微RNA-196a-1-3p靶向Ras响应元件结合蛋白调控胆管癌细胞增殖的机制研究

目的探讨转化生长因子β(TGF-β)调控人胆管癌细胞系RBE细胞增殖的关键微RNA(miRNA)及其潜在的机制。方法该研究起止时间为2020年1月至2022年1月。磷酸盐缓冲液(PBS)处理为对照组,TGF-β处理为TGF-β组,TGF-β抗体处理为抗体组。检测三组RBE细胞的增殖水平。miRNA高通量测序检测三组RBE细胞的miRNA调控变化,并进行miRNA模拟物过表达筛选鉴定受TGF-β调控的影响RBE细胞增殖水平的关键miRNA。miRNA数据库(miRDB)在线分析miRNA的潜在底物,并通过小干扰RNA(siRNA)敲低筛选鉴定影响RBE细胞增殖水平的关键底物。结果相比于对照组,TGF-β组RBE细胞的增殖水平上升(1.62±0.07比2.35±0.09,P<0.05),抗体组RBE细胞的增殖水平下降(1.62±0.07比1.11±0.08,P<0.05)。过表达微RNA-196a-1-3p(miR-196a-1-3p)时,RBE细胞的增殖水平下降(P<0.05)。敲低Ras响应元件结合蛋白(RREB1)时,RBE细胞的增殖水平下降(P<0.05)。过表达miR-196a-1-3p后,RBE细胞中RREB1的信使RNA(mRNA)和蛋白水平下降(P<0.05)。敲低miR-196a-1-3p后,RBE细胞中RREB1与SMAD家族蛋白3(SMAD3)的相互作用增加。敲低SMAD3后,RBE细胞的增殖水平下降(P<0.05)。与仅敲低SMAD3相比,敲低SMAD3的同时过表达RREB1的RBE细胞的增殖水平无显著变化,并且同时敲低SMAD3和miR-196a-1-3p的RBE细胞的增殖水平无显著变化。结论TGF-β能够通过miR-196a-1-3p/RREB1/SMAD3轴促进RBE细胞增殖;miR-196a-1-3p和RREB1可作为潜在的治疗胆管癌的靶标,为针对该靶标的新药研发奠定了基础。

微小RNA-148a-3p靶向核心1β13-半乳糖基转移酶1增强肺腺癌细胞的放疗敏感性的研究

目的探讨微小RNA-148a-3p(miR-148a-3p)在肺腺癌中的表达及临床意义,分析miR-148a-3p靶向蛋白核心1β13-半乳糖基转移酶1(C1GALT1)对肺腺癌细胞放疗敏感性的影响及机制。方法选取肺腺癌组织芯片中76例患者肿瘤组织及肺腺癌A549细胞株为研究对象。对组织芯片分别进行miR-148a-3p原位杂交(ISH)染色和C1GALT1免疫组织化学染色,分析76例肺腺癌患者肿瘤组织中miR-148a-3p的表达与临床病理、预后及C1GALT1表达的关系。采用细胞转染技术对A549细胞进行miR-148a-3p过表达质粒的转染;转染细胞接受2 Gy放疗后采用克隆形成实验检测细胞的放疗敏感性;采用蛋白质印迹法检测细胞C1GALT1蛋白表达水平;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-148a-3p与C1GALT1的靶向调控关系;采用共转染技术分析miR-148a-3p调控A549细胞放疗敏感性的机制。结果76例肺腺癌组织中低表达miR-148a-3p与患者淋巴结转移显著相关(P=0.012);miR-148a-3p高表达者预后显著优于miR-148a-3p低表达者(P=0.005);肺腺癌组织中miR-148a-3p与C1GALT1的表达呈显著负相关(P=0.023)。多因素分析显示,miR-148a-3p低表达、T分期及淋巴结转移是预后的独立危险因素。克隆形成实验显示,过表达miR-148a-3p组克隆形成数显著低于对照组(P<0.001);Western Blot结果显示,miR-148a-3p过表达可以显著下调细胞中C1GALT1蛋白水平(P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验显示miR-148a-3p通过结合C1GALT1的3′UTR来调控C1GALT1的表达。功能拯救试验显示C1GALT1能够部分抵消miR-148a-3p的放疗增敏效应。结论肺腺癌中miR-148a-3p低表达与淋巴结转移、C1GALT1高表达及预后不良显著相关,miR-148a-3p通过负调控C1GALT1的表达增强肺腺癌细胞的放疗敏感性。

长链非编码RNA DNAJC3-AS1、微RNA-214-3p在结肠癌组织、结肠腺瘤性息肉中的表达水平及临床意义

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)DNAJC3-AS1、微RNA-214-3p(miR-214-3p)在结肠癌组织、结肠腺瘤性息肉中的表达水平及临床意义。方法 lnCAR数据库检索结肠癌组织、正常结肠组织中LncRNA DNAJC3-AS1表达情况;选取2016年5月至2019年1月北京市丰台中西医结合医院收治的86例结肠癌病人、53例结肠腺瘤性息肉病人为研究对象,收集结肠癌病人的结肠癌组织、对应癌旁组织及结肠腺瘤性息肉病人的结肠腺瘤性息肉,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法测定组织中lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p表达水平;分析结肠癌组织lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p表达水平与结肠癌病人临床病理特征、预后关系;分析结肠癌组织中lncRNA DNAJC3-AS1表达水平与miR-214-3p相关性,生物信息学预测lncRNA DNAJC3-AS1与miR-214-3p的关系。结果 lnCAR数据库分析显示,结肠癌组织lncRNA DNAJC3-AS1表达水平(4.40±0.49)高于正常结肠组织(4.00±0.36)(P<0.05)。qRT-PCR检测显示,与结肠腺瘤性息肉(1.71±0.57、0.67±0.22)相比,结肠癌组织lncRNA DNAJC3-AS1表达水平(2.63±0.88)升高(P<0.05),miR-214-3p表达水平(0.31±0.10)降低(P<0.05);与癌旁组织(1.04±0.35、1.01±0.34)相比,结肠癌组织lncRNA DNAJC3-AS1表达水平升高(P<0.05),miR-214-3p表达水平降低(P<0.05)。结肠癌组织lncRNA DNAJC3-AS1、miR-214-3p表达水平在不同分化程度、淋巴结转移、血管浸润、TNM分期方面,分布差异有统计学意义(P<0.05);结肠癌组织中lncRNA DNAJC3-AS1表达水平与miR-214-3p呈负相关(r=-0.58,P<0.05),且lncRNA DNAJC3-AS1与miR-214-3p存在结合位点;lncRNA DNAJC3-AS1高表达组29.75个月、miR-214-3p低表达组30.16个月结肠癌病人累积生存率低于lncRNA DNAJC3-AS1低表达组34.69个月、miR-214-3p高表达组34.37个月(P<0.05)。结论 癌旁组织、结肠腺瘤性息肉、结肠癌组织中lncRNA DNAJC3-AS1表达依次升高,miR-214-3p表达依次降低,且结肠癌组织中lncRNA DNAJC3-AS1表达水平与miR-214-3p、临床病理特征、预后有关。

长链非编码RNA OPA相互作用蛋白5反向转录序列1靶向调控微RNA-128-3p对结直肠癌细胞增殖、侵袭和转移的影响

目的探究长链非编码RNA OPA相互作用蛋白5反向转录序列1(lncRNA OIP5-AS1)在结直肠癌中的表达情况及靶向调控微RNA-128-3p(miR-128-3p)对结直肠癌细胞增殖、侵袭和转移的影响。方法采用实时荧光定量PCR(qPCR)定量分析2017年1月至2018年12月在郑州大学人民医院住院并进行手术治疗的38例结直肠癌病人癌组织及相应癌旁组织、结直肠癌细胞系(SW480、SW620、HT-29和LoVo)及人正常结直肠黏膜细胞FHC中lncRNA OIP5-AS1和miR-128-3p的表达。将SW620细胞设为si-OIP5-AS1组、si-NC组、miR-128-3p mimic组、mimic-NC组、miR-128-3p inhibitor+si-OIP5-AS1组和inhibitor-NC+siOIP5-AS1组,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)实验和克隆形成实验检测细胞增殖能力,采用划痕实验和transwell实验检测细胞侵袭与迁移能力,采用蛋白质印迹法检测E2F1、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、波形蛋白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白表达,采用双萤光素酶报告实验验证lncRNA OIP5-AS1与miR-128-3p的靶向关系。结果与癌旁组织相比较,lncRNA OIP5-AS1在结直肠癌组织中表达显著升高(1.42±0.40比0.98±0.29,P<0.05),miR-128-3p表达显著降低(0.72±0.21比1.52±0.39,P<0.05),且两者在结直肠癌组织中的表达呈负相关;与FHC细胞(1.05±0.10)相比较,lncRNA OIP5-AS1在结直肠癌细胞株[SW480(1.60±0.25)、SW620(2.19±0.33)、HT-29(1.62±0.23)和LoVo(1.95±0.20)]中的表达显著增高(均P<0.05),miR-128-3p表达(0.70±0.15、0.46±0.03、0.59±0.14、0.74±0.09比1.02±0.11)显著降低(均P<0.05)。lncRNA OIP5-AS1与miR-128-3p为相互作用靶基因,lncRNA OIP5-AS1表达下调或miR-128-3p表达上调均能降低vimentin、N-cadherin、E2F1和cyclin D1蛋白表达,增高E-cadherin蛋白表达,抑制SW620细胞的增殖、侵袭和迁移。在转染si-OIP5-AS1的同时转染miR-128-3p inhibitor可增加vimentin、N-cadherin、E2F1和cyclin D1蛋白表达,降低E-cadherin蛋白的表达,逆转lncRNA OIP5-AS1表达下调对SW620细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用。结论lncRNA OIP5-AS1在结直肠癌中高表达,并靶向调控miR-128-3p参与结直肠癌的增殖、侵袭和迁移过程,lncRNA OIP5-AS1和miR-128-3p能为结直肠癌的诊断和靶向治疗提供潜在的应用价值。

微RNA-133a-3p靶向调控转化生长因子-β1/Smad3对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨微RNA(miR)-133a-3p靶向调控转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))/Smad3对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法选择2020年2月至2021年2月焦作市人民医院皮肤科收治的瘢痕疙瘩患者29例为研究对象,手术切取瘢痕疙瘩组织及其周围正常皮肤组织,分离培养瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)和正常皮肤组织成纤维细胞(NF)。取对数生长期KF细胞,随机分为空白对照组、miR-阴性对照(NC)组、miR-133a-3p组、miR-133a-3p+pcDNA3.1组、miR-133a-3p+pcDNA3.1-TGF-β_(1)组;空白对照组细胞不做任何转染,miR-NC组细胞转染miR-NC,miR-133a-3p组细胞转染miR-133a-3p mimic,miR-133a-3p+pcDNA3.1组细胞共转染miR-133a-3p mimic和pcDNA3.1,miR-133a-3p+pcDNA3.1-TGF-β_(1)组细胞共转染miR-133a-3p mimic和pcDNA3.1-TGF-β_(1)。实时荧光定量聚合酶链反应法检测组织和细胞中miR-133a-3p和Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(collagen Ⅲ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA的表达,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况。应用TargetScan数据库通过生物信息分析预测miR-133a-3p与TGF-β_(1)的3′非翻译区(3′-UTR)存在结合位点,构建含有预测结合位点的野生型(Wt)和突变型(Mt)TGF-β_(1)3′-UTR片段的荧光素酶报告基因载体,分别将用脂质体2000包裹的Wt TGF-β_(1)或Mt TGF-β_(1)报告基因载体与miR-133a-3p mimics或miR-NC共转染入KF细胞,将转染后的细胞设为miR-NC+Wt TGF-β_(1)组、miR-133a-3p+Wt TGF-β_(1)组、miR-NC+Mt TGF-β_(1)组、miR-133a-3p+Mt TGF-β_(1)组,双荧光素酶检测试剂盒检测4组细胞双荧光素酶活性。Western blot检测空白对照组、miR-NC组、miR-133a-3p组KF细胞中TGF-β_(1)、Smad3蛋白的相对表达量。结果瘢痕疙瘩组织中miR-133a-3p相对表达量显著低于正常皮肤组织(t=18.988,P<0.05)。KF细胞中miR-133a-3p相对表达量显著低于NF细胞(t=18.679,P<0.05)。miR-133a-3p组细胞中miR-133a-3p相对表达量显著高于空白对照组和miR-NC组,CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA mRNA相对表达量显著低于空白对照组和miR-NC组(P<0.05);空白对照组与miR-NC组细胞中miR-133a-3p和CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-133a-3p组细胞凋亡率显著高于空白对照组和miR-NC组,细胞增殖活力显著低于空白对照组和miR-NC组(t=13.912、14.227、-8.020、-6.947,P<0.05);空白对照组与miR-NC组细胞凋亡率、细胞增殖活力比较差异无统计学意义(t=-0.607、0.448,P>0.05)。miR-133a-3p+Wt TGF-β_(1)组细胞相对荧光素酶活性显著低于miR-NC+Wt TGF-β_(1)组、miR-NC+Mt TGF-β_(1)组、miR-133a-3p+Mt TGF-β_(1)组(t=-15.729、-19.490、-16.186,P<0.05)。miR-NC+Wt TGF-β_(1)组、miR-NC+Mt TGF-β_(1)组、miR-133a-3p+Mt TGF-β_(1)组细胞相对荧光素酶活性两两比较差异均无统计学意义(t=-0.596、0.847、0.842,P>0.05)。KF细胞中Smad3和TGF-β_(1)蛋白相对表达量显著高于NF细胞(t=5.758、9.027,P<0.05)。miR-133a-3p组细胞中Smad3和TGF-β_(1)蛋白相对表达量显著高于miR-NC组(t=-4.913、-8.314,P<0.05)。miR-133a-3p+pcDNA3.1-TGF-β_(1)组细胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA相对表达量和细胞增殖活力显著高于miR-133a-3p组和miR-133a-3p+pcDNA3.1组,细胞凋亡率显著低于miR-133a-3p转染组和miR-133a-3p+pcDNA3.1组(P<0.05)。miR-133a-3p组与miR-133a-3p+pcDNA3.1组细胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA相对表达量及细胞凋亡率和细胞增殖活力比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论过表达miR-133a-3p可通过负调控TGF-β_(1)抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖,促进细胞凋亡,提示miR-133a-3p/TGF-β_(1)通路可能是瘢痕疙瘩治疗的一个新的靶点。

微RNA-342-3p/末端尿苷酰转移酶1/凝血酶敏感素-2通路在胰腺导管腺癌中的作用及机制

目的探讨微RNA(miR)-342-3p/末端尿苷酰转移酶1(TUT1)/凝血酶敏感素-2(THBS2)通路在胰腺导管腺癌中的作用及miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA表达与患者临床病理学参数的关系。方法选择2008年5月至2021年3月在遂宁市中心医院行根治性手术切除的胰腺导管腺癌标本(n=80)和对应癌旁正常组织标本(n=20)为研究对象。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测胰腺导管腺癌组织和癌旁正常组织中miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA的表达。将对数生长期人胰腺导管腺癌细胞株PANC-1细胞分为对照组(转染miR-NC)、miR-342-3p过表达组(转染miR-342-3p mimic)、miR-342-3p抑制剂组(转染miR-342-3p inhibitor)、Vector组(转染pCS4-HA vectors)、TUT1组(转染pcDNA3-Flag-TUT1)、阴性对照组(转染sh-NC慢病毒载体)、TUT1沉默组(转染pGCshL-TUT1载体)、miR-342-3p过表达+TUT1组(同时转染miR-342-3p mimic和TUT1)、miR-342-3p过表达+THBS2组(同时转染miR-342-3p mimic和THBS2)、TUT1+THBS2组(同时转染pcDNA3-Flag-TUT1和THBS2)。采用细胞计数试剂盒-8检测10组细胞的增殖能力,采用流式细胞术检测10组细胞的凋亡情况,采用双荧光素酶报告系统检测miR-342-3p与TUT1的靶向关系,采用Western blot法检测对照组、miR-342-3p过表达组和miR-342-3p抑制剂组PANC-1细胞中TUT1、THBS2蛋白的表达。结果胰腺导管腺癌组织中miR-342-3p TUT1、THBS2 mRNA的相对表达量显著低于癌旁正常组织(P<0.05)。不同年龄、不同肿瘤大小、淋巴结是否转移和不同肿瘤分期患者癌组织中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表达比较差异均无统计学意义(P>0.05);高分化癌组织中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表达显著高于中+低分化癌组织(P<0.05)。培养0 h时,各组PANC-1细胞的增殖能力比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养24、48、72 h时,TUT1组细胞的增殖能力均显著低于Vecort组,细胞的凋亡率显著高于Vecort组(P<0.05)。培养24、48、72 h时,TUT1沉默组细胞的增殖能力显著高于阴性对照组,细胞凋亡率显著低于阴性对照组(P<0.05)。培养24、48、72 h时,miR-342-3p抑制剂组的细胞增殖能力显著高于对照组(P<0.05),miR-342-3p过表达组的细胞增殖能力显著低于对照组(P<0.05)。培养24 h时,miR-342-3p过表达+TUT1组、miR-342-3p过表达+THBS2组、TUT1+THBS2组与miR-342-3p过表达组的细胞增殖能力比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养48、72 h时,miR-342-3p过表达+TUT1组、miR-342-3p过表达+THBS2组、TUT1+THBS2组的细胞增殖能力均显著低于miR-342-3p过表达组(P<0.05)。miR-342-3p抑制剂组细胞的凋亡率显著低于对照组(P<0.05),miR-342-3p过表达组细胞的凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。miR-342-3p过表达+TUT1组、miR-342-3p过表达+THBS2组、TUT1+THBS2组细胞的凋亡率显著高于miR-342-3p过表达组(P<0.05)。miR-342-3p过表达组细胞中野生型TUT1报告基因的荧光素酶活性显著高于对照组(P<0.05),突变型TUT1报告基因的荧光素酶活性与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-342-3p过表达组细胞中TUT1和THBS2蛋白的相对表达量显著高于对照组(P<0.05),miR-342-3p抑制剂组细胞中TUT1和THBS2蛋白的相对表达量显著低于对照组(P<0.05)。结论激活miR-342-3p/TUT1/THBS2通路可抑制PANC-1细胞增殖,促进其凋亡,进而抑制胰腺导管腺癌的发展,miR-342-3p/TUT1/THBS2通路有望成为诊治胰腺癌的潜在靶点。

微RNA-223-3p调控NOD样受体热蛋白结构域3/胱天氨酸蛋白酶-1/白细胞介素-1β信号通路抗小鼠肝纤维化的作用及机制

目的探讨微RNA-223-3p(miR-223-3p)调控NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)/胱天氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)/白细胞介素-1β(IL-1β)信号通路抗小鼠肝纤维化的作用及其机制。方法将32只ICR小鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组、miR-223-3p模拟物(miR-223-3p agomir)组和阴性对照miRNA模拟物(agomir-NC)组,建立四氯化碳小鼠肝纤维化模型。miR-223-3p agomir组和agomir-NC组于第4周末尾静脉注射miR-223-3p agomir及agomir-NC(给药剂量为每只200 nmol/L),每周给药3次,连续给药2周。分别比较4组小鼠血清总胆红素(TBIL)、白蛋白(Alb)、血清透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)表达水平,采用苏木精-伊红(HE)染色及马松(Masson)染色检测肝组织病理改变。采用基因本体分析(GO)、KEGG分析对miR-223-3p进行功能分析,采用Targetscan数据库对miR-223-3p的靶基因进行预测,实时荧光定量PCR(qPCR)及蛋白质印迹法(Western blotting)检测肝组织NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA及蛋白表达情况。结果与模型组相比,miR-223-3p agomir组血清TBIL[(24.32±3.24)比(62.21±4.52)]、Alb[(34.12±7.32)比(59.21±8.21)]、HA[(136.12±10.25)比(298.56±32.14)]、PCⅢ[(39.52±4.25)比(78.32±14.21)]、Ⅳ-C[(50.25±6.32)比(165.85±12.35)]表达均明显降低(P<0.05),小鼠肝组织损伤得到明显改善,浸润的炎性细胞明显减少,纤维化程度明显减轻。GO、KEGG富集及miRNA-mRNA-KEGG关联分析结果显示,miR-223-3p可在炎症、免疫等的59个生命进程中发挥作用。靶点预测结果显示NLRP3可能为miR-223-3p的反向靶点。与模型组相比,miR-223-3p agomir组小鼠肝组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表达[(1.24±0.12)比(2.17±0.14)、(1.44±0.11)比(2.65±0.18)、(1.31±0.13)比(1.97±0.21)]及蛋白表达[(0.89±0.05)比(1.93±0.04)、(1.29±0.07)比(2.15±0.09)、(1.50±0.05)比(2.52±0.12)]水平均显著降低(P<0.05)。结论过表达miR-223-3p可抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的激活,降低机体炎症反应,改善小鼠肝组织损伤,进而发挥其抗肝纤维化作用。

前列腺癌组织中长链非编码RNA OSTN-AS1、微RNA-1207-3p的表达与临床病理参数和预后的关系

目的研究前列腺癌(PCa)组织中长链非编码RNA(lncRNA)OSTN-AS1、微RNA(miR)-1207-3p的表达及与临床病理参数和预后的关系。方法选取自2015年1月至2017年12月于首都医科大学附属北京地坛医院收治的102例PCa患者。采用实时荧光定量PCR检测癌组织和癌旁组织中lncRNA OSTN-AS1、miR-1207-3p表达,分析两者表达与临床病理特征关系。根据癌组织lncRNA OSTN-AS1、miR-1207-3p表达均值,将患者分为lncRNA OSTN-AS1低表达组(<3.26,50例)和高表达组(≥3.26,52例),miR-1207-3p低表达组(<3.69,49例)和高表达组(≥3.69,53例)。随访5年,分析lncRNA OSTN-AS1、miR-1207-3p与预后的关系。Cox回归分析影响PCa患者预后的因素。结果PCa组织中lncRNA OSTN-AS1、miR-1207-3p表达高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。不同TNM分期、Gleason评分、淋巴结转移的PCa组织中LncRNA OSTN-AS1、miR-1207-3p表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。lncRNA OSTN-AS1高表达组5年累积生存率低于lncRNA OSTN-AS1低表达组(P<0.05)。miR-1207-3p高表达组5年累积生存率低于miR-1207-3p低表达组(P<0.05)。Cox回归分析显示,肿瘤TNM分期Ⅲ期、Gleason评分>7分、淋巴结转移、lncRNA OSTN-AS1高表达、miR-1207-3p高表达是影响PCa患者预后的独立危险因素(P<0.05)。结论PCa组织中lncRNA OSTN-AS1、miR-1207-3p表达升高,两者表达与Gleason评分、TNM分期、淋巴结转移及预后生存有关,参与PCa的肿瘤进展。

长链非编码RNA OTUD6B-AS1、微RNA-365a-3p在肝癌中表达与临床病理特征及预后的关系

目的探究血清及肝癌组织中长链非编码RNA(LncRNA)人去泛素化酶含有卵巢肿瘤结构域的6B反义RNA1(OTUD6B-AS1)、微RNA-365a-3p(miR-365a-3p)的表达水平与肝癌病人临床病理特征及预后的关系。方法纳入2015年3月至2017年3月海南医学院第一附属医院收治的肝癌病人86例(肝癌病人组),同时募集同期体检的健康志愿者86例(健康对照组),收集所有研究对象的临床资料。采用qRT-PCR法检测血清及肝癌组织中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达;Star⁃base数据库预测LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p之间的关系;使用Pearson分析血清中LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p表达的相关性;绘制Kaplan-Meier生存曲线分析血清中LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达与病人5年生存率之间的关系;Cox回归分析肝癌病人预后的影响因素。结果与健康对照组比较,肝癌病人组血清中LncRNA OTUD6B-AS1高表达(1.59±0.41比1.02±0.32),miR-365a-3p低表达(0.42±0.15比1.05±0.26)(P<0.05)。肝癌组织中LncRNA OTUD6B-AS1表达水平高于癌旁组织(1.70±0.44比0.97±0.16),miR-365a-3p表达水平低于癌旁组织(0.53±0.17比1.01±0.14)(P<0.05)。血清中Ln⁃cRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p表达与TNM期、淋巴结转移以及分化程度相关(P<0.05)。生物信息学预测显示LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p之间存在靶向结合位点。Pearson分析显示,肝癌病人血清中LncRNA OTUD6B-AS1与miR-365a-3p表达存在负相关(r=−0.47,P<0.05)。LncRNA OTUD6B-AS1低表达组肝癌病人的5年生存率高于LncRNA OTUD6B-AS1高表达组(37.21%比13.95%,χ^(2)=6.11,P=0.013);miR-365a-3p高表达组肝癌病人的5年生存率高于miR-365a-3p低表达组(41.86%比9.30%,χ^(2)=8.03,P=0.005)。LncRNA OTUD6B-AS1高表达以及miR-365a-3p低表达是影响肝癌病人死亡的独立危险因素(P<0.05)。结论LncRNA OTUD6B-AS1、miR-365a-3p在肝癌病人血清及肝癌组织中分别呈高、低表达,二者均与TNM期、淋巴结转移、分化程度等临床病理特征以及预后有关。

LncRNA MYLK-AS1调节miR-141-3p/STMN1轴对胃癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

目的:探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)肌球蛋白轻链激酶反义RNA1(myosin light chain kinase antisense RNA1,MYLK-AS1)调节miR-141-3p/微管不稳定蛋白1(stathmin 1,STMN1)轴对胃癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法:将HGC27细胞分为NC组、si-NC组、si-MYLK-AS1组、si-MYLK-AS1+inhibitor NC组、si-MYLK-AS1+miR-141-3p inhibitor组。双萤光素酶报告基因实验检测LncRNA MYLK-AS1、miR-141-3p、STMN1的关系;qRT-PCR检测HGC27细胞中LncRNA MYLK-AS1、miR-141-3p表达;CCK-8法检测HGC27细胞增殖情况;流式细胞术检测HGC27细胞凋亡;使用Transwell实验评估了HGC27细胞的侵袭和迁移能力,并统计了穿透基质膜的细胞数量;同时采用Western blot技术检测了HGC27细胞中STMN1、E-cadherin、Vimentin及N-cadherin这几种蛋白表达量的变化。结果:HGC27细胞中LncRNA MYLK-AS1、STMN1水平高于GES-1细胞(P<0.05),miR-141-3p水平低于GES-1细胞(P<0.05)。si-MYLK-AS1组HGC27细胞A_(450 nm)值、迁移、侵袭细胞数量、LncRNA MYLK-AS1表达量、STMN1、N-cadherin、Vimentin蛋白水平低于NC组、si-NC组(P<0.05),HGC27细胞凋亡率、miR-141-3p表达量、E-cadherin蛋白水平高于NC组、si-NC组(P<0.05);而miR-141-3p低表达减弱了沉默LncRNA MYLK-AS1抑制HGC27细胞发展的作用;LncRNA MYLK-AS1靶向调节miR-141-3p/STMN1轴。结论:LncRNA MYLK-AS1可能通过上调microRNA-141-3p的表达水平,间接导致STMN1基因表达受到抑制,这一过程可能对胃癌细胞的增殖、凋亡及侵袭特性产生明显影响。

miRNA-17-5p在慢加急性肝衰竭合并乙型病毒性肝炎患者中的表达及与自噬相关蛋白表达的关系

目的:探讨微小RNA-17-5p(miRNA-17-5p)在慢加急性肝衰竭合并乙型肝炎(HBV-ACLF)患者中的表达水平及其与自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)表达的相关性。方法:选取2019年2月至2020年5月HBV-ACLF住院患者82例为HBV-ACLF组,选取同期住院治疗的慢性乙型肝炎(CHB)患者79例作为CHB组,选取同期健康体检者86例作为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测血清miRNA-17-5p水平;酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清Beclin1、LC3-Ⅱ、总胆红素、白蛋白水平;PCR结合荧光探针的体外扩增技术测定血清HBV DNA载量;Pearson法分析HBV-ACLF患者血清miRNA-17-5p与Beclin1、LC3-Ⅱ、总胆红素、白蛋白、HBV DNA载量的相关性;受试者工作特征曲线(ROC)分析血清miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ水平对HBV-ACLF的诊断价值;多因素Logistic回归分析影响HBV-ACLF发生的因素。结果:HBV-ACLF组患者血清Beclin1、LC3-Ⅱ、总胆红素水平高于CHB组和对照组,miRNA-17-5p、白蛋白低于CHB组和对照组(P<0.05);CHB组患者血清Beclin1、LC3-Ⅱ、总胆红素水平高于对照组,miRNA-17-5p、白蛋白低于对照组(P<0.05);HBV-ACLF组患者血清HBV DNA载量高于CHB组(P<0.05)。HBV-ACLF组患者血清miRNA-17-5p水平与Beclin1、LC3-Ⅱ呈负相关(r=-0.580、-0.511;均P<0.05);Beclin1、LC3-Ⅱ与总胆红素、HBV DNA载量均呈正相关,与白蛋白呈负相关(P<0.05);miRNA-17-5p与总胆红素、HBV DNA载量均呈负相关,与白蛋白呈正相关(P<0.05)。血清miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ水平诊断HBV-ACLF的曲线下面积(AUC)分别为0.862、0.784、0.886,特异性分别为88.4%、80.2%、81.4%,敏感度分别为74.4%、63.4%、81.7%;三者联合诊断的AUC为0.915,特异性为88.4%,敏感度为82.9%。Beclin1、HBV DNA载量是影响HBV-ACLF发生的独立危险因素(P<0.05),miRNA-17-5p是影响HBV-ACLF发生的保护因素(P<0.05)。结论:HBV ACLF患者血清miRNA-17-5p表达水平降低,与Beclin1、LC3-Ⅱ呈明显负相关,且三者均对HBV-ACLF有一定的诊断价值。

p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p在脑出血中的表达及与病情严重程度相关性研究

目的分析神经营养因子受体p75(p75NTR)、LINGO-1、患者血清微RNA-23a-3p(mi R-23a-3p)在脑出血患者中的表达及与病情严重程度的相关性。方法选取脑出血患者132例作为脑出血组,另选取健康人80例作为健康组。采用实时荧光定量法检测p75NTR、mi R-23a-3p表达量,采用Western Blot检测LINGO-1表达量,分析三者在脑出血中的表达及与病情严重程度的相关性。结果与健康组相比,脑出血组p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p表达升高(均P<0.05)。随着脑出血严重程度的加重,p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p的升高加剧(均P<0.05),重度脑出血>中度脑出血>轻度脑出血患者(均P<0.05)。p75NTR、LINGO-1、mi R-23a-3p为影响脑出血严重程度的因素(均P<0.05)。相关性结果显示,p75NTR与LINGO-1正相关(P=0.479,P<0.05);p75NTR与miR-23a-3p正相关(=0.388,P<0.05);LINGO-1与mi R-23a-3p正相关(=0.361,P<0.05)。结论p75NTR、LINGO-1、miR-23a-3p在脑出血中表达升高,且与患者疾病严重程度相关,可作为评估患者疾病严重程度的指标。

微RNA-708-5p对结核性脑膜炎小鼠脑损伤的影响

目的探讨微RNA(miR)-708-5p在结核性脑膜炎(TBM)小鼠脑损伤中的作用及机制。方法将48只BALB/c小鼠随机分为假手术组、TBM组、TBM+miR-708-5pinhibitor组及TBM+NC-inhibitor组,每组12只。TBM组、TBM+miR-708-5pinhibitor组及TBM+NC-inhibitor组小鼠经尾静脉注射0.2mL结核分枝杆菌H37Rv菌悬液(2.5×10^9CFU·L^-1)制备TBM模型,假手术组小鼠给予等体积磷酸盐缓冲液。造模成功后,TBM+miR-708-5pinhibitor组、TBM+NC-inhibitor组小鼠分别经尾静脉注射0.2mLmiR-708-5pinhibitor(2mg·kg^-1)和NC-inhibitor(2mg·kg^-1),每2d注射1次,连续1周。将对数生长期小鼠脑膜细胞GIBH001根据转染载体的不同分为对照组、miR-708-5p过表达组、补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白1(C1qtnf1)过表达组及miR-708-5p+C1qtnf1过表达组,分别转染NC-mimic和Vector、miR-708-5pmimic和Vector、NC-mimic和pcDNA-C1qtnf1、miR-708-5pmimic和pcDNA-C1qtnf1;另根据转染载体的不同,将GIBH001细胞分为空白组、NC-inhibitor组及miR-708-5pinhibitor组,空白组细胞不做处理,NC-inhibitor组、miR-708-5pinhibitor组细胞分别转染NC-inhibitor、miR-708-5pinhibitor。采用干湿法检测各组小鼠脑组织含水量;采用伊文思蓝实验检测各组小鼠血脑屏障通透性;采用酶联免疫吸附法检测各组小鼠脑组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测小鼠脑组织中miR-708-5p和C1qtnf1mRNA相对表达量以及各组GIBH001细胞中C1qtnf1mRNA相对表达量;采用Westernblot法检测各组小鼠脑组织中和对照组、miR-708-5p过表达组、C1qtnf1过表达组、miR-708-5p+C1qtnf1过表达组GIBH001细胞中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白相对表达量。结果TBM组小鼠脑组织同侧基底神经节含水量显著高于假手术组(P<0.05);TBM+miR-708-5pinhibitor组小鼠脑组织同侧基底神经节含水量显著低于TBM+NC-inhibitor组(P<0.05);4组小鼠对侧皮质、对侧基底神经节、同侧皮质、小脑含水量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。TBM组小鼠血脑屏通透性显著高于假手术组(P<0.05);TBM+miR-708-5pinhibitor组小鼠血脑屏障通透性显著低于TBM+NC-inhibitor组(P<0.05)。TBM组小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β水平均高于假手术组(P<0.05);TBM+miR-708-5pinhibitor组小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β水平显著低于TBM+NC-inhibitor组(P<0.05)。与假手术组比较,TBM组小鼠脑组织中miR-708-5p的相对表达量显著升高(P<0.05),C1qtnf1mRNA相对表达量显著降低(P<0.05);与TBM+NC-inhibitor组比较,TBM+miR-708-5pinhibitor组小鼠脑组织中miR-708-5p的相对表达量显著降低(P<0.05),C1qtnf1mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。miR-708-5p过表达组细胞中C1qtnf1mRNA相对表达量低于对照组(P<0.05);C1qtnf1过表达组细胞中C1qtnf1 mRNA相对表达量高于对照组(P<0.05);miR-708-5p+C1qtnf1过表达组细胞中C1qtnf1mRNA相对表达量显著低于C1qtnf1过表达组(P<0.05);miR-708-5p+C1qtnf1过表达组细胞中C1qtnf1mRNA的相对表达量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。NC-inhibitor组细胞中C1qtnf1mRNA相对表达量与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05);miR-708-5pinhibitor组细胞中C1qtnf1mRNA相对表达量显著低于空白组(P<0.05);miR-708-5pinhibitor组细胞中C1qtnf1mRNA相对表达量显著低于NC-inhibitor组(P<0.05)。TBM组小鼠脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt显著高于假手术组(P<0.05);TBM+miR-708-5pinhibitor组小鼠脑组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt显著低于TBM+NC-inhibitor组(P<0.05)。miR-708-5p过表达组细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均显著低于对照组(P<0.05);C1qtnf1过表达组细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均显著高于对照组(P<0.05);miR-708-5p+C1qtnf1过表达组细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均显著低于C1qtnf1过表达组(P<0.05);miR-708-5p+C1qtnf1过表达组细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论miR-708-5p可促进TBM小鼠脑损伤的发生,其机制可能与下调C1qtnf1的表达、抑制PI3K/Akt信号通路有关。

miR-148a-3p靶向Wnt1基因对人牙髓干细胞增殖活力及成骨分化的影响

目的:观察微小RNA(miRNA)-148a-3p对人牙髓干细胞(DPSCs)增殖活力及成骨分化的影响,并探讨可能机制。方法:取对数期DPSCs,分为空白组、NC组、inhibitor组、inhibitor+XAV939[无翅型MMTV整合位点家族蛋白(Wnt)/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路抑制剂]组。空白组不处理,NC组转染阴性对照质粒miR-148a-3p NC,inhibitor组转染miR-148a-3p inhibitor,inhibitor+XAV939组转染miR-148a-3p inhibitor并加入XAV939(40μmol/L)。转染48 h后qRT-PCR法检测miR-148a-3p表达量;MTT法检测增殖活力;ELISA法检测碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色法检测矿化能力;双荧光素酶实验验证miR-148a-3p靶向基因;Western blot法检测糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、β-catenin、Runt相关转录因子2(Runx2)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白1(DMP-1)以及Wnt1蛋白相对表达量。结果:与空白组、NC组比较,inhibitor组24 h、48 h、72 h吸光度值,GSK-3β蛋白表达量降低,ALP活性值,矿化结节面积占比,β-catenin、Runx2、DSPP、DMP-1以及Wnt1蛋白表达量升高(P<0.05);与inhibitor组比较,inhibitor+XAV939组24 h、48 h、72 h吸光度值,GSK-3β蛋白表达量升高,ALP活性值,矿化结节面积占比,β-catenin、Runx2、DSPP、DMP-1以及Wnt1蛋白表达量降低(P<0.05)。结论:抑制miR-148a-3p表达可提升DPSCs增殖活力并促进其成骨分化,推测其作用机制与负向调控下游的靶基因Wnt1有关。

急性缺血性脑卒中患者血清miR-124-3p和EGR1的表达水平及其预测并发吞咽障碍的价值

目的:探讨血清微RNA-124-3p(microRNA-124-3p,miR-124-3p)、早期生长反应因子1(early growth response 1,EGR1)在急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)患者合并吞咽障碍中的预测价值。方法:回顾性选取2020年5月至2023年3月期间郑州大学第五附属医院神经内科收治住院的181例AIS患者为研究对象,依据吞咽功能测试分为障碍组(62例)和无障碍组(119例)。采用酶联免疫吸附法检测血清EGR1表达水平,real-time RT-PCR检测血清miR-124-3p表达水平;AIS患者血清miR-124-3p、EGR1表达水平与基线资料的相关性采用Spearman及Pearson分析;血清miR-124-3p、EGR1表达水平对AIS患者并发吞咽障碍的预测价值采用受试者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析;AIS患者并发吞咽障碍的影响因素采用logistic回归分析。结果:障碍组血清EGR1表达水平、年龄、美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)评分均高于无障碍组(均P<0.05);血清miR-124-3p表达水平、Barthel指数、肌力分级>3级患者比例均低于无障碍组(均P<0.05)。AIS并发吞咽障碍患者血清miR-124-3p表达水平与年龄、NIHSS评分呈负相关(r=−0.514、−0.520,均P<0.05),与Barthel指数、肌力分级呈正相关(r=0.509、0.492,均P<0.05);EGR1表达水平与年龄、NIHSS评分呈正相关(r=0.498、0.516,均P<0.05),与Barthel指数、肌力分级呈负相关(r=−0.527、−0.494,均P<0.05)。血清miR-124-3p、EGR1表达水平单独及联合预测AIS患者并发吞咽障碍的曲线下面积(area under curve,AUC)分别为0.795、0.811、0.880。EGR1是AIS患者并发吞咽障碍的独立危险因素,miR-124-3p是AIS患者并发吞咽障碍的保护因素(均P<0.05)。结论:并发吞咽障碍的AIS患者血清miR-124-3p呈低表达,EGR1呈高表达,临床可根据二者的联合检测对吞咽障碍进行早期评估,以改善预后。

MiR-223-3p通过靶向SORBS1增加结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性

目的:5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的一线治疗药物,CRC细胞对5-FU的耐药是导致化学治疗(以下简称“化疗”)失败的主要原因,然而耐药机制仍不明确。本研究旨在探究参与CRC细胞对5-FU耐药的抑癌基因,并寻找对该基因存在调控作用的微RNA(microRNA,miRNA)。方法:在高通量基因表达(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中下载CRC数据集GSE28702和GSE69657,分别分析2个数据集中对FOLFOX化疗方案应答组和无应答组患者的差异表达基因并确定目标基因;采用在线生物信息学数据库TargetScan、miRwalk和miRDB预测靶向目标基因含山梨醇和SH3结构域蛋白1(sorbin and SH3 domain containing 1,SORBS1)的miRNA。采用瞬时转染技术在CRC细胞系HCT116、SW620中分别转染siSORBS1、HA-SORBS1、miR-223-3p mimic、anti-miR-223-3p及其相应的阴性对照(siNC、HA、miR-NC、anti-miR-NC),在HCT116细胞中共转染miR-NC和HA、miR-223-3p mimic和HA、miR-223-3p mimic和HA-SORBS1、anti-miR-NC和siNC、anti-miR-223-3p和siNC、anti-miR-223-3p和siSORBS1。采用实时反转录PCR(real-time reverse transcription PCR,real-time RT-PCR)和/或蛋白质印迹法检测细胞中SORBS1和miR-223-3p的表达水平。转染后用不同浓度的5-FU处理细胞。采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞活力,双荧光素酶报告分析验证miR-223-3p与SORBS1的靶向关系。结果:GSE69657数据集和GSE28702数据集应答组分别有409和528个高表达基因,共有22个高表达交集基因。在22个高表达交集基因中,与CRC化疗敏感性有关的抑癌基因有3个,选择SORBS1作为目标基因进一步探索。3个在线生物信息学数据库预测的靶向SORBS1的miRNA为miR-223-3p。用5-FU(25μmol/L)处理HCT116、SW620细胞12~36 h后,2种细胞中miR-223-3p的表达水平均显著下调(均P<0.05)。转染siSORBS1或miR-223-3p mimic后,HCT116、SW620细胞中SORBS1表达水平均下调,细胞活力均增加(均P<0.05);转染HA-SORBS1或antimiR-223-3p后,HCT116、SW620细胞中SORBS1表达水平均上调,细胞活力均下降(均P<0.05)。双荧光素酶报告分析结果显示:共转染SORBS13'-非翻译区(untranslated region,UTR)野生型质粒和miR-223-3p mimic的细胞荧光素酶活性显著低于共转染SORBS13'-UTR野生型质粒和miR-NC的细胞(P<0.05)。与共转染miR-223-3p mimic和HA的细胞比较,共转染miR-223-3p mimic和HA-SORBS1的细胞活力明显降低(P<0.01);与共转染anti-miR-223-3p和siNC组比较,共转染anti-miR-223-3p和siSORBS1组细胞活力明显增加(P<0.05)。结论:MiR-223-3p通过靶向SORBS1基因增加CRC细胞对5-FU的耐药性,miR-223-3p有望成为临床治疗CRC的新靶点。

miR-142-3p在感染后肠易激综合征中的表达及意义

目的探讨微RNA(miR)-142-3p在感染后肠易激综合征(PI-IBS)中的表达及意义,进一步阐明miR-142-3p调控PI-IBS发生发展的分子机制。方法使用脂多糖(LPS)刺激后,在大鼠肠上皮细胞上考察miR-142-3p对高迁移率族蛋白B1(HMGB1)-Toll样受体4(TLR4)靶基因的作用;通过TargetScan预测软件分析发现HMGB1是miR-142-3p的靶基因,之后采用旋毛虫感染建立PI-IBS模型,原代肠上皮细胞进行小干扰RNA(siRNA)转染实验,提取肠上皮细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR检测,检测细胞中miR-142-3p、HMGB1和TLR4的mRNA表达水平,考察miR-142-3p对HMGB1-TLR4靶基因的作用,并进一步验证HMGB1在miR-142-3p抗炎中的介导作用。结果炎症基因NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α均为HMGB1-TLR4的靶基因。使用LPS刺激后,施加miR-142-3p大大抑制了HMGB1-TLR4靶基因(NLRP3、IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α)的表达(P均<0.01)。使用siRNA对肠上皮细胞中的HMGB1靶向敲低后,细胞中的HMGB1表达降低超过80%,HMGB1-TLR4靶基因(NLRP3、IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α)的表达均无明显变化(P均>0.05)。结论miR-142-3p在肠上皮细胞中具有抗炎作用,其抗炎作用依赖于HMGB1。

微RNA-372-3p负调控FBXO11参与心肌成纤维细胞活化的机制

目的探讨在心肌成纤维细胞(CFs)活化过程中,微RNA(miRNA)对FBXO11表达的调控及其分子机制。方法正常心肌成纤维细胞(hCFs)经miR-372-3p mimics转染和转化生长因子β1(TGF-β1)诱导后,采用qRT-PCR检测FBXO11及hCFs活化标志物的表达;通过双荧光素酶报告基因实验检测FBXO11与miR-372-3p的结合情况。结果hCFs活化后,FBXO11表达呈剂量依赖性上调,且与hCFs活化标志物表达水平呈正相关。敲除FBXO11后,hCFs活化标志物表达下调。在hCFs体外纤维化诱导模型中,miR-372-3p表达下调,且与FBXO11呈显著负相关。miR-372-3p通过与FBXO113′非翻译区(3′UTR)的特定位点结合,对FBXO11进行转录后调控。过表达miR-372-3p可以抑制TGF-β1诱导的FBXO11高表达和hCFs活化标志物表达水平升高。结论miR-372-3p通过负调控FBXO11表达参与hCFs活化。

lncRNA NEAT1通过miR-377-3p/Wnt通路影响ox-LDL诱导的人血管平滑肌细胞增殖、侵袭迁移

目的·研究长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)核旁斑组装转录本1 (nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)通过微RNA-377-3p (microRNA-377-3p,miR-377-3p)调控Wnt通路对氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cell,HVSMC)增殖、侵袭迁移的影响。方法·以100μg/mL的ox-LDL处理体外培养的HVSMC。将HVSMC随机分为对照组、模型组、lncRNA NEAT1siRNA组、miR-377-3p抑制组、转染+抑制组(转染NEAT1 siRNA和miR-377-3p抑制剂)、转染阴性对照组(NEAT1 siRNA阴性对照)。除对照组外,其余各组以100μg/mL的ox-LDL诱导建立动脉粥样硬化细胞模型,分组转染处理后,通过细胞计数试剂盒8 (cell counting kit-8,CCK-8)测定各组细胞活力;通过流式细胞实验测定各组细胞凋亡率;通过Transwell实验评测各组细胞迁移侵袭情况;通过免疫印迹实验评测各组细胞增值细胞标志蛋白[增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)]及上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志蛋白[E-cadherin、vimentin]的表达;通过qRT-PCR实验测定各组细胞NEAT1、miR-377-3p及无翅型MMTV整合位点家族成员5A (wingless-related MMTV integration site 5A, WNT5A) mRNA表达。结果·与对照组相比,模型组NEAT1 mRNA表达升高,miR-377-3p mRNA表达降低,细胞凋亡率降低,细胞活力、迁移侵袭细胞数升高,PCNA、vimentin蛋白表达蛋白升高,E-cadherin表达降低,WNT5A mRNA表达升高(均P=0.000)。干扰NEAT1后,细胞凋亡率升高,细胞活力、迁移侵袭细胞数降低,PCNA、vimentin蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达升高,WNT5A mRNA表达降低(均P=0.000);抑制miR-377-3p后上述各项指标均呈现相反的表达趋势(均P<0.05)。此外,抑制miR-377-3p可逆转NEAT1干扰对细胞增殖、侵袭迁移和凋亡的调控作用(均P=0.000)。结论·下调NEAT1表达,可能通过与miR-377-3p竞争性结合,升高miR-377-3p表达,降低Wnt通路蛋白表达,进而抑制ox-LDL诱导的HVSMC异常增殖及侵袭迁移,并诱导其凋亡。

微RNA-130a-3p对脂多糖诱导的肺泡上皮细胞炎性因子的保护作用及机制研究

目的探讨微RNA-130a-3p(miR-130a-3p)对脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞A549炎性因子的保护作用及机制研究。方法不同浓度的LPS处理A549细胞,MTT检测细胞活性,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-130a-3p水平。LPS诱导miR-130a-3p过表达的A549细胞,MTT检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡,免疫印迹法检测缺氧诱导因子1α基因(HIF1A)、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-130a-3p与HIF1A关系。结果LPS处理后,A549细胞活性和miR-130a-3p表达水平显著降低(P<0.05),IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平、A549细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。过表达miR-130a-3p提高了LPS诱导的A549细胞活性,降低了LPS诱导的A549细胞IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平和凋亡率(P<0.05)。miR-130a-3p负调控HIF1A表达,过表达HIF1A降低了过表达miR-130a-3p对LPS诱导的A549细胞活性、凋亡率及IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达的影响。结论miR-130a-3p通过抑制HIF1A表达降低LPS诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡和炎性反应。