微生物次级代谢产物多样性发掘方法

微生物次级代谢产物是微生物在生长过程中产生的非必需性代谢产物,其往往具有独特的生物活性。随着对微生物次级代谢产物多样性研究的不断深入开展,研究者逐渐发现在实验室的常规培养条件下微生物的代谢潜能不能完全被激发,从中可获得的天然产物结构类型远远少于其代谢潜能所决定的数量。近年来,随着基因组技术、分子生物学技术特别是合成生物学相关技术的发展,研究人员开发了如OSMAC、表观遗传、异源表达等多种方法,从多个角度多层次地发掘次级代谢产物多样性。这些方法有效激活潜在的生物合成基因簇、提高了微生物次级代谢产物多样性,加之与高通量筛选方法联合应用,能够显著改善了微生物活性天然产物的发现效率。本文综述了微生物次级代谢潜能的激活以及代谢产物高效筛选的方法和技术,为提高微生物次级代谢产物多样性发掘,加快先导化合物的发现提供参考。

基于病毒诱导的基因沉默(VIGS)方法的LsRGL1基因在生菜中的功能分析

为了确定LsRGL1基因对生菜抽薹的影响,以S39生菜品种为试验材料,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从S39生菜品种中克隆得到LsRGL1基因;采用病毒诱导基因沉默(VIGS)方法,利用烟草脆裂病毒(TRV)载体对目的基因进行沉默;采用表型观察、石蜡切片、实时荧光定量PCR(qPCR)方法、酶联免疫吸附法(ELISA)分别研究空白对照组(无TRV载体)、阴性对照组(按质量比1∶1同时注射TRV1空载体和TRV2空载体)和试验组(按质量比1∶1同时注射TRV1空载体和TRV2-LsRGL1重组载体)中植株表型、花芽分化、LsRGL1基因的相对表达量和内源激素质量分数的变化。结果表明:病毒侵染后,试验组植株的茎长相对于空白对照组和阴性对照组的茎长明显增大,且试验组各项表型数据均大于2个对照组的表型数据,而空白对照组与阴性对照组各项表型数据之间并未出现明显差异;石蜡切片结果表明试验组植株已经开始花芽分化,相较于对照组提前进入生殖生长时期;qPCR分析结果显示,试验组中LsRGL1基因的相对表达量相较于空白组和阴性对照组的显著下调,且下调幅度均超过50%。试验组中内源激素赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)、生长素(IAA)的含量显著高于对照组的含量,而茉莉酸(JA)含量显著下降。综上可知,沉默LsRGL1基因加快了生菜的抽薹。

菲律宾蛤仔脂多糖诱导的肿瘤坏死因子α VpLITAF基因克隆及其对微生物侵染的应答研究

脂多糖诱导的肿瘤坏死因子α(LITAF)是一种重要的转录因子,在调节LPS诱导炎症因子TNF-α的表达过程中发挥重要作用。采用表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)结合cDNA末端快速克隆技术(rapid amplification of cDNA Ends,RACE),获得了菲律宾蛤仔LITAF基因cDNA全长(VpLITAF),并利用实时荧光定量PCR技术研究VpLITAF的组织分布以及鳗弧菌、藤黄微球菌刺激下的时序表达特征。VpLITAF基因序列包含393bp的开放阅读框,编码130个氨基酸,预测分子量为14.39kD,理论等电点7.47。序列分析表明,VpLITAF具有高度保守的LITAF结构域,与其它贝类LITAF具有高度同源性,并在系统进化树中与海洋软体动物LITAF聚为一簇。VpLITAF基因主要表达于蛤仔肝胰腺,肌肉中的表达量则相对较低。鳗弧菌和藤黄微球菌刺激在某些时段可显著诱导VpLITAF基因的表达水平,最高可达对照组表达量的3.5倍,且鳗弧菌对VpLITAF基因表达的诱导作用明显强于藤黄微球菌。以上结果表明,VpLITAF在菲律宾蛤仔的固有免疫反应中发挥着重要作用。

家蚕组织蛋白酶L及其特异性抑制剂基因参与微生物诱导蚕体的免疫响应研究

给家蚕5龄第3天幼虫分别注射藤黄微球菌(革兰阳性菌)和球孢白僵菌(真菌)进行诱导处理,利用已登录的家蚕组织蛋白酶L基因Bm Cts L(Gen Bank登录号:S77508.1)和Bm Cts L特异性抑制剂基因Bm Cts LI(Gen Bank登录号:AJ131752)的全长序列设计引物,实时荧光定量PCR检测微生物入侵后家蚕组织中Bm Cts L和Bm Cts LI基因的时空表达变化及协同反应,分析Bm Cts L酶活性变化与家蚕对微生物入侵免疫响应的相关性。家蚕的血细胞与脂肪体是微生物入侵后Bm Cts L和Bm CtsLI基因出现表达变化的主要组织,其中经藤黄微球菌诱导后,血细胞中的Bm Cts L基因响应最快,且基因mRNA转录水平极显著上调,脂肪体中的Bm Cts LI基因mRNA转录水平也极显著上调。微生物入侵后蚕体组织中Bm Cts L与Bm Cts LI基因的表达变化存在时间差异,其中Bm Cts L基因先于Bm Cts LI基因上调表达,推测Bm Cts LI基因通过对微生物入侵的协同反应调控BmCts L酶活性变化。藤黄微球菌比球孢白僵菌能更快诱导Bm Cts L和Bm Cts LI基因的表达变化;2种微生物诱导下蚕体血细胞中的Bm Cts L酶活性不仅上升快,而且明显高于其他组织。上述结果提示Bm Cts L和Bm Cts LI可能与家蚕的先天免疫相关,并且佐证了家蚕的血细胞在微生物入侵后能比其他组织更快速地产生免疫响应。

微生物沉默基因簇激活方法的研究进展

微生物丰富多样的次级代谢产物一直都是天然药物的重要来源。随着微生物基因组学研究的深入,人们发现在现有的培养条件下很多生物合成基因簇未能表达,从而无法生成相应的代谢产物。这些处于沉默状态的基因簇给新型药物的开发带来了新的契机。本文综述了激活这些沉默基因簇的三种主要方法:调控基因改造、强启动子引入及小分子物质添加。激活微生物中沉默基因簇将有望得到结构新颖、活性显著的新活性分子。

病毒诱导的基因沉默的发展及在植物生物逆境上的应用

病毒诱导的基因沉默(Virus-indcued gene silencing,VIGS)技术是指带一段包基因序列的重组病毒侵染植物,引起植物同源基因沉默与表型变异,进而通过表型变异进行基因功能分析的方法,是近年发展起来的植物基因功能研究的新技术。为了进一步探讨VIGS应用策略,笔者归纳了VIGS的分子机理、VIGS的载体开发和VIGS技术在植物生物逆境方面的研究应用3个方面近些年的研究进展,得出了VIGS在植物生物逆境方面的问题及应用价值。

VIGS诱导GS同工酶基因沉默对烤烟氮代谢的影响

【背景和目的】谷氨酰胺合成酶(GS)是烤烟氮代谢的关键酶,为探究沉默GS同工酶基因对烤烟氮代谢的影响。【方法】采用病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术构建GS同工酶基因(NtGS1、NtGS2)瞬时沉默表达载体,测定了烤烟品种中烟100叶片经VIGS处理10 d,20 d和30 d的NtGS1-1、NtGS1-2、NtGS2相对基因表达量和谷氨酰胺合成酶(GS)、硝酸还原酶(NR)活性以及叶片可溶性蛋白、总氮、烟碱含量和烟株生物量。【结果】沉默NtGS1基因的处理对NtGS1-1沉默效率最高为50.4%,对NtGS1-2沉默效率最高为56%,沉默NtGS1和NtGS2基因的处理对NtGS2沉默效率最高为54.9%;沉默NtGS1和NtGS2的烟株叶片重、GS、NR活性、可溶性蛋白、总氮、烟碱含量都显著低于对照。【结论】本研究建立的VIGS体系有效下调了GS同工酶基因的表达,同时沉默NtGS1和NtGS2(TRV::GS1::GS2)可抑制叶片氮素同化利用,降低氮代谢关键酶活性与含氮化合物含量。

病毒诱导基因沉默技术引入普通生物学实验教学实践

普通生物学实验具有实践性强和操作性强等特点,在大学生物类专业人才培养中占有显著地位。为了能在实验教学中充分锻炼和培养学生的实验操作技能、创新能力和意识,提高教学质量,将当前生物学研究前沿技术--病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术引入普通生物学实验教学中。通过实验教学,明显提高了学生的兴趣,培养了学生独立工作能力和创新思维能力,使学生初步具备一定的科研能力和创新能力。

TRV病毒诱导大豆基因沉默体系优化及应用

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术已广泛用于植物基因功能研究,以烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)为载体的沉默体系介导大豆基因沉默效率有待明确,采用无缝克隆技术构建TRV-VIGS沉默体系,探索不同接种方法对大豆靶基因在不同组织间的沉默效率,为大豆基因功能研究提供依据。以八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase,GmPDS)及泛素连接酶(GmATL3)基因为靶基因,将含有pTRV1和重组载体菌液采用注射、灌根(agroinoculation)、注射与灌根相结合3种方法分别接种大豆中黄13,接种28 d观察沉默表型现象,并使用RT-qPCR技术检测根部与叶部基因相对表达量,明确不同方法沉默效果。注射接种的大豆叶边缘及叶内出现黄化褪绿,灌根接种与注射加灌根接种的叶片表面出现褪绿斑点及褶皱褪绿表型。RT-qPCR结果表明,3种接种方法对沉默GmPDS效果接近100%;注射接种对GmATL3的沉默效率在叶部为80%-95%,根部为40%-60%;灌根与注射加灌根接种,根部沉默效率为70%-90%,叶部沉默效率为15%-50%。不同接种方法产生不同程度沉默表型,且对不同内源基因沉默效率不同。接种方法对不同组织沉默效率存在差异,注射方法对叶片沉默效率最高,注射加灌根结合的方法对根部沉默效率最高。

油棕病毒诱导的基因沉默体系的建立及优化

为开展油棕油脂代谢调控相关基因鉴定研究,以油棕八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturase gene,PDS)作为报告基因,探索以病毒载体TRV为载体在油棕胚状体上应用病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)的可能性,并对油棕胚状体VIGS体系的相关参数进行优化。结果显示:以EHA105为菌种、侵染菌液OD_(600)=0.5、侵染时间5 min、乙酰丁香酮(AS)质量浓度20 mg/L、共培养48 h、侵染后培养时间为12 d能取得最佳的基因沉默效果。在此基础上,利用优化后的VIGS体系对油棕二酰甘油酰基转移酶基因(diacylglycerol acyltransferase gene,DGAT)进行沉默,取得了预期的基因沉默效果。

辣椒CaDXS和CaPDS基因沉默的表型比较

【目的】沉默辣椒CaDXS和CaPDS基因,比较分析两者白化表型的差异,寻找新的辣椒沉默标记基因。【方法】利用双酶切克隆技术构建CaDXS和CaPDS基因的沉默载体;通过农杆菌介导转化侵染辣椒,观察辣椒的沉默表型;采用实时荧光定量PCR技术检测CaDXS和CaPDS基因的沉默效率。【结果】农杆菌浸润21 d后,沉默CaDXS基因的辣椒叶片出现褪绿症状,沉默CaPDS基因的辣椒叶片出现白化。农杆菌浸润30 d后,沉默CaDXS基因的辣椒叶片出现较为明显的白化;沉默CaPDS基因的辣椒叶片白化程度加剧,新叶近乎白化。与CaDXS基因相比,沉默CaPDS基因导致的辣椒白化表型更明显和高效。沉默组辣椒叶片中CaDXS和CaPDS基因的表达量均显著降低(P<0.05),沉默效率分别为86.80%和93.08%,表明辣椒CaDXS和CaPDS基因被成功沉默。【结论】CaDXS基因可以作为辣椒的沉默标记基因,但沉默CaPDS基因的辣椒白化表型出现更早且明显,因此,CaPDS基因比CaDXS基因更适合作为辣椒沉默标记基因。

番茄SlERF-H6基因VIGS沉默载体构建

番茄(Solanum lycopersicum)具有较高的营养价值,深受消费者的喜爱,目前番茄已经成为广泛种植的经济作物之一。乙烯响应因子(ethylene response factor,ERF)是一类植物特有的转录因子。ERF在植物形态发生、逆境响应、成熟衰老、激素信号转导和代谢物调节等多种生理过程中起重要的调节作用。文章以番茄的SlERF-H6(LOC101259323)基因为研究对象,通过对SlERF-H6的基因序列进行分析,获得该基因的特异性区域沉默序列。利用同源重组技术成功构建了番茄SlERF-H6病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)载体。为进一步探究番茄SlERF-H6基因在果实成熟中的作用提供参考。

低氧诱导因子-2α基因沉默对骨肉瘤细胞株MG-63生物学行为的影响

目的：探讨低氧诱导因子-2α（HIF-2α）基因沉默对低氧状态下骨肉瘤MG-63细胞的影响。方法Western Blot检测MG-63细胞HIF-2α表达。利用小干扰RNA（siRNA）获得MG-63/siHIF-2α（siHIF-2α）细胞，阴性对照为MG-63/scramble（NC）细胞。Western Blot检测MG-63、NC和siHIF-2α细胞中HIF-2α、血管内皮生长因子（VEGF）、p-Erk/Erk及Mcl-1的表达。低氧下培养NC和siHIF-2α细胞，MTS试剂检测细胞活性，划痕迁移试验检测迁移能力，克隆集落形成试验检测集落形成率，裸鼠皮下移植瘤试验检测体内肿瘤生长情况。结果低氧可诱导MG-63细胞的HIF-2α蛋白表达，并呈时间依赖性（F=2037.412，P＜0.001）。低氧下siHIF-2α细胞的HIF-2α表达低于NC细胞（P＜0.01）。低氧12 h和24 h，siHIF-2α组细胞活性均低于NC组，相对划痕宽度均大于NC组（P＜0.05或P＜0.01）。1000～5000细胞种植数的siHIF-2α组的集落形成率均小于NC组（P＜0.05或P＜0.01）。低氧下siHIF-2α细胞的VEGF、p-Erk/Erk和Mcl-1表达均低于NC细胞（P＜0.01）。裸鼠皮下移植瘤siHIF-2α组肿瘤体积、质量和密度均小于NC组（P＜0.01）。结论阻断HIF-2α信号通路可作为骨肉瘤临床治疗的新策略。

OSMAC策略在微生物次级代谢产物研究中的应用

目的对单菌多次级代谢产物(One strain many compounds,OSMAC)策略在微生物次级代谢产物研究中的应用进展进行综述。方法查阅近年来的相关文献,对微生物次级代谢产物研究中所应用的OSMAC策略进行分类和归纳总结。结果近年来所应用的OSMAC策略主要包括改变培养基、改变培养条件或培养状态、混合培养、化学表观遗传修饰、添加酶抑制剂或其他物质等。结论OSMAC策略在激活微生物沉默基因、增加次级代谢产物多样性方面发挥了重要作用,随着现代科学技术的发展,OSMAC策略与新技术结合必然会成为发现新药和先导化合物的一条重要途径。

植物RNA沉默抗病机制与应用研究进展

RNA沉默是真核生物基因表达调控的保守机制,在植物生长发育以及响应生物和非生物胁迫过程中发挥着非常重要的作用。跨界RNA沉默与种间RNA沉默为开发基于RNA沉默的作物病害防控体系提供了理论基础。本文概括了植物RNA沉默保守途径,归纳了RNA沉默在植物-病原互作研究中的代表性研究,阐述了基于RNA沉默开发的宿主诱导基因沉默、喷施诱导基因沉默和微生物诱导基因沉默技术的原理,以及应用研究现状,以期为开发基于RNA沉默的新型作物病害防控技术提供参考。

病毒诱导的基因沉默

病毒诱导的基因沉默"(virus-induced gene silencing,VIGS)一词最早用于描述被病毒侵染的植物的恢复"现象,是一种植物抗病毒侵染的自然机制,现在已被开发成通过插入目的基因片段的重组病毒抑制植物内源基因表达的遗传技术,用于基因功能分析.VIGS由小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)驱动,siRNA单链与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC)结合后,特异性地和与siRNA同源的靶标RNA结合,并降解RNA模板.已有源于15种不同类型病毒的VIGS载体得到开发和应用.在VIGS载体中插入的目的片段、重组VIGS病毒载体的植物导入方法、沉默处理时的寄主生育期、沉默处理后的植物培育条件等均显著影响VIGS的效率.作为一种新型的基因鉴定和功能研究技术工具,VIGS具有无需事先知道目的基因全长序列、获取表型迅速、无需构建转基因植株等诸多优点,已越来越广泛地被应用于植物基因功能研究.

病毒诱导的基因沉默及其在植物基因功能研究中的应用

RNA介导的基因沉默是近年来在生物体中发现的一种基于核酸水平高度保守的特异性降解机制 .病毒诱导的基因沉默 (virusinducedgenesilencing ,VIGS)是指携带植物功能基因cDNA的病毒在侵染植物体后 ,可诱导植物发生基因沉默而出现表型突变 ,进而可以研究该目的基因功能 .至今 ,已经建立了以RNA病毒、DNA病毒、卫星病毒和DNA卫星分子为载体的VIGS体系 ,这些病毒载体能在多种寄主植物 (包括拟南芥、番茄和大麦 )上有效抑制功能基因的表达 .VIGS已开始应用于N基因和Pto基因介导的抗性信号途径中关键基因的功能研究、抗病毒相关的寄主因子研究以及植物代谢和发育调控研究 .在当前植物基因组或EST序列大量测定的情况下 。

植物中病毒诱导基因沉默的研究进展

研究表明TGS往往与目的基因启动子的甲基化密切相关,RNA沉默则由目的基因的 mRNA特异性降解引起。植物体中诱导RNA沉默的外部因素有转基因和病毒。与传统的转基因 技术相比,病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing VIGS)是一种瞬时表达体系,能在较 短的时间里取得良好的效果,目前被广泛地用来研究植物基因的功能。就VIGS的研究进展做一 个比较全面的综述。阐述了DNA和RNA病毒诱导植物基因沉默的机理,同时讨论了利用病毒诱 导的基因沉默(VIGS)鉴定植物基因功能的优缺点和将来的发展趋势。

植物基因功能鉴定新工具——病毒诱导基因沉默技术的研究进展

病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术是指带一段靶基因序列的VIGS重组病毒侵染植物、引起植物同源基因沉默与表型变异,进而通过表型变异进行基因功能分析的方法,是近年发展起来的从反向遗传学方向快速鉴定植物基因功能的技术,是转录后基因沉默机制的一种表现。①VIGS的分子机制,涉及基因沉默的起始、维持和信号放大、传播共3个阶段;②VIGS技术、载体与方法学的发展;③VIGS作为基因功能研究的优越性,如不必进行转基因、操作方法简便、获得结果快速等;④应用VIGS对植物抗病途径、代谢与发育调控中参与基因功能进行研究的概况。同时,展望了VIGS技术作为植物功能基因组学功能分析的高通量技术平台的美好前景。

病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术及其在大豆基因功能研究和育种中的应用潜力

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是植物体抵抗病毒侵染的一种自然防御机制,近年来已发展成为一种基因功能研究的有效手段。与突变体筛选、转基因、基因敲除等技术相比,VIGS技术因具有周期短、成本低、可迅速观察表型等优点而被广泛应用于基因的功能鉴定。文章对VIGS技术的分子机理、病毒载体系统、稳定遗传VIGS植株的获得策略及其在大豆中的应用等内容进行了综述并对今后的发展趋势进行了讨论。