怀菊花茎叶中聚炔类化合物对ox-LDL诱导的HUVECs细胞损伤的保护作用

研究怀菊花茎叶中分离得到的聚炔类化合物对氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)损伤的保护作用及初步探讨作用机制。采用ox-LDL(200μg/mL)处理HUVECs细胞建立内皮细胞损伤模型,同时给予聚炔类化合物1~10(100μg/mL)干预;通过CCK-8法检测细胞生存率,筛选出有细胞保护作用的目标化合物;采用目标化合物5和9(12.5、25、50、100μg/mL)干预细胞24 h,CCK-8检测细胞生存率,采用流式细胞术检测细胞凋亡率和活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成率,酶联免疫(ELISA)检测细胞上清液中白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量;细胞免疫印迹法(In-Cell Western)检测细胞中核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)2p100/p52与NF-κBp65蛋白的相对表达水平。结果显示:与正常对照组(Con)相比,模型组(ox-LDL)中的细胞生存率明显下降,细胞凋亡率、ROS生成,炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α明显升高(P<0.01);与ox-LDL组相比,聚炔类化合物5和9可以明显提高HUVECs细胞的生存率、降低细胞凋亡率、ROS生成率,炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α的分泌(P<0.05或P<0.01),下调NF-κB2 p100/p52、NF-κB p65蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。综上所述,怀菊花茎叶中聚炔苷类成分可以改善ox-LDL诱导的HUVECs细胞损伤与功能障碍,其作用机制可能与NF-κB信号通路相关。

基于GC-MS和化学计量学的怀菊不同部位挥发性成分差异分析

目的 通过对怀菊不同部位(花、茎、叶)挥发性成分进行分析鉴定,为怀菊资源综合利用奠定理论基础。方法 采用水蒸气蒸馏法分别提取不同批次怀菊不同部位中的挥发油,运用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对其组成成分进行分析,通过谱库检索、文献查询等方式鉴定分析化合物,采用面积归一化法得到各化合物的相对百分含量,采用韦恩图、主成分分析和聚类热图分析其成分的差异。结果 从怀菊不同部位共鉴定出62个挥发性成分,主要是单萜和倍半萜及其衍生物,以及少量脂肪族化合物。花、茎和叶中分别鉴定出32、42和40个挥发性成分,共有成分17个,特有成分分别为5、6和16个。化学计量学方法分析结果表明,主成分分析和聚类热图分析均能将怀菊花、茎和叶分开,其挥发性成分具有差异性。结论 怀菊花、茎和叶中挥发性成分的种类和含量有一定的差异性,这为怀菊不同部位进一步药用或工业开发提供科学依据。

怀菊花及其茎叶脂溶性成分GC-MS分析及其抗氧化活性研究

目的比较怀菊花和怀菊茎叶脂溶性成分组成及其抗氧化能力。方法采用索氏提取法获得怀菊花和怀菊茎叶的脂溶性成分,运用气相色谱-质谱联用(GC-MS)进行分析测定,结合质谱库检索技术对化合物进行结构鉴定,应用色谱峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量,并采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法测定其抗氧化活性。结果从怀菊花和怀菊茎叶共鉴定出69种成分,各鉴定出56、37个化合物,共有成分24种,分别占其脂溶性成分含量的50.56%和81.78%,同时抗氧化结果显示,怀菊花和怀菊茎叶的脂溶性成分对DPPH自由基的半数清除率IC50分别为9.76和7.96mg/mL。结论怀菊花和怀菊茎叶的脂溶性成分及其相对百分含量存在一定的相似性和差异性,且其脂溶性成分均具有一定的抗氧化活性。本研究为怀菊花整株资源的综合有效利用提供科学依据。

土壤因子对怀菊质量影响研究

目的:研究土壤因子对怀菊内在质量的影响。方法:分别测定河南温县、江苏南京和浙江桐乡三地怀菊样品中绿原酸、总黄酮和微量元素的含量,并分析相应土壤的理化性质,测定矿质元素含量,通过相关分析和通径分析研究土壤环境对怀菊内在质量的影响。结果与结论:结果表明三地怀菊内在质量差异显著,土壤因子对怀菊内化学成分含量有很大的影响,其中直接作用较大的依次是脲酶活性、速效钾、CEC和速效磷的含量,而且其微量元素与土壤矿质元素有很好的相关性,其中怀菊对土壤中镁、砷的富集能力较强。

怀菊花期次生代谢物含量及同功酶活性动态变化研究

目的:研究怀菊花期次生代谢产物的合成代谢规律及同工酶活性的动态变化。方法:测定怀菊花期总黄酮、绿原酸、花青苷的含量,以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)的活性。结果与结论:怀菊花期各指标均呈先升高后下降的变化趋势,但高峰值出现的时间不同,总黄酮和绿原酸的高峰值出现在花开70%时,花青苷含量于花开50%时达到最高,PPO活性则在花开30%时最高,且2个栽培类型的变化趋势一致;PAL和POD的变化趋势因栽培类型的变化而有一定的差异,怀大白菊中PAL和POD活性在花开70%和30%时最高,而怀小白菊中则出现在花开50%。

气象因子对怀菊品质影响分析

目的:研究气象因子对怀菊品质的影响,为保证和提高药用菊花内在质量提供依据。方法:以水溶性浸出物、可溶性糖、蛋白质、总黄酮和绿原酸为指标,分别测定河南温县、江苏南京和浙江桐乡三地怀菊的含量,并搜集相应的气象资料,通过相关分析和通径分析研究气象因子对怀菊品质的影响。结果与结论:三地怀菊除可溶性糖含量没有明显差异外,其他指标成分含量均有明显差异,而且各气象因子对怀菊品质均有一定的影响,日照、温度、降水对其有较大的影响,其中对总黄酮和绿原酸直接作用最大的分别是年日照总数和10 cm地温。

响应面法优化怀菊水溶性总多酚的超声提取工艺

对怀菊中水溶性总多酚的超声辅助提取工艺进行了优化。以水作提取剂,在单因素实验的基础上选择超声功率、超声时间、液料比3个因素为自变量,以怀菊中总多酚的得率为响应值,进行中心组合设计(CCD),采用响应面法优化了怀菊总多酚的提取工艺。结果表明,超声辅助提取怀菊中总多酚的最佳工艺条件为:超声功率225 W,超声处理时间为40 min,液料比23.5∶1(m L/g)。在此工艺条件下,总多酚的得率高达76.53 mg/g。该实验结果能够为怀菊中水溶性多酚提取工艺的进一步放大提供科学依据和理论参考。

杭菊和怀菊主要功能成分的比较

[目的]对2种不同产地菊花中的天然活性物质进行探索性研究,以期为菊花的开发利用提供理论依据。[方法]采用HPLC法和紫外分光光度计法测定2种不同产地菊花中活性物质的含量。[结果]杭菊和怀菊的绿原酸含量的绿原酸含量分别为3.44±0.17、6.74±0.20(DW)mg/g,RSD值分别为4.87%、2.97%;杭菊和怀菊的游离氨基酸总量分别为50.54±0.27、46.28±1.55(DW)mg/g,RSD值分别为0.53%、3.34%;杭菊和怀菊的总糖含量分别为195.24±1.65、161.95±2.61(DW)mg/g,RSD值分别为0.84%、1.61%。[结论]该研究比较分析了2种不同产地菊花主要功能成分的含量差异,为菊花的开发利用提供了理论依据。

三种开封观赏菊与怀菊中总黄酮的含量比较

目的研究菊中总黄酮的最佳提取工艺及其在不同品种和部位中含量的差异。方法以紫外分光光度法测定总黄酮的含量为指标,首先对微波法和超声波法提取工艺进行比较,考察提取方法对菊花中总黄酮提取率的影响;并采用最佳的提取方法,研究比较三种开封观赏菊花与药用怀菊花以及大立菊的花、茎、叶中总黄酮含量的差异。结果超声波法提取效率较高,最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数为80%,料液比（质量与体积比）为1∶25,提取时间为30 min。总黄酮质量浓度在20~70 mg·L-1内,线性关系良好,平均加样回收率为97.5%,RSD为1.81%;三种开封观赏菊花中紫悬崖菊的花中总黄酮含量最高,大立菊的花中黄酮含量最低,且均高于怀菊的花中总黄酮含量;其中大立菊的花中的黄酮含量最高,叶中的黄酮含量次之,茎中的黄酮含量最低。结论超声波法提取效率高、稳定性好,可作为菊中总黄酮的最佳提取方法。紫外分光光度法测定总黄酮的含量测定方法简单快速、准确可靠、稳定性好,为观赏性菊的质量控制研究提供参考。

怀菊花茎叶中酚类化学成分研究

目的:研究怀菊花Chrysanthemum morifolium Ramat.茎叶的化学成分。方法:怀菊花茎叶的50%丙酮提取物采用Toyopearl HW-40、Diaion HP-20、Sephadex LH-20、ODS、半制备HPLC等方法进行分离纯化,根据波谱数据鉴定所得化合物的结构。结果:从怀菊花茎叶中分离得到12个酚类成分,分别鉴定为:大豆素(1)、apigenin-6-C-α-arabinoside-8-C-β-glucoside(2)、3′-甲氧基大豆苷元(3)、猫眼草酚D(4)、高北美圣草素(5)、5,3′,4′-三羟基-6,7,5′-三甲氧基黄酮(6)、1-O-(E)-4-methoxybenzoyl-β-D-glucopyranose(7)、3-(4′-羟基-3′-甲氧基苯基)-1-丙醇(8)、3,5-二羟基-4-甲氧基-苯甲酸甲酯(9)、isoaurostatin(10)、5,7-二羟基色原酮(11)、3,3′-methylene-bis(4-hydroxybenzaldehyde)(12)。结论:以上化合物均为首次从该植物中分离得到。

怀菊不同部位无机元素含量测定

用原子吸收光谱仪分别测定了河南温县产怀菊的花、茎、叶中12种无机元素的含量。发现花、茎、叶中均富含Ca、Mg及多种人体必需微量元素，尤其是Mo含量，叶、茎中达100μg／g以上，高出花25倍；Mn含量，叶中为112μg／g，高出花近4倍。

响应面法在超声提取怀菊总黄酮条件优化中的应用

目的研究超声法提取怀菊中总黄酮的优化工艺。方法利用响应面法,分析怀菊和乙醇的料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间和提取次数对怀菊提取物中总黄酮含量的影响,得出最佳参数组合并建立多元回归模型。结果最佳提取工艺为:怀菊与乙醇的料液比1∶14、乙醇浓度65%、置于55℃下的恒温超声仪中提取3次。结论响应面法可以用于怀菊总黄酮提取条件的优化。

怀菊快繁体系及组培苗分级标准的建立

以怀菊叶片为试材,采用正交设计方法,研究了怀菊的快繁体系,以期在继代培养后,确定株高和地茎为最终分级的量化指标。结果表明:最佳灭菌方案为0.1%升汞处理3min;不定芽诱导的最佳培养基为MS+2.0mg·L^(-1)6-BA+0.1 mg·L^(-1)NAA+20g·L^(-1)蔗糖,其诱导率达到88%;最佳生根培养基为1/2MS+0.1mg·L^(-1)IBA,其生根率为100%;通过聚类分析将怀菊组培苗分为Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级苗,Ⅰ级组培苗的等级标准为株高≥5cm、地茎≥1.16mm,共23株;Ⅱ级组培苗为4cm≤株高<5cm、1mm≤地茎<1.16mm,共40株;Ⅲ级组培苗为1cm≤株高<4cm、地茎<1mm,共17株,符合正态分布。该研究为怀菊规范化种植以及种苗制定通用标准时提供参考依据。

底肥种类和种植密度对“怀菊2号”生长发育、品质及产量的影响

目的:为确定“怀菊2号”(豫中药品鉴2016002)新品种种植的最佳底肥种类和种植密度,建立其良种良法配套栽培措施。方法:以随机区组试验的方法,设置复合肥(CF)、功能性生物有机肥(OF)和混合肥(MF,复合肥∶有机肥=1∶1)三种底肥,3500株/667 m^(2)、4000株/667 m^(2)、4500株/667 m^(2)、5000株/667 m^(2)4个种植密度,探究底肥种类和种植密度对“怀菊2号”生长发育、品质及产量的影响。结果:底肥种类对“怀菊2号”花朵的总活性成分含量无显著影响,但与CF和MF相比,施用OF的“怀菊2号”植株株高、冠幅显著增大,植株生长发育最佳,产量显著提高;种植密度对“怀菊2号”花朵的总活性成分含量无显著影响,但与3500株/667 m^(2)、4500株/667 m^(2)和5000株/667 m^(2)相比,4000株/667 m^(2)的种植密度对于“怀菊2号”的生长发育具有良好效果,其产量和Ⅰ级花比率均较高。结论:怀菊花优良品种“怀菊2号”在4000株/667 m^(2)的种植密度条件下,施用功能性生物有机肥作为底肥可获得高产优质。

怀菊总黄酮提取工艺优化及不同花期总黄酮积累规律研究

目的:筛选怀菊中总黄酮提取的最佳工艺,探讨不同开花时期总黄酮积累规律。方法:以总黄酮量为指标,采用单因素试验和正交设计试验优化怀菊中总黄酮提取的最佳工艺。结果:怀菊中总黄酮最佳提取工艺为:料液比1∶100,乙醇浓度80%,超声时间40min,超声功率105W;不同开花时期总黄酮在盛花期时有一个显著增加趋势。结论:该提取工艺成熟、简单、可靠,测定结果稳定,可为怀菊进一步开发利用奠定基础。

怀菊转录组中SSR位点信息分析

以转录组测序数据为基础,利用MISA软件对简单重复序列(simple sequence repeat,简称SSR)进行检测及分析,分析怀菊转录组中的SSR位点信息,并设计SSR引物,为后期SSR标记的开发和物种遗传多样性检测等提供参考。结果表明,共检测到8553个SSR位点,它们分布在7369条Unigene中,出现频率为2.83%,SSR位点的发生频率为2.44%;其中单核苷酸重复基序最多、其次为三核苷酸重复基序。怀菊转录组基序长度主要集中于12~19 bp,多具有中等多态性。对SSR序列设计引物,共得到25662对引物可供今后使用。总之,怀菊SSR位点类型丰富,具有良好的多态性潜力及可开发性。

怀菊转录组分析及木犀草苷合成关键酶基因的挖掘

目的:对怀菊进行转录组学分析,探索木犀草苷合成的关键酶基因。方法:采用Illumina Hiseq Xten对怀菊离体培养阶段的愈伤组织、芽点、幼苗进行转录组测序,通过生物信息学分析,探索怀菊生长发育过程的整个转录水平调控情况及木犀草苷合成的关键酶基因。结果:经过测序质量控制,共得到83.67 Gb Clean Data,Trinity组装共得到302 379条Unigene,Unigene的总长度为164 773 301。将Unigene序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG 4.5、KEGG数据库比对,获得130 966条Unigene的注释信息。筛选出9条PAL序列、5条CHS序列、4条CHI序列。对组织培养阶段黄酮合成途径相关的基因表达量进行统计分析,从中筛选出13条与木犀草苷含量变化趋势一致的基因。结论:分析怀菊转录组数据有利于探索木犀草苷的生物合成机制,可为之后通过分子技术调控关键酶基因提高菊花中木犀草苷的含量、提高怀菊的品质提供参考。

怀菊不同部位内生细菌多样性分析

为探究怀菊不同部位内生细菌群落多样性及分布情况,本文应用Illumina Miseq高通量测序技术,分析怀菊茎、叶、花内生细菌高通量测序质控后有效序列数目有差异,分别聚成54、54和51个OTUs。菊花不同部位多样性指数中的Shannon指数花>茎>叶、Simpson指数叶>茎>花,Streptophyta属为内生细菌的优势菌属。证明怀菊不同部位内生细菌的菌群组成及分布存在一定差异。

怀菊不同部位中8种黄酮含量比较

目的测定怀菊花、茎、叶中芹菜素、金合欢素、香叶木素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、香叶木素、木犀草素、金合欢素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。方法HPLC法测定58批药材中各黄酮含量,再进行层次聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘判别分析。结果8种黄酮在各部位中均有检出,其含量存在差异,总体上依次为花>叶>茎,香叶木素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为差异性成分。结论怀菊花、茎、叶中均含有黄酮,在以前者为主原料的同时应加大后两者的开发利用,以期充分提高该药材经济效益。