韧皮部的结果。粗大树干和老根外部不断死亡、剥落,而树皮不但没有变薄,而且在不断缓慢增厚,这是除了维管形成层的活动,向外形成韧皮部外,还有木栓形成层的不断产生和活动,年年形成周皮的结果.

白皮松形成层活动周期中过氧化物酶和酯酶同工酶的变化

白皮松（ＰｉｎｕｓｂｕｎｇｅａｎａＺｕｃ．）枝条不同组织中过氧化物酶（ＰＯＤ）和酯酶（ＥＳＴ）同工酶的酶谱也不同，而且每种组织中这两种酶的同工酶酶谱随形成层活动周期的变化而变化。在休眠期，形成层区域过氧化物酶的同工酶酶带最多，这时周皮和韧皮部中酯酶同工酶酶谱在正极端出现一些酶带，这可能与抗寒有关。活动开始时形成层区域负极端出现一特异酯酶酶带，可能与形成层开始分化有关。活动期中，周皮、韧皮部和木质部中酯酶的正极端也有特异性表达的酶带，这些酶带与韧皮部和木质部的分化密切相关。一些过氧化物酶同工酶酶带在形成层恢复活动时消失，到休眠期又出现，这可能与ＩＡＡ（３－吲哚乙酸）水平的变化有关。

毛白杨形成层的活动周期及其POD同工酶的变化

北京地区生长的毛白杨 (PopulustomentosaCarr .)在春季芽膨大前 ,形成层带已经进入了恢复活动期。在芽展开后一周形成层进入活动期 ,细胞开始分裂 ,细胞层数也有所增加 ,同时分化出未成熟的韧皮部细胞。未成熟韧皮部细胞的数量在形成层活动初期快速增长 ,随后是一个持续而缓慢的连续过程。木质部的产生比韧皮部要晚 3周 ,未成熟的木质部细胞层数在开始变化不大 ,5月底～ 6月底 ,增长速度明显高于初期 ,随后便急剧下降。成熟木质部细胞的出现比成熟的韧皮部细胞要晚约一个月。与其他研究结果不同 ,毛白杨在4月底到 6月底这段时间 ,形成层细胞层数迅速下降 ,未成熟韧皮部细胞也略有减少 ,而未成熟和成熟的木质部细胞则大量增加。木质部在 9月底停止分化 ,较韧皮部要晚约 2 0d。 9月底形成层进入休眠期后 ,形成层细胞层数基本保持不变 ,直到翌年春天恢复活动。毛白杨形成层区域的过氧化物酶 (POD)同工酶在形成层活动期其活性低、酶带少 ,而恢复活动期和休眠期其活性高且酶带多 ,组织化学反应还表明 ,不同时期POD在不同的细胞和组织中的活性不同。本文对POD同工酶在形成层活动周期中的变化与其组织分化的关系进行了讨论。

SMART策略构建小黑杨茎形成层全长cDNA文库

为了研究小黑杨木材形成过程中的关键基因,以2年生小黑杨茎形成层组织为试验材料提取RNA,采用SMART(RNA转录过程中的5′末端转换机制)技术合成cDNA第一链,通过LD-PCR合成双链cDNA。利用SfiⅠ限制性酶酶切后将其连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,构建全长cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.18×106pfu/mL,扩增后的文库滴度为5.46×109pfu/mL,重组率为96%。插入片段长度在0.5～2.0kb之间,平均长度为1.12kb,表明构建的小黑杨茎形成层cDNA文库较为理想。

杜仲形成层活动周期及过氧化物酶和酯酶同工酶的变化

杜仲（ＥｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓＯｌｉｖ．）形成层３月中旬恢复活动，７月下旬形成层细胞停止分裂，同时停止产生新的韧皮部细胞，但直到８月中旬才停止产生新的木质部细胞。１２月新形成的未成熟韧皮部和木质部细胞都继续分化、成熟。形成层活动周期中，过氧化物酶同工酶的酶谱和酶活性在形成层区域和木质部区域中变化最大。ＰＯⅠ和ＰＯⅡ组同工酶只在春季形成层恢复活动时期存在。ＰＯⅢ的酶活性在夏季减弱，而冬季达到最高水平。酯酶同工酶的酶谱和酶活性亦随形成层的活动状态发生变化。负极端的ＥＳＴⅢ～Ⅴ组酯酶同工酶在生长季节消失，当形成层休眠时又重出现。ＥＳＴⅡ的酶活性最强并在各个时期均存在，它在维管组织的发育分化中可能起重要作用。

毛白杨枝条木质部细胞分化的动态变化及其与形成层活动的相互关系

应用定量解剖学和显微图像分析技术 ,得到了毛白杨枝条形成层细胞与其衍生木质部细胞解剖特征在形成层活动期内的变化情况 ,并探讨了两者之间的关系。采用X射线微密度测定技术 ,了解了同一生长轮内木材密度沿径向方向上的变异 ,讨论了其与木质部细胞解剖特征之间的关系。结果表明 ,形成层纺锤形细胞的径向和弦向宽度在活动期不同阶段差异不显著 ,而纤维长度、纤维宽度、壁腔比、微纤丝角、导管分布频率和胞壁率差异极显著 ;导管组织比量差异显著 ;导管分子长度、纤维比量和射线比量差异不显著。同一生长轮内木材密度的径向变异与活动期不同阶段形成的木质部细胞数量及其解剖特征直接相关。形成层带细胞层数与纤维长度、纤维长宽比和壁腔比呈极显著负相关 ,与纤维宽度呈显著正相关 ;形成层纺锤形细胞的径向宽度与纤维长度、纤维长宽比和射线比量呈显著负相关 ;形成层纺锤形细胞的弦向宽度与纤维宽度呈显著正相关。总体看来 ,在整个形成层活动期 ,形成层纺锤形细胞与木纤维的解剖特征之间随时间变化的相关性较好 。

构树形成层的活动周期及其淀粉贮量的变化

在构树（Ｂｒｏｕｓｓｏｎｅｔｉａ ｐａｐｙｒｉｆｅｒａ （Ｌ．） Ｖｅｎｔ．）形成层活动周期中，每年７月末以后，未成熟的木质部和韧皮部逐渐减少，成熟的木质部和韧皮部急剧增多。８月初开始分化晚材。进入９月后木质部的形成逐渐停止，而一个半月以后才停止形成韧皮部。淀粉贮量的消长与形成层的活动周期有很强的相关关系。早春形成层恢复活动后，淀粉贮量逐渐减少直至消失。尔后，形成层活动减慢，特别是木质部分化停止后，淀粉又开始积累。当韧皮部分化也停止后，淀粉又消失，直至翌年１月才重新积累。

形成层活动对机械伤害诱导巴西橡胶树次生乳管分化的影响

为了进一步优化机械伤害诱导次生乳管分化的实验系统,采用实验形态学的方法,分析了形成层的季节性活动、新梢和顶芽的发育状态以及伤害程度对机械伤害诱导巴西橡胶树萌条次生乳管分化的影响。结果表明,橡胶树萌条的形成层活动具有明显的休眠期和活动高峰期。在形成层活动的高峰期,小面积的机械伤害容易诱导淡绿期和稳定期萌条分化次生乳管,而且稳定期萌条次生乳管分化程度显著大于淡绿期萌条。但在形成层活动的休眠期,小面积的机械伤害不能诱导萌条的次生乳管分化。新梢和顶芽发育状态对机械伤害诱导次生乳管分化程度的影响都与形成层的季节性活动密切相关。大面积的机械伤害抑制次生乳管分化,可能与伤害部位的形成层细胞分裂活性受抑制有关。

美洲黑杨维管形成层活动周期性及细胞超微结构的动态变化

美洲黑杨维管形成层活动周期可分为休眠期、恢复活动期、活动期和转化期4个时期。休眠期维管形成层区约由3层细胞组成，细胞壁较厚，细胞内具有大量小液泡，其内包含一些电子密度较高的物质；细胞质内充满了游离的核糖核蛋白体，脂粒圆球形，散布在小液泡之间；内质网光滑型，多为短片状，只有近质膜处才呈网格状；线粒体内嵴不清晰，高尔基体数量较少，一般由3～5层扁平囊组成，周围未分泌形成高尔基小泡。恢复活动期维管形成层的细胞壁变薄，细胞内逐渐形成大液泡，内含物降解，细胞质的电子透明度增高。活动期维管形成层区细胞层数可达8～9层，细胞壁非常薄，细胞高度液泡化，细胞质和细胞核贴壁分布，或通过原生质索悬垂在细胞的某一位置，细胞器结构清晰，细胞质膜大量内折，与壁物质的形成有关。转化期维管形成层区细胞停止分裂，细胞壁逐渐增厚，液泡数日增多，体积减小，细胞开始积累淀粉、脂类和蛋白质等类物质。休眠期和活动期细胞超微结构特征相反，而恢复活动期与转化期细胞结构特征相似，互为可逆过程。

杜仲形成层活动周期中多糖贮量和淀粉酶同工酶的变化

杜仲(Eucommia ulmoides)枝条中的多糖颗粒经Ⅰ-KI溶液染色不显蓝黑色反应,偏光显微镜检查也不显示各向异性。髓、木质部、木射线和皮层薄壁细胞内多糖贮量的变化和形成层的活动周期有关:从5月下旬至12月中旬,逐步积累:从12月下旬至翌年4月中旬则逐步消失。韧皮部薄壁细胞中的多糖颗粒很少,而且没有季节性变化。淀粉酶同工酶酶谱在不同组织中不同,并随形成层的活动状态而变化,但与多糖颗粒的积累和消失无相关关系。

构树形成层的恢复活动及其过氧化物酶同工酶的变化

构树(Broussonetia papyrifera(L.)Vent.)虽属散孔材,但其形成层活动与大多数环孔材树种相似。从细胞形态看,4月5日仍处于休眠状态,4月15日芽虽未萌动,形成层带细胞却已呈活动状态,这时可看到两层左右新形成的未成熟木质部和未成熟韧皮部细胞。10天后芽逐步展开,新形成的木质部细胞达8-9层,韧皮部细胞达5层左右。4月26日前,未成熟的木质部细胞急剧增加,随即出现下降趋势;未成熟韧皮部细胞则一直到5月20日都持续缓慢地增加。木质部细胞分化成熟所需时间大约是韧皮部细胞的一半。构树休眠期形成层区域和韧皮部中的过氧化物酶同工酶的酶带最多,3月25日形成层细胞在形态上仍处于休眠状态时,形成层区域的过氧化物同工酶的Ⅱ组和Ⅲ组酶带中已各有一条酶带消失,随后其它组织中也发生一些变化,这些变化与体内IAA的水平及组织分化状态密切相关。

构树形成层活动中内源IAA的变化及其结合蛋白的研究

构树(Broussonetiapapyrifera(L.)Vent.)形成层活动周期中用酶联免疫吸附法测定了形成层区域的内源IAA浓度的变化,并用自行发展的免疫荧光检测方法测定了由此处生活细胞制得的原生质体中IAA结合蛋白的分布。结果表明,形成层旺盛形成未成熟木质部和未成熟韧皮部时期,内源IAA急剧增加,当这些细胞分化成熟时IAA浓度降低,并维持在一定范围内。IAA结合蛋白主要分布于质膜、胞质。