猪水肿病大肠杆菌志贺样毒素Ⅱ型突变体新基因的分子特征

从仔猪水肿病样品中分离的一株大肠杆菌菌株NP96 2 1,抽提染色体DNA ,构建NP96 2 1的总DNA文库 ,经菌落原位杂交筛选、限制酶酶切和Southern印迹等分析 ,获得含有志贺样毒素基因的重组质粒 ,核苷酸序列分析表明 ,该基因的A亚基与SLT IIes的同源性为 97 6 %～ 98 1% ,与SLT IIc、SLT IId及EHECO15 7:H7产生的SLT II的A亚基之间的同源性分别为 93 1%、93 0 %和 92 9% ;B亚基与SLT IIes的同源性为 99 6 2 %～ 10 0 % ,与SLT IIc、SLT IId及SLT II的同源性分别为 81 5 %、81 1%和 81 5 % ;与 2 9种已知序列的SLT II、SLT I及志贺毒素STX进行聚类分析 ,结果证实大肠杆菌NP96 2 1菌株中的志贺样毒素基因属于一种新的SLT IIe亚型。SLT IIe NP96 2 1的A亚基与其它SLT IIe之间存在 7～ 9个氨基酸的差异 ,B亚基的氨基酸序列完全相同 ,与A亚基毒力活性密切相关的氨基酸分别为Thr4、Glu16 7、Arg170和Arg176。

贵州猪、牛志贺样毒素大肠杆菌的检出与鉴定

以两对合成的寡核苷酸引物 ,通过聚合酶链式反应 ,检测 158份猪和牛腹泻粪便分离物 ,从 8份猪源和 3份牛源分离物中扩增出大肠杆菌志贺样毒素基因片段 ,其生化试验符合大肠杆菌特征 ,经Vero细胞检测均产生志贺样毒素 ,血清学试验证实分属不同的血清型 。

突变减毒志贺样毒素Ⅰ真核表达载体的构建及其抗卵巢癌的活性

目的构建表达突变减毒的志贺样毒素Ⅰ(Shiga-liketoxin1,Stx1)的真核表达载体,并考察其抗人卵巢癌细胞SKOV3的活性。方法重叠PCR法构建毒性为原毒素毒性1/10和1/100的突变减毒Stx1编码序列,T-A克隆并测序后分别连入真核表达载体pcDNA3.1。转染SKOV3细胞,RT-PCR法检测Stx1mRNA在SKOV3细胞中的表达,观察突变减毒Stx1对SKOV3细胞周期的影响和致SKOV3细胞死亡的方式。使用SKOV3荷瘤裸鼠模型,不同毒性突变减毒Stx1真核表达载体经脂质体包裹后肿瘤局部注射给药,评价其体内抑瘤能力。结果突变减毒Stx1真核表达载体经酶切和测序鉴定与预期突变序列一致;RT-PCR证实转染后的SKOV3细胞中存在目的mRNA;体外实验观察到该载体转染可以使人卵巢癌SKOV3细胞的细胞周期阻滞于G2/M期,转染后SKOV3细胞死亡的主要途径是坏死;体内实验显示突变减毒Stx1真核表达载体可以抑制裸鼠体内SKOV3移植瘤的生长。结论通过重叠PCR方法获得2种突变减毒Stx1编码序列,成功构建了相应的真核表达载体,并证实该载体具有明显的抗卵巢癌活性。

猪水肿病志贺样毒素大肠杆菌的分离与鉴定

大肠杆菌产生的志贺样毒素Ⅱ型突变体(Shiga liketoxinvariant,SLTⅡv)是猪水肿病的主要致病因子。采用聚合酶链式反应,以特异的寡核苷酸片段为引物,从200份贵州省患水肿病猪粪样中检出19株菌株含有志贺样毒素Ⅱ型突变体基因,生化实验结果符合大肠埃希氏杆菌的特点。经鉴定,19株大肠杆菌分属于O8、O65、O82、O1394种血清型,其中O82占63%。研究结果证实,在贵州省猪水肿病中存在志贺样毒素基因。

产志贺样毒素且具侵袭力大肠杆菌(ESIEC)的调查研究

目的 为了解ESIEC易感人群、感染率、临床症状、分离率以及与其它致泻性大肠杆菌的区别。方法 选择 4个市级医院建立调查网 ,凡 1997年 6～ 11月在此医院就诊的腹泻患者 ,均进行流行病学调查并收集大便标本 ,检测常见的腹泻病原菌 ,若培养阴性而大肠杆菌呈优势者 ,对其表型特性、血清学进行检测 ,疑似菌应用DNA菌落原位杂交确定ESIEC。结果 6 71例腹泻病人中共检出 2 0个属种 44 9株致病菌 ,志贺菌检出率为 2 5 48% ,致泻性大肠杆菌为 15 0 5 % ,致泻性大肠杆菌中ESIEC居首位 (6 2 6 % )。采用Inv、SLT、irp 2、ipaB基因探针进行菌落原位杂交检出 42株ESIEC ,各年龄组均有感染者 ,发病率最高为 10岁以下儿童 (33 33 % )。结论 6 71例腹泻病人志贺菌引起的腹泻占首位 ,致泻性大肠杆菌次之 ;在致泻性大肠杆菌中以ESICE为主。

产志贺样毒素和肠毒素大肠杆菌分子流行病学(英文)

【目的】人和动物腹泻的主要病原菌为大肠杆菌,本文主要研究贵州省致腹泻大肠杆菌毒力因子的分布类型。【方法】采用PCR技术对各毒力因子的基因分布进行研究。【结果】共分离到333株大肠杆菌,其中产肠毒素大肠杆菌(ETEC)在腹泻的人、猪、牛群中占优势,分别为:人群73(n=112),猪群82(n=106),牛群18(n=115)。在ETEC菌株中检测到热敏肠毒素(lt)和不耐热肠毒素(st)基因,还存在lt/st并存现象。从人、猪、牛群中还检测到产志贺样毒素大肠杆菌(STEC),其中源自猪的STEC的检出率最高。大部分STEC同时携带lt、st或lt和st同时并存。编码F18菌毛的主亚基由fedA基因编码。对所分离大肠杆菌F18菌毛进行的研究结果表明,fedA基因主要与肠毒素基因共存,与stx基因并存的类型较少,25份猪源STEC菌株中仅有4份检测到fedA基因。【结论】贵州省人群、猪群和牛群致腹泻病原菌中以带F18菌毛的ETEC为主,STEC主要分布在腹泻的猪群中。

志贺样毒素Ⅱ型变异体B亚基单克隆抗体的制备

为建立针对仔猪水肿病SLT-Ⅱe毒素的检测方法,应用PCR技术克隆SLT-ⅡeB基因,并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术获得6株稳定分泌抗SLT-ⅡeB的单克隆抗体(McAb)细胞株,其抗体亚类包括IgM、IgA、IgG2b和IgG2a,而且轻链均为κ链。阻断ELISA结果显示,6株McAb均能特异性识别天然SLT-Ⅱe毒素。相加ELISA结果显示,3G7和4F3两株是针对不同抗原表位的McAb。

志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位及酶活性部位的基因缺失、突变株表达产物免疫生物学特性

重组志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位pGEX＿Ansp及其酶活性部位的基因缺失株pGEX＿Ade及突变株pGEX＿Amu转化的大肠杆菌经诱导后,表达产物经超声波裂解并滤过除菌。ICR小鼠腹腔注射三种重组质粒转化菌诱导后菌体裂解物的除菌滤液,以检验重组表达产物的毒性和免疫原性;在Vero细胞上检测重组菌表达产物对Vero细胞的半数致死量(CD50)及免疫鼠血清对SLT＿Ⅱe毒素的中和实验三方面来比较pGEX＿Ansp、pGEX＿Ade和pGEX＿Amu的生物学特性,结果表明这三种基因工程菌表达产物经腹腔注射后可以诱导机体产生一定程度的保护性抗体。在Vero细胞上,pGEX＿Ansp的表达产物可在一定程度上使Vero细胞产生细胞病变,pGEX＿Amu的表达产物可在一定程度上抑制Vero细胞单层形成时间,而pGEX＿Ade对Vero细胞的生长无影响。

突变减毒志贺样毒素Ⅰ真核表达载体的抗肿瘤血管活性

目的:考察突变减毒志贺样毒素Ⅰ(Shiga-like toxin 1,Stx1)真核表达载体抗肿瘤血管的活性。方法:使用流式细胞仪检测突变减毒Stx1真核表达载体转染对CHO细胞的影响;分别建立稳定表达1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1的CHO细胞株,使用这2个细胞株和对照细胞株的培养上清分别处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),观察其对HUVEC的增殖、迁移能力和形成管样结构能力的影响;使用人卵巢癌SKOV3荷瘤裸鼠模型,不同毒性突变减毒Stx1真核表达载体经脂质体包裹后肿瘤局部注射给药,观察突变减毒Stx1对肿瘤新生血管的作用。结果:突变减毒Stx1真核表达载体转染的CHO细胞未出现明显的凋亡或坏死改变;获得稳定表达1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1的基因工程细胞株,这些细胞株的培养上清与正常CHO细胞培养上清相比,能够在体外实验中抑制HUVEC的生长(P<0.05),且该作用可以被Stx1B亚基抗体阻断;突变减毒Stx1能够抑制HUVEC的迁移能力和管样结构形成能力;体内实验显示1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1真核表达载体治疗组与空载体对照组或生理盐水对照组相比,肿瘤微血管密度明显下降(P<0.01)。结论:成功建立了分泌性表达突变减毒Stx1的CHO细胞株。证实突变减毒Stx1能够有效地抑制HUVEC的生长及正常功能的发挥。体内实验显示突变减毒Stx1真核表达载体可以抑制裸鼠体内SKOV3移植瘤的血管生成。

产生志贺样毒素的噬菌体φ297整合酶基因(int)的克隆和序列分析

目的 :克隆并分析细菌性噬菌体 φ2 97的整合酶基因 (int)。方法 :采用加接头的基因DNA片断为模板进行步移PCR ,根据溶源性噬菌体 φ2 97的染色体DNA上类似于噬菌体 933W的整合酶基因的一个 40个核苷酸设计引物 ,进行扩增、克隆、亚克隆、测序和序列分析。结果 :得到了噬菌体 φ2 97编码的整合酶基因 (int)的完整序列 ,它的长度是 1 2 87bp ,编码了 42 8个氨基酸的Int蛋白质。将它们的序列与λ噬菌体的整合酶家族其它成员进行了比较 ,发现噬菌体 φ2 97的整合酶基因 (int)与噬菌体VT1 Sakai的整合酶基因有 79%的同源性 ,噬菌体 φ2 97的Int蛋白与噬菌体VT1 Sakai的Int蛋白在氨基酸序列上有 82 %的同源性。N 末端的氨基酸区域是完全保守的 ,而中心区和C 末端则显示出较大差异。结论 :噬菌体 φ2 97与λ噬菌体的int基因来源于同一基因库 ,噬菌体 φ2 97可能属于λ噬菌体家族。

抗重组志贺样毒素ⅡA亚单位单链抗体的构建及表达

目的构建重组志贺样毒素ⅡA亚单位(SLT2A)单链抗体基因(scFv),并在大肠杆菌中进行分泌表达。方法通过连接肽(Gly4Ser)3将已成功扩增的抗SLT2A单克隆抗体(mAb)5F3的VL和VH连接成scFv基因VHLinkerVL,并在VH基因5′端和VL基因3′端引入SfiⅠ和NotⅠ的酶切位点,克隆至经改造的分泌性表达载体pCANTAB6His中,转化EcoliHB2151,IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析纯化后,SDSPAGE和Westernblot分析鉴定。结果经限制性酶切鉴定及DNA测序分析证实,基因构建正确。SDSPAGE和Westernblot分析表明scFv基因在大肠杆菌中得到表达,表达产物的相对分子质量为27000,与理论预期值相符,且可与相应抗原特异结合。结论成功地实现了抗SLT2AscFv基因的原核分泌表达,为探讨O157菌感染的机制及防治研究奠定了基础。

Ⅱ型志贺样毒素B亚单位的重组表达及其受体结合活性

目的:在大肠杆菌中重组表达Ⅱ型志贺样毒素B亚单位(Stx2B),并对其表达形式和受体结合活性进行分析。方法:PCR方法从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7中钓取Stx2B编码基因,利用基因克隆技术构建重组大肠杆菌pET-stx2B/BL21,IPTG诱导目的蛋白高效表达并对表达的包涵体进行变性和复性处理,离子交换层析纯化蛋白。通过SDS-PAGE变性和非变形蛋白电泳,分析重组Stx2B的表达形式,并利用Hela细胞结合模型,评价重组Stx2B与细胞受体的结合活性。结果:构建的重组大肠杆菌pET-stx2B/BL21能高效表达Stx2B,经变性、复性及离子交换层析操作,获得高纯度的目的蛋白。SDS-PAGE变性和非变形蛋白电泳分析显示,重组Stx2B以二聚体形式存在,单体之间通过二硫键相连。细胞结合试验显示,重组Stx2B与Hela细胞具有特异结合活性。结论:成功构建表达Stx2B的基因工程菌,Stx2B的受体结合活性不依赖于五聚体形式。

产志贺样毒素大肠埃希菌Ⅰ类整合子的鉴定和分析

目的阐明各种来源的产志贺样毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producingE.coli,STEC)中Ⅰ类耐药整合子的分布、特征、所含基因盒的状况以及所表达的耐药信息。方法常规分离出大肠埃希菌、血清学分型,PCR法鉴定产stx1-2毒素性菌株;纸片扩散法对17种抗菌药物进行耐药性监测和分析;PCR法鉴定Ⅰ类整合子阳性株;PCR产物测序并对结果进行分析。结果各种标本中共鉴定出46株产志贺样毒素大肠埃希菌,其中23株为O157∶H7;全部STEC对复方新诺明耐药,对链霉素耐药率为28.3%,氨苄西林为30.4%,而且有5株对至少>4种抗菌药物多重耐药,耐药谱为复方新诺明-链霉素-氨苄西林-庆大霉素;46株分离株中有11株(23.9%)鉴定出Ⅰ类整合子,PCR产物测序得知9株携带aadA1基因盒,2株携带aadA2基因盒,均来自氨基糖苷类抗菌药物耐药菌株(39.3%),传递对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性。结论Ⅰ类整合子存在于各种来源的产志贺样毒素大肠埃希菌中,并携带相应的基因盒,决定着对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性。

肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希氏菌和肠侵袭性大肠埃希氏菌的侵袭基因比较

目的比较肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希氏菌（Ｅｎｔｅｒｏ－ＳＬＴｓ－ＰｒｏｄｕｃｉｎｇａｎｄＩｎｖａｓｉｖｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ－ｉ，ＥＳＩＥＣ）和肠侵袭性大肠埃希氏菌的侵袭基因，阐明它们之间的异同。方法使用质粒酶切图谱分析，侵袭性基因ｉｐａＢ、ｉ－ｐａＣ、ｉｐａＤ的ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交实验，以及利用ＥＩＥＣ８４０１菌株的侵袭性大质粒酶切产物作为探针与ＥＳＩＥＣ大质粒进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交等方法。结果发现ＥＳＩＥＣ菌株不具有ＥＩＥＣ、志贺氏菌所特有的ｉｐａＢ、ｉｐａＣ、ｉｐａＤ基因；ＥＳＩＥＣ菌株质粒与ＥＩＥＣ、志贺氏菌质粒同源性很小。结论ＥＳＩＥＣ菌株编码侵袭力的基因与ＥＩＥＣ及志贺氏菌的侵袭基因是完全不同的，证明对ＥＳＩＥＣ的分类是正确的。

大肠杆菌志贺样毒素Ⅱ型基因的分子克隆

本文克隆了含大肠杆菌志贺样毒素Ⅱ型基因的2 0kbSau3AI酶切片断,对插入片段进行了核苷酸序列测定,1298bp的核苷酸序列包含2个完整的开放读框,其中SLTIIA亚基基因编码区长957bp,编码319个氨基酸多肽,SLTIIB亚基基因编码区长267bp,编码89个氨基酸多肽,与已知人源的SLTII基因核苷酸序列比较具有99%的同源性,与SLTI结构基因相比,A亚基同源序列为56 43%,B亚基为60 15%。

肠出血性大肠杆菌O157：H7志贺样毒素2B亚基的表达

目的:克隆肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 AH07株志贺样毒素2B(Stx2B)亚单位基因,应用原核表达系统制备重组蛋白质。方法:根据靶基因序列设计特异性寡核苷酸引物,采用PCR法克隆EHEC AH07株Stx2B的编码基因stx2b,靶基因经TA克隆后连接到表达载体pET-28a构建重组质粒,阳性重组子转化表达宿主菌E.coliBL-21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,应用SDS-PAGE和Western-blot(WB)分析重组蛋白生物活性。结果:PCR扩增stx2b基因约220 bp,成功构建重组质粒pET28a-stx2b,并在原核细胞中得到高效表达,目的蛋白质的相对分子质量约为7500,约占蛋白质总量的40%;WB显示目的蛋白质可与特异性抗体发生特异性反应。结论:成功克隆EHEC O157∶H7stx2b基因,在原核系统获得目的蛋白质的高效表达,为O157∶H7感染机制及疾病诊断和疫苗研究奠定基础。

第一讲O157∶H7大肠杆菌和志贺样毒素

第一讲Ｏ１５７∶Ｈ７大肠杆菌和志贺样毒素中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所（１０２２０６）徐建国１９９６年５～８月份在日本这个号称是世界最干净的国家里发生了世界上最大的Ｏ１５７∶Ｈ７大肠杆菌引起的暴发流行，先后历时近３个月，波及３０多个都府县，...

志贺样毒素与动物的大肠杆菌病

志贺样毒素与动物的大肠杆菌病高崧，张如宽（审校）（江苏农学院扬州２２５００９）人医中，除产肠毒素性大肠埃希氏菌（ＥＴＥＣ）外，肠致病性大肠杆菌（ＥＰＥＣ）的研究已相当深入（林万明１９９１）．ＥＰＥＣ中有一亚群可产生对Ｖｅｒｏ细胞有致死作用的细胞毒素，...