恙虫病东方体混合重组抗原应用于胶体金免疫层析试纸条的制备及效价检测

胶体金免疫层析试纸条具有携带方便、操作简单且敏感性、特异性高等特点,近年来开始广泛应用于疾病的诊断。为了实现对恙虫病的快速检测,笔者利用双抗原夹心法,以胶体金标记恙虫病东方体56 kDa混合重组蛋白,56 kDa混合重组蛋白和兔抗恙虫病东方体多克隆抗体分别喷在检测线及质控线上,制备了用于检测恙虫病东方体抗体的胶体金免疫层析试纸条。本研究制备的胶体金试纸条检测限为61 ng/mL,和疟疾、伤寒、血吸虫、出血热以及斑点热等阳性血清无交叉反应,特异性达90%(54/60),检测的敏感性为91.96%(103/112),在4℃下可稳定保存6个月。本试纸条能够应用于人体血清中恙虫病东方体总抗体的检测。

安徽三界地区啮齿动物感染恙虫病东方体调查

目的调查安徽三界地区啮齿动物自然感染恙虫病东方体分离株,并确定其基因型别。方法流行季节在野外用鼠笼捕鼠并鉴定鼠种、携螨率;巢式PCR对鼠脏器进行恙虫病东方体56 kD基因片段检测;将鼠脏器接种小白鼠进行病原体分离,PCR扩增分离株Ot 56 kD基因片段,并将目的片段进行测序,基因序列同源性及进化分析。结果捕获啮齿动物数及其携螨率,黑线姬鼠60%(15/25);褐家鼠45.5%(5/11);东方田鼠和鼩鼱各2只,均阴性。40只野鼠脏器有3只恙虫病东方体PCR扩增阳性,阳性率为7.5%;从黑线姬鼠标本中分离到1株恙虫病东方体Sanjie,56 kD基因片段测定该株与台湾TT0711a和NT0511b分离株同源性最高(98%),系统发生树分析也显示与Kawasaki型共处于同一分支。结论安徽三界地区存在鼠类恙虫病东方体自然感染,黑线姬鼠为其主要宿主,当地恙虫病东方体属Kawasaki基因型。

实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999)。荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性。用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现最早和检出量最多,肝脏和肺脏次之。血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度。

山东省泰安市鼠类自然感染恙虫病东方体调查

目的了解山东省泰安地区鼠类自然感染恙虫病东方体(Ot)的情况。方法应用巢式PCR对山东省泰安地区采集的鼠类标本Ot-Sta56kDa基因片段进行检测,对阳性标本进行序列分析。结果在泰安地区秋冬季共捕获鼠类68只,阳性率为5.88%;不同鼠种间阳性率差异无统计学意义(Fisherχ2=4.714,P=0.062)。其中3只鼠胚胎标本均未检出Ot。序列同源性分析显示,2只鼠脾标本(08P,53P)的核苷酸序列与Sdu-1型的核苷酸序列同源性最高,为99.77%;其次,与Taguchi和Oishi型的同源性均为95.98%,与Kanda和Kawasaki型的同源性均为95.74%。而另2只鼠类标本(55P,56P)的核苷酸序列与TA686型的同源性最高,分别为86.27%和77.11%。系统发生树分析也显示,08P和53P与Sdu-1型在同一分支,它们又与Kawasaki、Kanda、Taguchi和Oishi型共处于同一分支;而55P和56P与TA686型在同一分支。结论山东省泰安地区鼠类存在Ot自然感染。该地区Ot的基因型较为复杂,不仅存在与临沂地区相同的Ot型,该型与日本的Kawasaki型相似;同时还存在与泰国的TA686型相似的Ot型。

基于GroEL基因的实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体方法的建立及评价

目的建立一种敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,用于检测临床标本中的恙虫病东方体。方法根据恙虫病东方体GroEL蛋白基因序列设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。并从灵敏度、特异度、重复性及临床标本的检测能力等方面对本方法进行综合评价。结果建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性,可检测出恙虫病东方体Gilliam、Karp、Kato和Kawasaki株。建立的标准曲线循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈现良好的线性关系(r=0.99),灵敏度分析显示样品最低检出浓度为21.8拷贝/μL。批内及批间重复性实验变异系数均小于1.5%,显示本方法具有良好的重复性。对本实验室保存的82份临床标本进行检测,并与常规巢式PCR方法比较,本方法检测出26份阳性标本中的25份,检出率为96.15%。结论本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可用于临床病人及暴发疫情的实验室快速检测。

恙虫病东方体Karp株核酸疫苗的构建及其免疫功能初步研究

目的构建恙虫病东方体Karp株Sta56抗原候选核酸疫苗并初步探讨其可能诱导的免疫功能。方法从连有恙虫病东方体Karp株编码56000u表膜蛋白基因开放读码框全长的T载体质粒pMD18/Sta56中双酶切出目的基因,定向亚克隆构建核酸疫苗质粒载体pVAX1-Sta56,转染Hela细胞,WesternBlot分析Sta56蛋白的表达及其免疫原性,转染L929细胞,接种恙虫病东方体,Giemsa染色细胞内恙虫病东方体数目比较,初步探讨pVAX1-Sta56可能诱导的细胞免疫现象。结果pVAX1-Sta56连有正确读码框架的Sta56全长基因。转染有pVAX1-Sta56的Hela细胞培养上清可检测到被兔抗恙虫病东方体Karp株抗血清识别的特异条带。转染有pVAX1-Sta56的L929细胞内恙虫病东方体数目显著少于转染pVAX1的L929细胞(P<0.01)。结论成功构建能够表达Sta56表膜蛋白抗原的核酸疫苗载体pVAX1-Sta56,并能诱导产生细胞免疫功能。

广东省重要岛屿恙虫病东方体血清流行病学调查

目的在广东省5岛屿开展恙虫病东方体血清流行病学调查并进行血清分型,为制定恙虫病防治策略提供依据。方法1998年5月～2003年8月在广东省南澎列岛、南澳岛、万山群岛、硇洲岛和雷州半岛等岛屿采集驻岛官兵、居民及啮齿动物血清,采用免疫荧光法检测抗体并进行血清学分型。结果687份人血清中抗恙虫病抗体阳性95份,阳性率13.83%,其中岛屿居民抗体阳性率为26.91%,军人为3.63%,差异有统计学意义(P<0.05)。检测508份鼠血清,抗恙虫病东方体抗体阳性率为57.87%,其中褐家鼠为有时鼠种。恙虫病东方体血清型以Karp株为主,占50.90%。结论广东省5岛屿均为恙虫病疫源地,恙虫病东方体血清型以Karp株为主。

新疆博乐地区恙虫病东方体自然疫源地调查

目的调查新疆博乐地区恙虫病东方体自然疫源地情况。方法采用捕鼠取脾,鼠体表捕螨,当地牧民静脉取血等收集样本,用试剂盒提取样本DNA,应用巢式PCR(nPCR)检测东方体基因(Sta56)。结果在博乐地区平原湿地区捕鼠126只,其中7只nPCR检测为阳性(阳性率5.55%);从当地牧民300份血液中nPCR检测6份为阳性(阳性率2.0%);野鼠体表带螨率为8.4%,从捕获博乐纤恙螨中nPCR检出阳性。DNA序列分析表明,鼠类、人血及恙螨中检出的基因序列相同,与东方体Karp株Sta56基因序列同源性为99%。在山地草原捕获鼠58只和捕获旱獭26只,nPCR检测其样本均为阴性,从鼠体表未捕获到恙螨。结论新疆博乐地区平原湿地存在恙虫病东方体自然疫源地,小家鼠、普通仓鼠、大沙土鼠为其宿主动物,纤恙螨为当地恙虫病的传播媒介。

汉坦病毒和恙虫病东方体复合感染的实验研究

目的了解汉坦病毒(HV)和恙虫病东方体(Ot)在宿主体内能否共生及其共生特征。方法采用HV和Ot先后交替、重复感染实验鼠,20 d后取鼠脏器切片和刮片用IFAT和Giemsa染色观察其感染率和脏器分布;并用Vero-E6细胞体外培养法研究HV、Ot在宿主细胞内的共生特征。用RT-PCR和PCR进行基因鉴定。结果HV和Ot先后交替、重复感染的各组实验鼠中,均可发现两种病原体的复合感染,其中HV和Ot单纯感染组的阳性率均显著高于HV、Ot先后和同时感染组。5组感染Vero-E6细胞培养检测结果发现:先后、同时和单纯实验感染的5组细胞中,HV和Ot先后、同时接种感染组在细胞传至第3代时检测均见有HV和Ot的双重感染,阳性率随传代次数增加而增加。而HV和Ot单纯分别感染组细胞传第2代时即可检测到HV和Ot,阳性率亦随传代次数的增加而增加。在传代培养中单纯感染组的阳性率均显著高于先后和同时感染组。用PCR和RT-PCR进行了基因鉴定得到一致的结果。结论研究结果提示HV和Ot可重复感染宿主动物,在同一宿主细胞内的感染初期有相互抑制作用,这对HV和Ot的流行病学有一定的理论意义。

实时荧光定量PCR技术的优化及其在恙虫病东方体诊断中的应用

目的建立一种优化的实时荧光定量PCR技术,并用于诊断粤北山区恙虫病东方体(Ot)基因型。方法采用优化实时荧光定量PCR技术对感染Ot的患者和鼠类的血液和组织标本检测Ot DNA载量并分析其基因型,并与未优化实时荧光定量PCR和巢式PCR的检测结果进行比较。结果采用优化实时荧光定量PCR技术检测660例发热患者,有224例检测到Ot,其中108例是发热5d内的早期患恙虫病患者,以及在55份鼠类的标本中有12份能检测到感染Ot,均为Gilliam型;未优化实时荧光定量PCR在患病7d以上才能检测到Ot。同时,在鼠类基因扩增片段还显示出与Gilliam、Karp、Kato3株国际参考株不同,经巢式PCR分型证实为Kawasaki型,与巢式PCR基因分型的结果相符。结论优化实时荧光定量PCR技术可作为早期诊断恙虫病的实验方法,用于快速分析Ot基因型,适合在基层医院推广应用。

应用PCR/RFLP对辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株的基因型分析

目的 鉴定辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株的基因型。方法 采用 PCR/ RFL P技术对辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株的 sta5 6目的基因进行分析研究 ,并与国际参考株进行比较。结果 辽宁、吉林地区 6株分离株的 PCR特异性产物经 Hinf 、Hha 、Rsa 酶切后呈现 2种不同的 RFL P图谱 :HCAa92 0 2株、HCAp92 0 3株及 HCM95 0 1株与 Gilliam参考株具有相似的酶切图谱 ,但缺乏 Hinf 的酶切位点 ;KDCt940 2株、KDCp940 3株及 KDCt940 4株与 Karp参考株具有相同的酶切图谱。结论 KDCt940 2株、KDCp940 3株及 KDCt940 4株属于 Karp型 ;HCAa92 0 2株、HCAp92 0 3株及 HCM95 0 1株属于 Gilliam型 ,但基因序列可能存在遗传差异。

套式PCR应用于恙虫病东方体媒介、鼠类血块及脾脏标本的实验检测研究

目的 :检测恙螨幼虫体内及鼠类标本中恙虫病东方体携带情况 ,预测流行趋势 ,评价套式PCR反应的敏感性和特异性 ,以进一步开展分子流行病学研究。方法 :参照文献中恙虫病东方体Karp株Sta 58群特异性抗原基因序列 ,合成两对DNA引物 ;应用套式PCR检测现场鼠体表恙螨幼虫体内及鼠类标本的恙虫病东方体DNA ;PCR扩增产物通过 2 %琼脂糖凝胶电泳分析和12 %PAGE电泳分析 ,并用PGEM - 3Zf(+) /HaeⅢDNA作为核酸分子量参照物 ,证实扩增产物是恙虫病东方体Sta 58kDa群特异性抗原基因 88bp片段。结果 :从送检的 2 9份鼠血块和 112份脾组织中均检出阳性 1份 ;从 39份恙螨幼虫体内检出阳性 8份。实验感染小鼠后 3d ,其血块及脾组织均未检出恙虫病东方体 ;而在感染后 6和 9d ,能从血块及脾组织中检出恙虫病东方体。结论 :套式PCR具有很高的敏感性和特异性 。

恙虫病东方体Gilliam株56kDa蛋白部分基因的原核表达及初步鉴定

目的 对恙虫病东方体Gilliam株 5 6kDa蛋白部分基因进行原核表达 ,以获得高效表达、有生物活性目的蛋白 ,为恙虫病诊断试剂的研制打下基础。方法 根据Gilliam株东方体 5 6kDa蛋白基因序列设计特定引物 ,用PCR法扩增出编码5 6kDa抗原富含亲水区及同源性高的C端一段长约 70 0bp的DNA ,插入原核载体PGEX - 4T - 2 ,转化大肠杆菌TGI ,抽提质粒 ,酶切鉴定 ,含插入片段的重组质粒进行序列分析 ,再转化表达宿主菌大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,用SDS -PAGE及Western -blot进行分析鉴定。结果 SDS -PAGE检测表明该截短片段以融合蛋白的方式得到成功表达 ,在相对分子量 5 8kDa处有表达条带 ,经薄层扫描分析 ,目的蛋白条带占全菌蛋白的 30 5 %。Western -blot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清识别。结论 表达产物初步鉴定具有生物活性 。

抗恙虫病东方体噬菌体抗体库的构建和初步筛选

目的构建抗恙虫病东方体噬菌体抗体库并进行初步筛选,获得与恙虫病东方体膜抗原特异性结合的抗体克隆,为研制恙虫病的快速诊断试剂盒奠定基础。方法从感染恙虫病东方体小鼠的脾细胞中提取RNA,经逆转录、PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻链基因和表达载体pComb3进行酶切、连接,转化大肠杆菌XL1-blue,构建轻链库;再对轻链重组质粒和重链Fd基因进行酶切、连接,转化大肠杆菌XL1-blue,构建组合文库,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染。用恙虫病东方体56kDa型特异性抗原作为筛选抗原,进行4轮富集筛选后用ELISA法进行阳性克隆的鉴定。结果构建了库容为3.46×106的鼠源性抗恙虫病东方体的噬菌体Fab片段抗体库。经过4轮富集筛选,抗体库中的目的抗体得以富集约160倍,并用ELISA法对其进行鉴定,得到了7个阳性克隆。结论构建的抗恙虫病东方体噬菌体抗体库,库容为3.46×106,滴度为2.5×1012cfu/ml,基本上达到了建库要求,能够满足多样性的需求,并成功的筛选出抗恙虫病东方体56kDa蛋白的抗体,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行了初步鉴定,认为具有一定的特异性。

我国辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株的PCR分型

为鉴定我国东北地区恙虫病东方体 (Ot)型别 ,本文应用Ot外膜主要蛋白型特异抗原 5 6ku构建的群、型引物 ,采用PCR技术对分离自辽宁、吉林地区的 6株恙虫病东方体目的基因进行分析研究 ,并与Gilliam ,Karp ,Kato国际参考株进行比较。结果表明 ,辽宁、吉林恙虫病东方体分离株至少存在Gilliam和Karp

高湖纤恙螨叮刺和经卵传递恙虫病东方体的研究(英文)

目的研究高湖纤恙螨叮刺和传播恙虫病东方体(Ot)的能力。方法螨叮人传病试验是将2只未食高湖纤恙螨幼虫放在受试者(笔者本人)的前臂屈侧上,罩上透明塑料小盖,在解剖镜下观察螨的活动。经卵传递Ot试验是将20～40只高湖纤恙螨未食幼虫放在1只小白鼠耳中3～5 d,每天观察鼠的情况,病鼠或死鼠予以解剖,镜检Ot。结果恙螨叮人20 d后使人患恙虫病并从血中分离到Ot。鼠体经卵传递Ot试验亦获得成功。阳性鼠均有典型症状、显著病变,并检出Ot。结论结果表明高湖纤恙螨可作为恙虫病的传播媒介。

恙虫病东方体Karp株56kD表膜蛋白基因的表达及免疫诊断应用研究

目的实现恙虫病东方体56kD表膜蛋白的原核表达并评价重组蛋白作为抗原的免疫诊断价值。方法亚克隆技术构建原核表达质粒载体pGEX-Sta56,转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-Sta56融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白,应用ELISA以评价其免疫诊断价值。结果pGEX-Sta56经测序鉴定Sta56基因以正确的表达框架连入载体,经过诱导表达得到正确大小的融合蛋白,应用纯化的GST-Sta56的ELISA检测结果与全细胞抗原有很高线性相关性,在小鼠血清检测中敏感性,特异性和准确性分别大于90%,70%和80%。结论成功表达重组的56kD表膜蛋白并可能替代传统的全细胞纯化蛋白,为建立快速、敏感和特异的免疫学诊断奠定了基础。

恙虫病东方体47kDa蛋白基因部分片段的克隆与表达

目的 表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot) 4 7kDa保护性抗原蛋白。 方法 采用PCR方法 ,从OtKarp株基因组DNA中扩增出 4 7kDa蛋白基因片段 ,鉴定后将该片段克隆于原核表达载体 pBV2 2 0 ,构建成重组质粒pBV -4 7。用该重组质粒转化E coli,转化子在 4 2℃诱导表达并对其鉴定。结果 (1)获得长约 14 30bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知 4 7kDa基因序列相同 ;(2 )SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量 4 0× 10 3 处有表达带 ;(3)经薄层扫描分析 ,目的蛋白占全菌蛋白的 19% ;(4)免疫印迹实验证明其具有免疫反应性。结论 获得了 4 7kDa基因片段 ,并在大肠杆菌中实现了表达 ,表达产物具有免疫反应性。

恙虫病东方体Ot56蛋白序列生物信息学分析

目的分析恙虫病东方体Ot56蛋白序列中的变异区和保守区,为恙虫病的蛋白与核酸诊断提供参考。方法从GenBank获取目标序列,用Lasergene、MEGA、Vector NTI suite、AthePort和NCBI Blast等工具进行分析。结果120条Ot56氨基酸序列的相似性为61.4%～100.0%,变异度为0.0～57.1;氨基酸的105～171、179～215、248～285、375～428和447～503区域为高变异区;膜外区200～400具有变异度高、抗原性强的特性。113条Ot56cDNA序列的相似性为41.8%～100.0%,变异度为0.0～116.1;其中303～481、562～667、756～842、1136～1243和1386～1568等5个区域属高变异区,而0～54、97～171、265～303、439～482、1015～1047和1477～1542为6个保守片段。结论恙虫病东方体Ot56蛋白具有5个高变异区,第200～400位氨基酸附近可能是株(型)特异性表位所在区域,其重组蛋白具有潜在的株(型)鉴定价值。根据cDNA6个保守片段设计引物,进行Ot56核酸检测可能在不同株(型)恙虫病东方体检测中具有较高的敏感性。

恙虫病东方体黑龙江分离株的PCR分型

目的 鉴定恙虫病东方体黑龙江分离株的基因型。方法 采用PCR技术对分离自黑龙江省密山地区的 6株恙虫病东方体sta5 6kD目的基因进行分析研究 ,并与国际参考株进行比较。结果 MSAa930 1株、MSAa930 3株、MSAa930 4株及MSAp930 5株属于Gilliam型 ;MSAa930 6株属于Karp型 ;MSAp930 2株属于Kato型。 结论 黑龙江密山地区恙虫病东方体存在Gilliam、Karp和Kato 3种型别。