果蝇心脏发育研究三十年进展

果蝇(Drosophila melanogaster)作为最早用于研究心脏发育基因调控的模式生物,已经走过三十年的历程。果蝇心脏发育过程经历了胚胎期、幼虫期和成虫期三大阶段。在胚胎早期,Tinman、Dorsocross和Pannier等基因是关键的调控因子。Tinman参与最早的心脏前体细胞分化和心脏细胞形成,而Dorsocross和Pannier则影响心脏前体细胞的定向分化和心脏管腔的形成。进入胚胎晚期和幼虫期,果蝇的心管经历进一步的发展和重塑,该过程主要受到转录因子Hand、Mef2以及Hox基因家族的调控。在成虫期,Hox基因家族和Tinman依旧发挥重要作用。虽然果蝇心脏与脊椎动物成熟心脏存在形态上的差异,但两者心脏的早期发育过程以及调控基因和信号通路都有保守性。本文综述了果蝇心脏发育基因调控研究的三十年进展以及利用果蝇模型研究人类心脏相关疾病的潜在希望。

超声联合染色体检测在诊断胎儿心脏发育异常中的价值

目的本研究旨在探讨超声联合染色体检测对于诊断胎儿心脏发育异常的临床价值。方法前瞻性选取2022年1月至2022年12月在上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院进行建档产检的孕妇进行超声检查,将高度疑似胎儿发育异常的96例孕妇纳入研究中。均接受染色体检测,以分娩后新生儿结局或引产诊断结果为金标准,对超声及染色体检测的诊断价值进行探究。结果对纳入研究的96例孕妇进行追踪随访(至分娩完成新生儿接受超声诊断或引产后接受病理诊断止),共追踪到29例胎儿心脏发育表现正常,67例胎儿心脏发育异常。经超声检查,32例产妇未见胎儿心脏发育异常,其他64例诊出胎儿心脏发育异常;经染色体检查,共诊出正常染色体36例,染色体异常64例。以分娩后新生儿结局或引产病理诊断结果为诊断金标准,超声检查真阳性(心脏发育异常)59例,真阴性(心脏发育异常)24例,超声联合染色体检测真阳性(心脏发育异常)63例,真阴性(心脏发育异常)23例。超声联合染色体检测诊断胎儿心脏发育异常的灵敏度、准确率分别为94.03%、89.58%,分别高于单独的超声检查(88.06%、86.46%),AUC值(95%CI)为0.854(0.762~0.946),优于单独的超声检查[0.878(0.773~0.960)]。结论超声联合染色体检测在诊断胎儿心脏发育异常方面具有较高的诊断价值和临床应用前景。相较于单独的超声检查,超声联合染色体检测展现出更高的灵敏度以及更优的准确率,可作为诊断胎儿心脏发育异常的有力工具。

孕早期UVC彩色多普勒超声血流频谱参数联合孕中期四维彩超诊断先天性心脏发育畸形胎儿的价值

目的:探讨胎儿先天性心脏病(FCHD)患儿中孕早期脐静脉导管(UVC)彩色多普勒超声血流频谱参数与孕中期四维彩超联合诊断的应用价值。方法:回顾性选取2018年1月—2023年9月沧州市第四医院确诊的47例FCHD胎儿作为病例组,同期选取47例分娩且心脏正常发育的胎儿作为健康组,两组均于孕11~13周接受UVC多普勒超声检查,孕17~27周接受四维彩超,观察两组UVC多普勒超声血流频谱参数及四维彩超二、三尖瓣环相关参数,同时以出生后新生儿心脏超声结果或引产后心脏病理结果为金标准,评估二者联合在不同FCHD患儿中的检出情况。结果:相较于健康组,病例组胎儿心室收缩峰值流速(S)、心室舒张峰值流速(D)、最大心房收缩回流流速(A)、平均峰值流速(TAmax)测定值更低,搏动指数(PI)、前负荷指数(PLI)、静脉峰值流速指数(PVIV)更高(P <0.05);两组左心室射血分数(EF)对比差异无统计学意义(P> 0.05);但病例组胎儿右EF低于健康组,左右舒张末期容积(EDV)、收缩末期容积(ESV)均高于健康组(P <0.05);UVC多普勒超声联合四维彩超对胎儿室缺、法洛四联症、动脉导管未闭检出率相对较高,分别为83.33%、80.00%、77.78%,在大动脉转位、右室双出口、右位心中检出率相对较低,分别为55.56%、60.00%、50.00%。结论:UVC彩超血流频谱参数联合四维彩超能够借助相关参数增强对不同类型FCHD胎儿的检出,具有良好的诊断价值。

抑制TGF-β信号通路不同靶点对斑马鱼心脏发育的作用初探

心脏发育异常会导致先天性心脏疾病。转化生长因子(TGF-β)信号通路在心脏发育中发挥重要作用。使用转基因斑马鱼并结合免疫荧光和原位杂交技术,研究抑制TGF-β信号通路不同靶点对心肌细胞增殖、细胞大小和肌小梁发育的作用。结果显示:抑制TGFBR1不影响心肌细胞增殖,抑制TGFBR1和TGFBR2能够促进心肌细胞的增殖和肌小梁的生成,抑制Smad3对细胞大小和肌小梁发育无影响。研究结果将为TGF-β作为心脏发育缺陷的潜在干预靶点奠定理论基础。

二维超声联合四维彩色多普勒超声超高细微分辨血流技术彩色血流显像在产前诊断先天性心脏发育异常中的应用

目的探究二维超声联合四维彩色多普勒超声彩色超高细微分辨率血流技术(HD-flow)彩色血流显像在产前诊断先天性心脏发育异常(FCHD)中的应用价值。方法抽取2020年7月至2022年2月于我院行产前检查及分娩的孕妇1983例作为研究对象,均采用二维超声联合四维彩色多普勒HD-flow彩色血流显像检查。“金标准”为引产及随访至分娩结果,分析FCHD发生率;对比不同检查方式下FCHD检出率及不同检查方式下FCHD诊断价值,并计算一致性。结果1983例于我院产前检查及分娩的孕妇最终明确存在FCHD共51例,检出率为2.57%(51/1983)。二维超声联合四维彩色多普勒HD-flow彩色血流显像在FCDH检出率中高于二维超声检查(P<0.05)。相比于二维超声检查,二维超声联合四维彩色多普勒HD-flow彩色血流显像检查诊断灵敏度、准确度、阳性及阴性预测值均较高(P<0.05)。kappa检验显示:二维超声检查的一致性尚可(kappa值=0.667,P<0.001);二维超声联合四维彩色多普勒HD-flow彩色血流显像检查的一致性良好(kappa值=0.916,P<0.001)。结论二维超声联合四维彩色多普勒HD-flow彩色血流显像在产前FCHD诊断中应用价值较高,有助于及时明确心脏发育异常类型,且诊断准确度及一致性均较高,可为临床诊疗提供有效参考,值得推广应用。

二维超声联合STIC检查对先天性心脏发育异常胎儿产前诊断效能及临床应用

目的观察二维超声联合四维超声时间-空间关联成像(STIC)对先天性心脏发育异常胎儿产前诊断效能及临床应用价值。方法回顾性分析许昌市中心医院89例疑似为胎儿先天性心脏发育异常孕妇的临床资料,孕妇均进行二维超声和STIC检查,以出生后新生儿复查结果以及引产解剖检查情况为参照,比较在产前二维超声与STIC诊断以及联合诊断对胎儿的诊断结果,分析各项检查对先天性心脏发育异常胎儿的产前诊断效能。结果89例疑似为先天性心脏发育异常胎儿中,确诊为先天性心脏发育异常胎儿62例(69.66%),其中左心室发育不良17例(19.10%),右心室发育不良11例(12.36%),肺动脉瓣狭窄13例(14.61%),房间隔缺损9例(10.11%),室间隔缺损12例(13.48%)。二维超声联合STIC检查诊断先天性心脏发育异常胎儿的敏感度为96.77%,特异度为77.78%,阳性预测值为90.91%,阴性预测值为91.30%,准确度为91.01%,Kappa值为0.778。结论二维超声联合STIC检查对先天性心脏发育异常胎儿具有较高的产前诊断效能,可应用于胎儿产前心脏病疾病筛查工作中。

利用RNAi技术研究果蝇心脏发育基因的功能

RNAi是近两年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法。它通过导入一段与内源基因同源的双链RNA序列(dsRNA) ,使内源mRNA降解 ,从而达到阻抑基因表达的目的。目前已在线虫、果蝇、臭虫、真菌及植物等生物中建立RNAi技术 ,用于研究某些特定基因或已知基因在特定发育时期的功能。对于难于获得突变体的基因或生物体 ,RNAi技术尤其有效。虽然果蝇心脏发育基因wingless和tinman在果蝇心脏发育的早期功能已经清楚 ,它们都与果蝇心脏前体细胞的形成有关 ,但它们在果蝇心脏发育的后期功能仍有待进一步研究。实验运用RNAi技术 ,分别将tinman和wingless的dsRNA注入果蝇的早期胚胎 ,得到了这两个基因的dsRNA干扰表型 ,与两个基因的突变体表型非常相似 ,都表现为果蝇心脏前体细胞不能形成或心脏管缺失。尤其是tinman基因的dsRNA ,还引起了肠中胚层缺失和体壁肌肉组织的紊乱 ,而wingless基因的dsRNA却只影响心脏的形成 ,而不影响肠中胚层 ,说明dsRNA干扰具有非常强的特异性 ,因而不失为研究果蝇心脏发育基因功能的有效方法。

叶酸拮抗剂甲氨喋呤导致斑马鱼心脏发育异常及BMP2b HAS2表达下调

目的该研究利用叶酸拮抗剂甲氨喋呤（MTX）构建叶酸生物学活性受抑制的斑马鱼模型后，观察叶酸生物学活性受抑后对斑马鱼心脏发育的干扰作用以及对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响。方法用不同浓度的MTX处理不同发育时段的斑马鱼胚胎，于48hpf（hours post fertilization）观察胚胎心脏发育情况并计数各组心脏发育异常个体的百分比及心率，评定MTX对斑马鱼心脏发育的影响程度。用1．5×10^-3M的MTX处理6～10hpf发育时段的斑马鱼胚胎作为MTX处理组。于24hpf及48hpf在显微镜下观察MTX处理组斑马鱼胚胎心脏发育情况。借助胚胎整体原位杂交和Real-time PCR的方法检测BMP2b和HAS2在正常对照组及MTX处理组胚胎的表达水平。结果胚胎早期发育阶段6～12hpf是斑马鱼胚胎对MTX的敏感时期。显微镜下观察结果显示MTX处理组斑马鱼心脏发育延迟，并有心脏形态发育明显异常。胚胎整体原位杂交结果显示MTX处理组斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2在心脏的表达于36hpf及48hpf下调。Real-time PCR结果显示MTX处理组斑马鱼BMP2b的相对表达量在12，24，36及48hpf减少，HAS2的相对表达量在24，36及48hpf减少。结论叶酸生物学活性受抑对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。

心肌细胞肥大过程中心脏发育相关转录因子及下游心脏肥大标志基因的时序性表达规律研究

目的观察在心肌细胞肥大过程中心脏发育相关转录因子及下游心脏肥大标志基因时序性表达规律,为心肌肥大机制研究提供线索。方法用异丙肾上腺素(ISO)干预心肌细胞,用CCK-8、细胞计数仪、免疫组化分别检测细胞存活率、细胞直径及表面积,用RT-PCR、Western blotting分别检测相关基因mRNA及蛋白表达水平。结果用ISO成功构建心肌细胞肥大模型。ISO干预后,GATA结合蛋白4(GATA4)、肌细胞增强因子2C(MEF2C)、GATA5、脑钠肽(BNP)、心房利钠因子(ANP)于24h开始升高,P300、α-肌球蛋白重链(α-MHC)、T-框蛋白5(TBX5)于12h开始升高,血清应答因子(SRF)、β-MHC mRNA于6h开始升高(P<0.05);其中GATA4、α-MHC、β-MHC、SRF、P300 mRNA表达呈先升后降的趋势,至干预72h GATA4、SRF、α-MHC、β-MHC、P300 mRNA表达仍高于正常(P<0.05),而MEF2C降至正常(P>0.05);GATA5、TBX5、ANP、BNP mRNA表达与对照组相比持续升高(P<0.05),而NKX2.5 mRNA(P>0.05)无明显变化。ISO干预48h后,GATA4蛋白表达水平升高,HEY2蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论在心肌细胞肥大过程中,MEF2C的时序表达规律与心脏发育过程相似,而GATA4、GATA5、SRF、TBX5的时序性表达规律与心脏发育过程不完全一致,提示其在心肌细胞肥大由代偿转为失代偿过程中的重要作用。同时GATA4、MEF2C、SRF与乙酰化酶P300的时序性表达规律相似,提示在心肌细胞肥大过程中其时序性表达可能受P300调控。

小鼠胚胎心脏发育过程中组蛋白乙酰化酶亚型p300调控心脏特异转录因子的动态表达

目的:观察小鼠胚胎心脏发育过程中GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5基因的动态表达和这些基因的启动子区域组蛋白H3乙酰化修饰状态的变化,以及组蛋白乙酰化酶亚型p300对这些基因启动子的直接调控作用,为进一步研究先天性心脏疾病的发生机制奠定基础。方法:选取胎龄(Embryoday,E)10.5d和16.5d小鼠正常胚胎心脏,用实时荧光定量PCR(RealTimePCR)的方法观察上述基因mRNA的动态表达;采用染色质免疫沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation,ChIP),用ChIP级抗乙酰化H3和抗p300抗体免疫沉淀与其所结合的DNA,采用RealTimePCR扩增抗体所富集的上述基因启动子的DNA量,观察胚胎心脏发育过程中乙酰化组蛋白及组蛋白乙酰化酶亚型p300是否参与调控上述四种心脏特异转录因子的表达。结果:①胎龄E10.5d和E16.5d小鼠胚胎心脏的GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5基因的mRNA表达水平都有明显差异(P<0.05),其中GATA4和MEF2C mRNA相对β-actin的表达水平,E10.5明显低于E16.5,而Nkx2.5和Tbx5mRNA相对表达水平,E10.5明显高于E16.5;并且ChIP结果显示这些基因启动子的乙酰化水平也随着时间而改变,但差异无统计学意义。②E10.5和E16.5胚胎小鼠心脏中,p300抗体均能免疫沉淀GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5基因启动子,其沉淀的基因量在这两个小鼠心脏发育的关键时间点有所不同,但差异无统计学意义。结论:小鼠胚胎心脏发育过程中,心脏发育相关基因GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5呈现动态表达,提示这些基因在心脏发育不同阶段具有重要作用。ChIP结果提示p300介导的组蛋白乙酰化修饰可能为调节这些基因动态表达的机制之一。

MicroRNAs在心脏发育和疾病中的作用

微小RNA（microRNA,miRNA）是一种长度为18-24核苷酸单链的内源性非编码小RNA,在进化过程中高度保守,通过与靶基因序列特异性相互作用在转录后水平调节基因表达,参与多种生物学过程。最初发现的内源性miRNA是lin-4和let-7,

短链酰基辅酶A脱氢酶在大鼠心脏发育中的表达及其与心肌肥厚的关系

目的:研究大鼠心脏发育过程中短链酰基辅酶A脱氢酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase,SCAD)的表达变化规律,并探讨其与高血压大鼠心肌肥厚的关系。方法:观察不同时期Wistar大鼠和不同周龄自发性高血压大鼠心肌组织的SCAD蛋白表达及酶活性变化,检测大鼠的血清和心肌游离脂肪酸含量。结果:与胚胎期19 d Wistar大鼠组比较,出生后1 d、2周、6周及16周龄Wistar大鼠组心肌的SCAD蛋白表达及酶活性增加,血清和心肌游离脂肪酸含量明显减少,二者之间呈负相关,其中,从2周龄Wistar大鼠组开始差异有统计学意义。与周龄匹配的WKY大鼠组比较,2周龄自发性高血压大鼠组收缩压尚未升高,6周龄及16周龄自发性高血压大鼠组收缩压显著增高;各时点自发性高血压大鼠组的左室重量指数均明显增高,提示自发性高血压大鼠在血压升高之前,已经发生了明显的心肌肥厚。与周龄匹配的WKY大鼠组比较,2周、6周及16周龄自发性高血压大鼠组心肌的SCAD蛋白表达及酶活性明显下降,血清和心肌游离脂肪酸含量明显增加,呈显著负相关。结论:(1)SCAD蛋白表达随大鼠心脏的生长发育逐渐上调,可能与心脏对脂肪酸的利用增加密切相关。(2)SCAD的蛋白表达及其酶活性显著下降,可能是导致自发性高血压大鼠肥厚心肌能量代谢"胚胎型再演"的分子基础。

二维超声联合四维彩超HD-flow彩色血流显像在产前诊断先天性心脏发育异常中的应用

目的探讨二维超声联合四维彩超超高细微分辨血流技术(HD-flow)彩色血流显像在产前诊断先天性心脏发育异常中的临床应用价值。方法选取2016年7月至2018年2月在小榄人民医院行产前超声检查并分娩的单胎妊娠孕妇2 200例,先对所有入组的孕妇进行二维超声检查,二维超声检查提示胎儿疑似宫内心脏发育异常的孕妇再联合应用四维彩超HD-flow彩色血流显像进行检查。将进行二维超声的检查结果作为对照组,将二维超声+四维彩超HD-flow彩色血流显像的检查结果作为研究组,将出生后新生儿的心脏超声诊断结果或引产后胎儿心脏病理诊断结果作为金标准。观察所有入组孕妇中胎儿先天性心脏发育异常(FCHD)的检出情况,比较不同检查方式诊断FCHD胎儿的准确率。结果2 200例胎儿经随访诊断证实有56例胎儿存在先天性心脏发育异常,占所有入组胎儿总数的2.5%(56/2 200),其中,动脉弓畸形6例,三尖瓣畸形3例,完全性大动脉转位4例,右室双出口4例,单心室(房)4例,法洛四联症(TOF)8例,心内膜垫缺损4例,单纯性室间隔缺损9例、左心发育不良4例,肺动脉瓣闭锁5例,肺动脉瓣狭窄2例,永存动脉干3例;二维超声共检查出42例FCHD,有14例误诊或漏诊,准确率为75.0%,二维超声+四维彩超HD-flow彩色血流显像检查共查出52例FCHD,误诊或漏诊4例,准确率为92.8%,研究组的准确率高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);研究组的灵敏度为92.1%、特异度为94.5%,对照组的灵敏度为60.7%、特异度为90.3%,研究组的灵敏度及特异度明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论二维超声联合四维彩超HD-flow彩色血流显像检查能显著提高FCHD的产前诊断准确率,具有较高的灵敏度及特异度,值得临床推广应用。

Hippo-YAP信号通路在心脏发育和心肌再生中的作用

心脏是哺乳动物胚胎发育过程中最先形成的器官,也是机体内最重要的器官之一,其发育及分化过程中受到多种信号通路的协同调控。近年来,Hippo信号通路作为一种在进化过程中非常保守的细胞抑制生长性信号通路,在心脏发育和心肌梗死后心脏修复方面受到重视,成为研究的热点之一。

多氯联苯对斑马鱼胚胎心脏发育的毒性作用

目的探讨环境污染物多氯联苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)对斑马鱼胚胎心脏发育的毒性影响及机制。方法采用水域染毒法,将受精后4 h(4 hours post fertilization,4 hpf)内的斑马鱼胚胎分别暴露于浓度为1 000、500、250、125μg/L的多氯联苯中,作为4个浓度组,然后设置溶剂(0.01%甲醇)对照组、60 mg/L的氯化钠溶液空白对照组。通过死亡率、孵化时间、发育畸形等指标评价多氯联苯对胚胎心脏的发育毒性。结果与对照组相比较,随着PCBs质量浓度的增加,斑马鱼胚胎的孵化率降低,畸形率和死亡率增加。当PCBs达到1 000μg/L时,斑马鱼72 hpf的孵出率由对照组的99.44%下降到75.56%,并且120 hpf的死亡率为40.14%、畸形率为57.78%。结论PCBs能影响斑马鱼胚胎发育,导致斑马鱼胚胎和幼鱼的畸形与死亡。

心脏发育过程中常见的相关基因与先天性心脏病

人体心脏发育是一个复杂的过程,包括细胞决定、迁移和分化、心管的形成、环化、房室腔形成等一系列变化。GATA家族基因、NKX家族基因、TBX家族基因、NODAL、NOTCH、WNT、BMP信号通路以及ISL1、ACFC1、DNAH及JAG等基因都与心脏发育密切相关。

海七鳃鳗pma-miR-200c-3p对斑马鱼心脏发育的作用研究

为研究海七鳃鳗Petromyzon marinus pma-miR-200c-3p在心脏发育过程中的生物学功能,采用显微注射技术,将pma-miR-200c-3p模拟体注射到斑马鱼Danio rerio胚胎,过表达pma-miR-200c-3p后,使用qRT-PCR及Western blot法检测了一些与心脏发育相关的标志性基因的表达水平,以及BMP/Smad通路重要基因蛋白水平的变化,并利用生物信息学预测、GFP荧光表达分析了pma-miR-200c-3p的生物学作用。结果表明:过表达pma-miR-200c-3p的斑马鱼胚胎中,与心脏发育相关的标志性bmp4、bmp5、smad1、gata5、tbx2b和notch1a基因的表达水平极显著上调(P<0.01),同时BMP/Smad通路中BMP4、Smad1、GATA5蛋白表达水平也明显升高;细胞试验表明,cdx1b基因可能是pma-miR-200c-3p的一个靶基因。研究表明,pma-miR-200c-3p可能通过抑制cdx1b基因的表达,参与BMP/Smad通路以促进心脏发育。

转录因子Hand2在妊娠期糖尿病胎鼠心脏发育过程中的表达

目的:了解妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)母鼠胎鼠心脏发育过程中碱性螺旋-环-螺旋蛋白(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子Hand2表达的变化规律,探讨其在GDM胎鼠心脏发育异常中的作用机制。方法:114只成年雌性SD大鼠,空白对照组(n=24)、GDM组(n=30)、阴性对照组(n=30)及GDM+胰岛素干预组(n=30);空白对照组不予任何处理;GDM组腹腔注射2%链脲佐菌素(streptozotocin,STZ;每只40 mg/kg);阴性对照组腹腔注射等量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(STZ溶剂);GDM+胰岛素干预组在GDM建模成功后皮下注射中效胰岛素控制空腹血糖在正常范围。给药72 h后每天测血糖及体质量,各组分别于孕12 d(embryotic day 12,E12)、E15和E19剖取胎鼠心脏组织HE染色观察心脏组织病理变化,免疫组化检测Hand2蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测Hand2 mRNA的表达,Western blotting检测Hand2蛋白表达的变化。结果:各组Hand2蛋白的表达呈动态变化:E12可见表达,E15时表达增加,E19时Hand2蛋白表达最高,E12和E15 GDM组Hand2 mRNA及蛋白在胎鼠心肌细胞中的表达呈现下降趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:妊娠糖尿病母鼠其胎鼠心脏发育异常的发生率明显升高;Hand2 mRNA及蛋白在妊娠糖尿病胎鼠E12和E15心脏表达水平明显下降,提示与GDM胎鼠心脏发育异常相关。

探讨组蛋白乙酰化酶对心脏发育基因NKX2.5的动态调控作用

目的:探讨小鼠心脏发育过程中组蛋白乙酰化酶p300和p300/CBP辅助因子(PCAF)对心脏发育基因NKX2.5的动态调控作用,为进一步明确心脏发育的调控机制提供新的理论基础。方法:收集胚胎14.5 d、16.5 d及新生0.5 d和7 d的正常C57BL/6小鼠心脏,实验分为4组:胚胎14.5 d组(n=10)、胚胎16.5 d组(n=10)、新生0.5 d组(n=5)、新生7 d组(n=3)。采用染色质免疫共沉淀技术,运用抗p300、PCAF、组蛋白H3K9ac抗体沉淀与其相结合的脱氧核糖核酸(DNA)片段,实时荧光定量聚合酶链反应扩增抗体所富集的DNA片段来检测NKX2.5启动子区域p300和PCAF结合水平及H3K9ac乙酰化水平。此外,运用逆转录聚合酶链反应检测NKX2.5基因信使核糖核酸(mRNA)表达水平。结果:p300和PCAF结合水平在心脏发育的不同阶段均具有时序性:p300的结合水平在胚胎16.5 d组(0.063±0.021)、新生0.5 d组(0.019±0.008)、新生7 d组(0.011±0.003)均低于胚胎14.5 d组(0.231±0.033),且新生0.5d组和新生7 d组均低于胚胎16.5 d组,差异均有统计学意义(P均<0.05);PCAF结合水平在胚胎16.5 d组(0.063±0.021)、新生0.5 d组(0.019±0.008)、新生7 d组(0.011±0.003)均低于胚胎14.5 d组(0.185±0.023),差异均有统计学意义(P均<0.05)。H3K9ac乙酰化水平及NKX2.5基因mRNA表达水平在心脏发育的不同阶段均具有时序性:H3K9ac乙酰化水平在胚胎16.5 d组(0.098±0.014)、新生0.5 d组(0.074±0.010)、新生7 d组(0.045±0.014)均低于胚胎14.5 d组(0.119±0.020),且新生7 d组低于胚胎16.5 d组,差异均有统计学意义(P均<0.05);NKX2.5基因mRNA表达水平在胚胎16.5d组(0.701±0.181)、新生0.5 d组(0.502±0.159)、新生7 d组(0.529±0.131)均低于胚胎14.5 d组(1.000±0.130),差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论:组蛋白乙酰化酶p300和PCAF动态调控NKX2.5启动子区域H3K9ac乙酰化水平,且在小鼠心脏发育过程中NKX2.5 mRNA呈现动态表达。

纳米氧化锌暴露对斑马鱼胚胎心脏发育的毒性效应和机制研究

目的观察纳米氧化锌暴露对斑马鱼胚胎心脏发育及大鼠心肌细胞(H9c2)的毒性作用及可能机制。方法对纳米氧化锌材料进行表征化处理。斑马鱼胚胎在受精后4 h(4 hpf)暴露纳米氧化锌颗粒0.5,2.5,5.0和10.0 mg·L^(-1)24~96 h,计算胚胎存活率,并于胚胎17 hpf时间点,收集并用实时定量PCR测定中胚层脊索同源(noto),T盒16(tbx16),过短同源a(ta)和tbx6 m RNA表达;观察斑马鱼72 hpf心率。将心肌细胞标记红色荧光蛋白Tg(cmlc2:nuc-ds Red)的斑马鱼交配取胚胎,染毒纳米氧化锌2.5和5.0 mg·L^(-1),计数72 hpf胚胎心肌细胞数目。大鼠心肌细胞(H9c2)与纳米氧化锌0,0.1,0.5,1,5.0和10.0 mg·L^(-1)共培养24 h,Alamar Blue方法检测细胞活力,透射电子显微镜观察线粒体超微结构,化学发光法和Seahorse仪分别检测细胞ATP和耗氧率水平。结果纳米氧化锌在双蒸水中的粒径分布为(331±3)nm。48 hpf的斑马鱼胚胎纳米氧化锌LC50为21.81 mg·L^(-1)。暴露纳米氧化锌2.5 mg·L^(-1)后,17 hpf斑马鱼胚胎的心脏发育关键基因noto,ta和tbx6表达降低(P<0.05)。72 hpf斑马鱼暴露纳米氧化锌5.0 mg·L^(-1),心率为153 min-1,与正常对照组相比降低12.6%(P<0.01),心肌细胞数目减少15.5%(P<0.01)。纳米氧化锌0.5 mg·L^(-1)可引起大鼠心肌细胞(H9c2)细胞活力降低(P<0.05)以及线粒体出现空泡化现象。与细胞对照组相比,细胞ATP减少25.7%(P<0.05),耗氧率减少27.2%(P<0.01)。结论低剂量纳米氧化锌暴露对斑马鱼心脏发育有一定影响,主要表现为心率降低和心肌细胞数目减少,这些变化可能与心脏发育相关基因表达减少以及细胞线粒体结构和功能损伤有关。