单纯疱疹病毒2型感染细胞蛋白27重组真核表达质粒的构建及表达

目的构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)感染细胞蛋白27(ICP27)基因与pcDNA3.1(+)真核表达质粒的重组质粒pcDNA3.1(+)/ICP27。方法通过RT-PCR方法从HSV-2培养物中提取RNA制备ICP27的编码基因UL54DNA,将其与载体pcDNA3.1(+)连接。通过双酶切和测序鉴定重组质粒是否构建成功,Western blot法鉴定重组质粒在真核细胞COS-7中表达。结果重组质粒pcDNA3.1(+)/ICP27构建成功,可在COS-7中表达。结论成功构建了可在真核细胞内表达的pcDNA3.1(+)/ICP27重组质粒,为下一步研究该重组质粒作为DNA疫苗的免疫学效应奠定了基础。

1型牛疱疹病毒bICP27蛋白在病毒感染中的作用

1型牛疱疹病毒(Bovine herpesvirus type 1,BHV-1)主要感染牛,对牛的呼吸系统、眼结膜、生殖系统和神经系统均有损害。BHV-1编码的牛感染细胞蛋白27(bovine infected cell protein 27,bICP27)是一种可在细胞核和细胞质之间穿梭的立即早期(immediate early,IE)蛋白,可以抑制宿主的先天性免疫应答,能够在病毒感染早期刺激病毒蛋白表达,在感染后期促进病毒复制,调控病毒mRNA转录和宿主基因表达。笔者综述了近年来有关bICP27蛋白在BHV-1感染宿主过程中的作用,以期为BHV-1的深入研究提供参考和借鉴。

单纯疱疹病毒2型ICP27_(377-513)核酸疫苗联合IL-15核酸疫苗免疫效果的观察

目的构建表达单纯疱疹病毒2型感染细胞蛋白27(infected cells protein 27,ICP27)的重组质粒pcDNA3.1-ICP27377-513并观察白细胞介素(IL)-15核酸疫苗联合HSV-2-ICP27377-513核酸疫苗的免疫效果。方法采用分子克隆技术构建pcDNA3.1-ICP27377-513重组质粒。将BALB/c雌性小鼠随机分为pcDNA3.1-ICP27377-513联合pcDNA3.1-IL-15(pIL-15)组、pcDNA3.1-ICP27377-513组、pcDNA3.1组和pIL-15组,共免疫3次,每次间隔2周。末次免疫后28 d取血,用微量中和实验法检测血清中特异性中和抗体,ELISA法检测血清中IL-4、IL-2和干扰素-γ(IFN-γ)水平。阴道给予致死量HSV-2攻击小鼠,分别于接种后3 d、7 d和14 d收集阴道冲洗液,用荧光定量PCR法检测生殖道病毒载量。结果pcDNA3.1-ICP27377-513联合pIL-15组和pcDNA3.1-ICP27377-513组中和抗体效价分别为40.00±8.16、28.67±4.47,但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。pcDNA3.1-ICP27377-513联合pIL-15组IFN-γ、IL-4水平明显高于pcDNA3.1-ICP27377-513组(P<0.05),但IL-2水平两组间差异无统计学意义(P>0.05)。阴道给予致死量HSV-2攻击后,pcDNA3.1-ICP27377-513联合pIL-15组和pcDNA3.1-ICP27377-513组小鼠阴道冲洗液中病毒载量随着时间延长逐渐减低,pcDNA3.1-ICP27377-513联合pIL-15组和pcDNA3.1-ICP27377-513组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论IL-15核酸疫苗联合HSV-2-ICP27377-513核酸疫苗对小鼠有较好的免疫保护作用。

单纯疱疹病毒2型泛素化新型DNA疫苗构建

目的构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)早期表达蛋白感染细胞蛋白(ICP)27强制泛素化的DNA疫苗表达质粒。方法利用聚合酶链反应(PCR)技术从人基因组DNA和HSV-2基因组中分别扩增出泛素全长基因和HSV-2、ICP27 377-459,PCR鉴定后酶切连接获得融合基因片段,插入真核表达质粒pcDNA3．1载体中,构建出重组真核表达质粒Ub-ICP-pcDNA3．1,并对其进行测序鉴定。结果构建的重组质粒Ub-ICP-pcDNA3．1克隆基因插入方向正确,与预期序列完全一致。结论成功构建了HSV-2早期表达蛋白ICP27强制泛素化DNA疫苗。

白介素2基因佐剂协同HSV-2多表位复合DNA疫苗诱导小鼠免疫应答

目的研究白介素2(IL-2)cDNA协同HSV-2多表位复合DNA疫苗免疫对小鼠体液和细胞免疫应答的影响。方法利用真核表达质粒pcDNA3.1分别构建HSV-2糖蛋白gD、gB、gC和早期表达蛋白ICP 27的多表位复合DNA疫苗HV-pcDNA3.1和IL-2的真核表达质粒IL-2-pcDNA3.1。15只C57/ BL6小鼠分为3组,分别接受pcDNA3.1空载体注射、HV-pcDNA3.1单独免疫或HV-pcDNA3.1及IL-2- pcDNA3.1联合免疫。共免疫2次,间隔2周。末次免疫3周后。ELISA法检测小鼠血清HSV-2特异性IgG、IL-2和IFN-γ,淋巴细胞特异性增殖反应和乳酸脱氢酶法检测杀伤性T淋巴细胞(CTL)功能。结果与HV-pcDNA3.1单独免疫组相比.IL-2-pcDNA3.1的协同免疫可以提高小鼠血清中和IFN-γ表达(1956.19±219.60 ng/L,P<0.05),增强淋巴细胞特异性增殖反应(促细胞增殖率为2.75%±0.26%,P<0.05)和CTL活性(47.91%±15.09%,P<0.05)。小鼠血清HSV-2特异性IL-2水平在协同免疫组为(1421.16±220.98)ng/L,HV-pcDNA3.1单独免疫组为(1246.84±157.02)ng/L.两组间差异无统计学意义。结论IL-2 cDNA的协同免疫可以显著提高HSV-2多表位复合DNA疫苗诱导的细胞免疫应答水平。

单纯疱疹病毒2型多表位复合DNA疫苗的构建与免疫原性

目的构建单纯疱疹病毒2型（HSV-2）糖蛋白gD、gB、gC和早期表达蛋白ICP27的多表位复合DNA疫苗，探讨其诱导机体免疫应答的能力。方法将HSV-2野生株经PCR鉴定后，利用PCR技术从其基因组扩增出HSV-2 ICP27 377-459、gD146-179、gD223-306、gB529-606、gC247-282和gD1-77等6个基因片段。采用多基因片段一步酶切连接法获得构建的6个片段的复合DNA疫苗（HV）融合基因片段，经pGEMT载体克隆后，定向插入真核表达质粒pcDNA3．1载体中，构建重组真核表达质粒HV-pcDNA3．1，并对其进行酶切分析及测序鉴定。10只C57／BL6小鼠均分为脂质体包裹pcDNA3．1空载体质粒对照组和脂质体包裹HV-pcDNA3．1质粒免疫组。ELISA检测小鼠血清HSV-2特异性IgG、IL-2和IFN-γ，乳酸脱氢酶法检测CTL功能。数据行t检验。结果酶切重组质粒HV-pcDNA3．1，电泳可见两条带，分别为融合基因HV（1．3kb）和线性质粒pcDNA3．1（5．4kb）。测序结果表明，克隆基因插入方向正确，与基因库HSV-2相关序列同源性达99．9％。与pcDNA3．1空载体质粒组相比，HV-pcDNA3．1免疫组小鼠血清中HSV-2特异性IgG（0．29±0．14比0．11±0．04，P〈0．05）、IL-2（1246．8±157．0比685．2±104．2，P〈0．05）和IFN-γ（1340．3±108．5比547．7±189．3，P〈0．05）表达明显增加，CTL活性增强（31．82±10．12比8．30±2．91，P〈0．05）。结论成功构建了HSV-2糖蛋白gD、gB、gC和早期表达蛋白ICP27的多表位复合DNA疫苗，能有效引起小鼠机体特异性体液免疫和细胞免疫应答。