橡胶树热垦525胚性悬浮细胞系的建立及其胚性能力的维持

易碎胚性愈伤组织和胚性悬浮细胞系都是基因工程和细胞工程的理想受体材料。然而橡胶树(Hevea brasil-iensis)易碎胚性愈伤组织诱导频率低、耗时长,且其胚性能力通常随继代次数的增加而下降甚至完全丧失,限制了相关研究的持续开展。因此,快速获得易碎胚性愈伤组织,建立具有高效体胚发生能力的胚性悬浮细胞系,并尽可能较长时间维持其胚性能力是当前橡胶树基因工程和细胞工程研究的重要内容。本研究以橡胶树热垦525未成熟花药为外植体进行愈伤组织的诱导和胚性悬浮细胞系的建立,分析比较固液2种长期继代方式对维持其胚性能力的影响。结果表明:花药外植体在愈伤诱导培养基中获得的黄色致密初代愈伤组织体胚发生能力低,分散性差,不适合进行悬浮培养。将初代愈伤组织转移至胚性愈伤组织诱导培养基中培养70~80 d后,可观察到有胚性结构的形成和早期体细胞胚发生,同时周围长出鲜黄色小颗粒状易碎胚性愈伤组织。通过常规方法建立的Ⅰ型胚性悬浮细胞系具备胚性细胞的典型特征,体胚发生能力显著高于胚性愈伤组织,但在体胚发生过程中容易重新愈伤化;而通过筛选特定形态的胚性愈伤组织低密度启动悬浮培养建立的Ⅱ型胚性悬浮细胞系,在显微镜下可观察到细胞处在有序的胚性结构中,其体胚发生频率可达100%。在含2 mg/L2,4-D的液体培养中持续继代2 a后细胞明显老化且增殖缓慢,体胚发生能力几近丧失;而在去除2,4-D并添加低浓度脱落酸(0.1 mg/L)和水解酪蛋白(0.5 g/L)的固体培养基上持续继代2 a后,体胚发生能力仍能维持在较高水平。所建立的Ⅱ型胚性悬浮细胞系可为橡胶树遗传转化及原生质体培养等相关研究长期提供优质充足且状态相对稳定的材料来源。

低温胁迫下褪黑素对葡萄悬浮细胞生长及生化特性的影响

【目的】分析低温胁迫下褪黑素(MT)对葡萄悬浮细胞生长、生化特性及冷响应相关基因表达的影响,筛选适宜MT浓度,探究MT增强葡萄耐冷性的作用机制。【方法】以‘黑比诺’葡萄悬浮细胞为试材,在低温(4℃)胁迫下,考察不同浓度MT[0(CK),50(T_(1)),100(T_(2)),200(T_(3)),300μmol/L(T_(4))]处理对悬浮细胞生长、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(Pro)含量、抗氧化酶活性的影响及T_(2)处理冷响应相关的基因表达变化趋势。【结果】(1)在低温胁迫下,各MT处理悬浮细胞干重在培养周期内均呈先增加再减少最后趋于平稳或降低的趋势,在处理末期均明显高于CK。(2)各处理悬浮细胞MDA和Pro含量均随处理时间延长表现为先升后降,在24 h或48 h时达到峰值;各MT处理MDA含量均显著低于CK,Pro含量则显著高于CK,并均以T_(2)处理最低或最高;(3)各MT处理细胞抗氧化酶活性均显著高于同期CK,并均以T_(2)处理最高;随着时间延长,各处理的POD和CAT活性先升后降,SOD和APX活性则先降后升,且分别在24 h或6 h时达最高。(4)T_(2)处理悬浮细胞冷响应相关基因(VvCBFs、VvICE1、VvRD29B和VvKIN-2)相对表达量在不同时间均较相应CK极显著上调。【结论】在低温胁迫下,适宜浓度(100μmol/L)MT可通过提高葡萄悬浮细胞抗氧化酶活性和冷响应相关基因的相对表达量,增加Pro含量,降低MDA含量,最终增强葡萄悬浮细胞低温耐受性。

南方红豆杉悬浮细胞超低温保存体系的建立

【目的】紫杉醇具有广谱抗癌作用,但其在红豆杉中含量极低,已无法满足日益增长的临床需求。目前,红豆杉悬浮细胞培养技术被认为是解决紫杉醇稀缺的有效途径之一,然而细胞经过连续不断传代后容易发生遗传性变异,导致细胞生长状态不佳,合成紫杉醇的能力下降。研究提出一个优化的超低温保存南方红豆杉悬浮细胞的方法以解决这一难题。【方法】以南方红豆杉悬浮细胞为材料,采用单因素试验,研究预培养温度、预培养时间、预处理剂、脱水时间、冷冻保护剂及解冻温度对细胞存活的影响,并在此基础上以细胞存活率为优化目标对超低温保存条件进行响应面优化。【结果】根据单因素试验筛选出3个显著影响因素,分别为蔗糖浓度、脱水时间、解冻温度;通过响应面优化获得细胞最佳保存条件为:南方红豆杉悬浮细胞首先在B5培养基中预培养12 d,预培养温度为5℃,然后室温下用6.6%蔗糖预处理30 min,去除预处理剂,加入20%乙二醇+35%甘油+10%DMSO+10%山梨醇作为冷冻保护剂,在0℃条件下脱水处理31 min,0℃冰浴30 min,-20℃放置2 h,最后放入-80℃冰箱中保存14 d。冷冻后的悬浮细胞在41℃水浴60 s迅速解冻,接着用含1.2 mol/L蔗糖的B5培养基洗涤去除保护剂,最后在B5培养基上对悬浮细胞进行恢复性培养。经过上述冻存处理的南方红豆杉悬浮细胞存活率可达68.19%。【结论】建立了南方红豆杉悬浮细胞的超低温保存体系,并对其进行了优化,取得了一定的冻存效果,这为南方红豆杉及其他药用植物细胞的长期维持提供了技术参考。

外源诱导子和温度对黑果枸杞悬浮细胞花青素积累的影响

黑果枸杞富含花青素,是一种具有很高开发利用价值的药食同源植物。以黑果枸杞无菌苗的叶片为外植体诱导愈伤组织建立细胞悬浮体系,研究不同外源激素和温度对黑果枸杞悬浮细胞中花青素含量的影响。黑果枸杞愈伤组织诱导的最佳培养体系为WPM+0.5 mg/L激动素+2.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+20.0 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂,悬浮细胞培养的最优体系为WPM+0.5 mg/L激动素+2.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+0.01 mg/L萘乙酸+20.0 g/L蔗糖,其生长曲线呈“S”形,活细胞数量在悬浮培养第18天时达到峰值,为7.93×10^(5)个/mL。30 g/L蔗糖、200 mg/L茉莉酸甲酯、2 mg/L脱落酸及16℃单一处理均能显著促进悬浮细胞花青素产量的提升(P<0.05),2 mg/L脱落酸诱导效果最佳。在16℃和3种外源激素的复合处理下,200 mg/L茉莉酸甲酯+16℃的复合诱导处理能显著促进细胞花青素积累(P<0.05),含量是16℃单因素处理的1.13倍。研究结果为进一步优化黑果枸杞悬浮细胞培养体系、促进花青素积累奠定了基础。

百岁兰愈伤的诱导与悬浮细胞培养

为探究稳定高效的百岁兰叶片愈伤组织诱导体系及其悬浮细胞培养方法,利用百岁兰叶片作为材料,采用正交法使用两种激素(NAA与6-BA)配置植物培养基,运用避光与昼夜节律两种处理诱导愈伤组织产生,并利用愈伤组织与其对应配比的液体培养基培养悬浮细胞。结果表明,百岁兰叶片在0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA浓度下的诱导愈伤具有最好的稳定性与成功率,在昼夜节律条件下诱导与生长的效率很高,以此为基础培养的悬浮细胞取得了一定进展。研究可为百岁兰的保护与稳定遗传提供技术参考。

海南产温郁金悬浮细胞培养及其挥发性成分的积累研究

目的:建立海南地区引种温郁金Curcuma wenyujin的悬浮细胞系,并初步研究离体培养材料中挥发性成分的积累。方法:甄选诱导愈伤组织的外植体、培养基以及悬浮细胞起始愈伤组织等,建立稳定的悬浮细胞系;采用顶空固相微萃取-气质联用技术测定温郁金悬浮细胞团等离体培养材料中莪术挥发油等挥发性成分。结果:嫩根诱导的愈伤组织是建立稳定悬浮细胞系的适宜起始材料;愈伤组织继代培养2次后增殖较明显,可形成颜色鲜黄、颗粒均一、疏松易碎的胚性愈伤组织;三种离体培养材料中,常见挥发性物质总量检出率依次为组培苗、悬浮细胞团、愈伤组织;莪术挥发油中常见化学成分牻牛儿酮、莪术烯、莪术二酮、榄香烯等总量的检出率依次为组培苗、愈伤组织、悬浮细胞团。结论:海南地区引种温郁金悬浮细胞系等离体培养材料均积累了一定量的莪术油等挥发性有效成分,为进一步筛选优化培养体系、促进培养物次生代谢物的积累提供了基础研究。

真菌诱导子对白术悬浮细胞生长与次生代谢的影响

为探讨不同真菌诱导子对白术悬浮细胞生长和次生代谢的影响,于无菌状态下培养白术无菌苗,诱导愈伤组织,并构建悬浮细胞培养体系,记录悬浮细胞干质量,绘制生长曲线,添加不同内生真菌诱导子溶液后共培养,用高效液相色谱法测定悬浮细胞中白术内酯Ⅰ、白术内脂Ⅲ与苍术酮含量。结果表明,MS+6-BA(6-苄氨基嘌呤)1.0 mg/L+NAA(1-萘乙酸)0.5 mg/L是白术愈伤组织诱导的最适培养基,MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L是悬浮细胞增殖的最适培养基;白术悬浮细胞生长呈现S形曲线生长特征,对数生长期培养体系pH值稳定在4.8~5.0;真菌诱导子显著影响悬浮细胞生长与次生代谢,其中AM478真菌诱导子和AM393真菌诱导子对悬浮细胞生长具有显著促进作用,AM569真菌诱导子对白术内酯Ⅲ与苍术酮积累具有显著促进作用。综上,筛选得到的AM569菌诱导子可作为白术悬浮细胞生物转化的备选诱导子,以促进白术有效成分积累。

低温胁迫下褪黑激素对烟草悬浮细胞精氨酸脱羧酶活性的影响

研究了褪黑激素对烟草(Nicotiana tabacum)悬浮细胞在低温胁迫下精氨酸脱羧酶活性及细胞生存率的影响。发现褪黑激素可以明显提高低温胁迫下烟草悬浮细胞精氨酸脱羧酶的活性,并明显提高细胞的生存率。表明褪黑激素可能在低温条件下通过调节植物细胞内多胺的合成而提高抵御冷害的能力。

高羊茅悬浮细胞系的建立及绿色植株的高频再生

将5个高羊茅品种的成熟种子经灭菌后,接种于含有不同浓度2,4-D和ABA的N6培养基上进行愈伤组织诱导。结果表明,不同浓度2,4-D和ABA对5个品种的愈伤组织诱导率有显著影响,以培养基中附加9mg/L2,4-D和2mg/LABA的诱导率最高。将经过数次继代改造后获得的高质量胚性愈伤置于AA液体培养基中进行悬浮培养,建立起来自3个品种的8个悬浮细胞系,其中6个悬浮细胞系经高渗预处理后能高频再生出绿色植株,基本克服了以往研究中再生白化植株的现象。

植物悬浮细胞的研究进展

综述了植物悬浮细胞培养的原理、培养类型、不同植物悬浮细胞培养基的配方和培养方法.同时阐述了悬浮细胞系在细胞生物学和分子生物学领域中的应用前景.

硅对盐胁迫烟草悬浮细胞的影响

研究了硅对盐胁迫烟草 (NicotianatabacumL .)悬浮细胞的影响。结果表明 ,硅通过提高盐胁迫细胞胞外过氧化物酶POD活性、改善细胞的长宽比例使细胞更趋向于圆形和减少盐胁迫引起的畸形细胞等作用使细胞保持较旺盛的分裂和代谢能力 ,硅可进一步调节细胞内水分状况 ,增强细胞的耐盐性。本文对这一影响的可能机制进行了讨论。

非生物诱导子茉莉酸甲酯和水杨酸对半夏悬浮细胞中生物碱代谢的影响

目的研究非生物诱导子茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)对半夏悬浮细胞系生物碱含量及相关酶活性的影响。方法以叶柄来源的愈伤组织建立半夏悬浮细胞系,调查不同培养时间、MeJA和SA浓度对细胞中生物碱含量的影响,并分析生物碱合成相关酶(IMP脱氢酶、s AMP合成酶)的活性。结果悬浮培养21 d时,悬浮细胞干重(DW)为培养前9倍,且生物碱总量为培养前3倍。MeJA和SA处理均能显著促进生物碱在半夏悬浮细胞中累积。150μmol/L MeJA处理组生物碱含量为对照组3.6倍,达4.7 mg/g DW;50μmol/L SA处理使悬浮细胞生物碱含量达到对照组的2.5倍。100μmol/L MeJA和50μmol/L SA处理使IMP脱氢酶比活力分别为对照组3.0、3.7倍,150μmol/L MeJA和100μmol/L SA处理使s AMP合成酶比活力分别为对照组2.6、4.4倍。结论添加适量外源诱导子MeJA和SA能促进半夏悬浮细胞中生物碱的累积。

不同诱导处理后水稻悬浮细胞的活性氧变化与有关酶系的关系

以水稻 (OryzasativaL )感病品种浙辐 80 2为材料 ,研究了 3种不同因子处理后其悬浮细胞中活性氧及其一些抗病酶系的变化情况。结果表明 :(1) 3种因子均能导致H2 O2 的形成和积累。XOO 75 1处理后的H2 O2 含量分别在 0 5h和 6h出现突增现象 ,而XOO 76 2 5处理只在 0 5～ 1h达到一个峰值。推测XOO 75 1和浙辐 80 2间的互作属于非亲和性互作 ,而XOO 76 2 5与浙辐 80 2间属于亲和性互作。 (2 )XOO 75 1和 76 2 5菌株处理后均能不同程度地增强POD的活性 (平均为 13 2 %和 5 0 7% ) ,但SOD的活性增强不显著 ,甚至在诱导初期有降低的现象。 (3)可溶性蛋白质电泳结果表明 ,XOO 75 1和 76 2 5处理后 72h均可形成两条新增谱带 (Rf=0 4 8和Rf=0 72 ) ,XOO 75 1还可诱导形成另两条新增谱带 (Rf=0 5 3,MW =32 2kD和Rf=0 6 9,MW =4 1 9kD)。 (4)不同因子处理后悬浮细胞的POD和SOD发生相应变化 ,表现为一些谱带的增减或强度变化。 (5 )SA处理后悬浮细胞的H2 O2 有明显的积累效应 ,而且 ,SA能显著提高POD活性 (平均提高 32 8% )和SOD活性 (平均提高 4 6 7% )。表明SA可能通过调节H2 O2 的含量诱导与植物抗性有关的防御基因表达。

马铃薯悬浮细胞原生质体培养及植株再生

试验所培养的 3个基因型的马铃薯悬浮细胞原生质体均获得再生植株。愈伤组织继代培养基。

过氧化氢对银杏悬浮细胞黄酮含量及抗氧化酶活性的影响

以银杏悬浮细胞为研究材料,通过向液体培养基中添加0～20.0 mM的H2O2,探讨H2O2处理下银杏细胞黄酮代谢、抗氧化酶及活性氧之间的相互关系。主要结果有：1外源H2O2处理限制了悬浮细胞的生长,但提高了苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性（20 mM第6 d除外）和总黄酮的合成,最高达18.8 mg/g DW（10.0 mM处理）。2低浓度（0.5～1.0 mM或0.5～5.0 mM）的H2O2能够激活SOD和CAT酶,而高于5 mM以上抑制两酶活性,POD活性在10～20 mM较高。0.5～1.0 mM外源H2O2对细胞内源H2O2和MDA（第6 d的20mM除外）的积累影响不大,但在5～20 mM时两者出现大量积累,同时高浓度的H2O2也促进了脯氨酸的合成。这些结果表明在银杏细胞内可能存在一个黄酮（抗氧化物质）—活性氧—抗氧化酶的动态平衡系统,在低浓度（0.5～1.0 mM）H2O2处理下银杏细胞可能通过提高SOD和CAT酶活性清除胞内O2.-和多余的过氧化氢,维持生长;中等浓度（5～10 mM）H2O2处理下细胞可能通过提高POD活性、刺激黄酮的积累、提高脯氨酸含量来抵御胞内高浓度的H2O2等活性氧对细胞的胁迫,维持细胞生存;过高的H2O2（20 mM,处理6d）处理打破了细胞内三者的动态平衡,导致细胞的褐化死亡。5～10 mMH2O2处理对银杏细胞总黄酮的积累最有效。

水稻胚性悬浮细胞系建立过程中生理生化变化——Ⅱ.氨基酸、多胺及内源激素的变化

以水稻广亲和中粳品系02428为材料,分析了其胚性悬浮细胞系建立过程中氨基酸、多胺及内源激素的变化。结果表明:1.游离氨基酸的总量是FP_(15)>MP_(45)>LP_(90),其中FP_(15)游离精氨酸的含量很高,而在MP_(45)和LP_(90)中含量剧降。蛋白质氨基酸和蛋白质合成能力正好和游离氨基酸的总量变化相反。2.从FP_(15)→MP_(45)→LP_(90),腐胺含量呈上升、精胺含量呈下降趋势。腐胺/(精胺+亚精胺)上升了近20倍。悬浮细胞经脱壁而成游离原生质体后,其总多胺、尸胺和腐胺的含量与悬浮细胞相比均大幅度下降,而精胺和亚精胺则有所升高。3.植物内源激素IAA、2ip的含量是LP_(90)>MP_(45)>FP_(15),ABA、ZRs的含量是FP_(15)>MP_(45)>LP_(90)。上述变化在一定程度上解释了胚性悬浮细胞即后期悬浮细胞适合于进行原生质体培养的生理生化机理。

光质对玫瑰茄悬浮细胞合成花青素的影响

玫瑰茄悬浮细胞合成花青素受光调节，将不同的单色滤光膜覆盖在摇瓶表面，控制光照强度，判定了蓝光（波长４２０～５３０ｎｍ）是促进玫瑰茄细胞产花青素的最有效单色光，花青素产量为４１６ｍｇ／ｌ，和全色光下相当（３９６ｍｇ／ｌ）；红光和橙光（波长＞５８０ｎｍ）无效；其它单色光随其波长接近蓝光，正效应增强．单色光对玫瑰茄细胞培养过程的其它参数，如ｐＨ值、降糖速度、细胞生物量等影响不大．

水稻胚性悬浮细胞玻璃化冻存中的超微结构变化

用透射电镜技术研究了水稻胚性悬浮细胞玻璃化冻存过程中细胞超微结构的变化规律。预培养降低了细胞的液泡化程度，线粒体嵴变得更为发达。过渡处理后，该细胞器开始膨大，其基质变得稀薄。脱水处理引起核周隙扩张和膜性物质小泡化。冷冻这一环节基本上不产生新的损伤。恢复生长时，水稻细胞重新获得正常的超微结构。预培养中的超微结构变化是抗冻力和抗脱水力提高的标志；过渡、脱水和冷冻中的超微结构变化是可逆损伤。讨论了上述变化的可能机制。

荔枝胚性悬浮细胞系的快速建立及其体胚植株的再生

荔枝幼胚诱导的胚性培养物在低糖条件下连续继代4～6次左右,可筛选到颗粒细小、不含原胚的松散型胚性愈伤组织;以这种松散的胚性愈伤组织作为起始材料,在附加2,4-D2mg/L或2,4-D2mg/L、KT1mg/L、AgNO35mg/L的MS液体启动培养基上振荡培养(100～120r/min)10～14d,即可建立起分散性良好的胚性悬浮细胞系。采用激素减半的2种启动培养基交替继代培养或周期性固体-液体轮回培养,可以长期保持胚性悬浮细胞系。荔枝胚性悬浮细胞在附加NAA0.1mg/L、KT或Ze5mg/L、肌醇100mg/L、蔗糖50g/L、琼脂10g/L的MS固体培养基上诱导体胚,25～40d后可形成大量胚状体,诱导体胚数量达10,000个/gFW以上。经过成熟培养后,正常的体胚75%以上萌发再生完整植株。

紫茉莉悬浮细胞培养体系的建立

为建立紫茉莉（Mirabilis jalapa L.）悬浮细胞培养体系，以紫茉莉无菌苗叶片诱导的愈伤组织为材料，筛选紫茉莉悬浮细胞的适宜培养体系。结果表明，紫茉莉愈伤组织在MS＋2,4-D1mgL^-1＋KT0．5mgL^-1的液体培养基中悬浮继代培养3～4次，能得到稳定的悬浮细胞系。培养基的pH值为5．5～5．9，蔗糖浓度为30gL^-1更适合悬浮细胞的生长。紫茉莉悬浮细胞的生长曲线大致呈s型。最佳继代培养时间是10d，培养液的体积为40mL时，接种量为7．5mL，可以较好地保持悬浮细胞系。1L培养液中可提取分泌蛋白（0．42±0．15）g。这些有助于对悬浮细胞提取分泌蛋白的研究。