牦牛六个多能性相关转录因子OSKMNL的克隆和多顺反子慢病毒载体的构建

旨在克隆牦牛6个多能性相关转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28(OSKMNL),构建多顺反子慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry。本研究以1头3~5月龄健康雌性牦牛胎儿的生殖嵴组织为研究材料,利用RT-PCR技术克隆牦牛6个多能性相关转录因子OSKMNL的完整编码区序列,并对其进行生物信息学分析;应用无缝克隆技术构建慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;用293T细胞包装慢病毒,将包装好的慢病毒感染293T细胞和牦牛成纤维细胞,通过观察荧光表达和RT-PCR技术检测病毒感染情况(试验分为病毒感染组和空白对照组,每个组设置3个重复)。结果表明,克隆的牦牛OSKMNL基因的编码区大小分别为1 083、963、1 434、1 320、903、618 bp;序列分析发现牦牛OSKMNL氨基酸序列与黄牛的同源性在99%以上,其中Sox2、Klf4、c-Myc与黄牛的同源性为100%;进化树结果显示牦牛与黄牛、瘤牛、水牛的亲缘关系最近,与小鼠的亲缘关系最远;蛋白结构预测发现牦牛的6个转录因子OSKMNL都具有该基因家族相应蛋白功能的结构,比如POU结构域、HOX结构域、HMG结构域、Znf-C2H2结构域、HLH结构域、CSP结构域等;构建了慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;慢病毒感染293T细胞发现试验组表达红色和绿色荧光;慢病毒感染牦牛成纤维细胞发现试验组表达红色和绿色荧光,RT-PCR结果显示预期大小的条带。本研究成功克隆了牦牛的6个多能性相关转录因子OSKMNL;构建了分别携带牦牛3个转录因子的慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;包装的慢病毒能感染牦牛成纤维细胞。有利于推动多能性相关转录因子OSKMNL在牦牛干细胞中的应用,也为后续研究牦牛iPSC做准备。

采用慢病毒载体干扰TRAF2表达的MH7A细胞稳转株的构建及意义

目的 用慢病毒载体构建干扰肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)表达的类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞株MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号在MH7A异常增殖的作用。方法 根据人TRAF2的基因序列和shRNA序列设计原则,设计并合成3对TRAF2-shRNA干扰序列,通过PCR对引物进行退火,通过双酶切PLKO.1-puro获得线性载体,将线性化载体与退火后引物通过Solution I连接,连接产物导入感受态细胞,涂板,挑取阳性菌落进行测序。构建3种不同的PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒重组质粒,借助慢病毒包装质粒对对数生长期的HEK 293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒液感染MH7A细胞,同时使用嘌呤霉素对TRAF2低表达的MH7A稳转株进行筛选。使用CCK-8法、Western blot、qPCR检测MH7A中肿瘤坏死因子TNF-α诱导TRAF2低表达的MH7A增殖功能及下游信号TRAF2、P65蛋白表达和mRNA水平。结果 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1)、PLKO.1-TRAF2-shRNA(2)和PLKO.1-TRAF2-shRNA(3)慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro,将3个TRAF2-shRNA慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro分别与慢病毒包装质粒导入HEK 293T获得病毒液,将病毒液感染MH7A细胞后,经嘌呤霉素(2.00μg/ml)筛选,2 d得到MH7A稳转株;qPCR和Western blot结果显示,PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A细胞稳转株中TRAF2 mRNA和蛋白的表达较阴性对照组明显下降;CCK-8和Western blot结果表明,MH7A中TRAF2敲低后,TNF-α诱导的TRAF2低表达的MH7A细胞增殖和P65的磷酸化水平明显下降。结论 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号活化介导RA滑膜细胞异常增殖中的作用。

牦牛“海绵吸附”bta-miR-125b的lncRNA筛选验证及慢病毒载体构建

旨在筛选在牦牛卵泡发育过程中可能吸附bta-miR-125b的长链非编码RNA(lncRNA),并构建双荧光素酶载体与慢病毒过表达载体,为研究调控牦牛生殖相关lncRNA的功能及机制提供基础。利用miRanda与RNAhybrid数据库预测可能靶向牦牛bta-miR-125b的lncRNAs,筛选出bta-miR-125b具有“海绵吸附”作用的lncRNAs,由RNAhybrid进行结合位点预测,筛选出最优的lncRNA;采集牦牛卵巢分离卵泡并提取总RNA构建cDNA池,以RT-PCR技术扩增筛选所得lncRNA;在此基础上利用pmir-GLO载体构建技术构建该lncRNA野生型及突变型双荧光素酶报告载体,并将其与bta-miR-125b mimics共转染至293T细胞,检测双荧光素酶活性;最后利用慢病毒载体构建技术将测序正确的lncRNA与pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro载体同源区的片段同源重组,通过慢病毒包装系统(psPAX2:pMD2G)包装后感染293T细胞,计算感染效率及滴度。结果:两个数据库中的lncRNA-ARS-UCD1.2与bta-miR-125b存在紧密结合位点,扩增出lncRNA-ARS-UCD1.2的序列全长为1552 bp;双荧光素酶活性检测表明牦牛lncRNA-ARS-UCD1.2与bta-miR-125b mimic具有靶向关系(P<0.01);同源重组后经酶切鉴定及测序验证表明成功构建了重组质粒,感染效率达(61.520±0.875)%,感染滴度为4×10^(8)TU/mL,表明lncRNA-ARS-UCD1.2过表达慢病毒载体成功构建。综上,本试验筛选出牦牛“海绵吸附”bta-miR-125b的lncRNA,并验证了两者的靶向结合关系,同时成功构建了该lncRNA的过表达慢病毒载体,为下一步深入研究lncRNA在细胞中的功能机制奠定了基础。

p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功;挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株,Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P<0.001),且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高(P<0.001),说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株;感染K.p.后,高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P<0.01)。结论经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续p62基因的研究提供了基础。

SOX7基因慢病毒载体的构建及其在缺氧条件下对HUVECs增殖与迁移功能的影响

目的构建过表达SRY-box transcription factor 7(SOX7)基因的慢病毒载体,建立SOX7基因过表达的人脐静脉内皮细胞株(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并在常氧和缺氧条件下探究过表达SOX7对HUVECs迁移和增殖能力的影响。方法使用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术扩增SOX7基因,通过同源重组法构建以pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen为载体的SOX7-pHAGE重组质粒。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)和免疫印迹(Western blot)法检测目的基因的mRNA和蛋白表达。将SOX7-pHAGE重组质粒和包装质粒共转染293T细胞,获得含有SOX7-pHAGE慢病毒悬液,经浓缩后感染HUVECs,构建SOX7稳定感染细胞株。应用qPCR和Western blot技术检测SOX7基因的mRNA和蛋白的表达。在常氧及缺氧条件下,通过细胞划痕实验和CCK-8法检测过表达SOX7对HUVECs迁移和增殖能力的影响。结果SOX7-pHAGE重组质粒经测序后,序列比对正确。qPCR和Western blot法成功检测出SOX7-pHAGE重组质粒转染的293T细胞在mRNA水平过表达约111.4倍(P=0.0028),在蛋白质水平上出现过表达条带;qPCR和Western blot技术成功检测到SOX7-pHAGE慢病毒感染的HUVECs在mRNA水平上显著升高约68.2倍(P=0.0030),在蛋白水平上显著升高约1.7倍(P=0.0043),SOX7-pHAGE重组质粒及SOX7稳定感染细胞株构建成功。在常氧条件下,SOX7稳定感染细胞株的迁移能力没有发生改变(P>0.9999),而在缺氧条件下其迁移能力增强约1.2倍(P=0.0044)。在常氧条件下,SOX7稳定感染细胞株的增殖能力增强约1.3倍(P=0.0087),在缺氧条件下其增殖能力也显著增强约1.4倍(P=0.0228)。结论SOX7稳定感染细胞株可促进HUVECs的增殖能力。在缺氧条件下,SOX7稳定感染细胞株可回补HUVECs被抑制的迁移和增殖能力。

过表达溶质载体家族1成员5和敲低慢病毒载体构建及稳定转染RAW264.7细胞株

背景:溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5,SLC1A5)在多种疾病中发挥了潜在作用,但确切作用机制尚不清楚。构建稳定的SLC1A5过表达和敲低细胞模型可为深入研究SLC1A5在疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具。目的:构建小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体,以建立稳定转染的RAW264.7细胞株,为深入探讨SLC1A5在炎症中的作用提供实验基础。方法:根据SLC1A5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应扩增该基因片段。将目的基因定向接入经Age I/Nhe I酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒,对阳性克隆进一步筛选后测序比对结果;pHelper1.0质粒载体、pHelper2.0质粒载体、目的质粒载体与293T细胞共同培养并转染,获得慢病毒原液进行包装和滴度测定;在此基础上,通过体外培养RAW264.7细胞,确定嘌呤霉素工作质量浓度;不同滴度的慢病毒分别与RAW264.7细胞共同培养,根据荧光强度确定转染效率;用嘌呤霉素挑选出稳定转染细胞,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹方法检测稳定转染细胞株的SLC1A5基因和蛋白表达水平。结果与结论:(1)测序序列与目的序列一致提示重组慢病毒载体构建成功;(2)过表达SLC1A5慢病毒的滴度为1×10~9 TU/mL,敲低SLC1A5慢病毒的滴度为3×10~9 TU/mL;(3)确定RAW264.7细胞嘌呤霉素工作质量浓度为3μg/mL;(4)过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞的最佳条件皆为HiTransG P转染增强液且感染复数值等于50;(5)过表达SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量明显上调,而敲低SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量显著下调。结果表明,成功构建了小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体并获得稳定转染的RAW264.7细胞株。

胞质分裂作用因子4过表达慢病毒载体的构建和稳定转染Neuro-2a细胞的建立

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶酶切后,将其与酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-DOCK4过表达重组质粒,PCR法鉴定筛选出与目的基因片段长度大小相近的阳性克隆。将GV492-对照质粒和GV492-DOCK4过表达重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-对照组和GV492-DOCK4组,分别采用GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后采用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))筛选出成功感染GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞生长状态及绿色荧光蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA和DOCK4蛋白表达水平。结果:PCR检测,GV492-DOCK4过表达重组质粒的基因片段长度约为691 bp,测序结果显示GV492-DOCK4过表达重组质粒基因序列与设计合成的DOCK4过表达序列一致;GV492-对照组和GV492-DOCK4过表达组慢病毒的滴度分别为2.5×10^(8) TU·mL^(-1)和2.5×10^(8) TU·mL^(-1);荧光显微镜观察,各组Neuro-2a细胞生长状态良好且存在绿色荧光蛋白表达;RT-qPCR法检测,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量225000附近出现特异性条带,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:本研究成功构建DOCK4过表达慢病毒载体,建立了稳定过表达DOCK4的Neuro-2a细胞。

BMP7过表达慢病毒载体构建及其对小鼠主动脉平滑肌细胞钙化的影响

目的构建骨形态发生蛋白7(BMP7)过表达慢病毒载体,分析BMP7过表达对小鼠主动脉内皮细胞Jagged1表达的影响及其对共培养血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响。方法根据目的基因信息Mouse-BMP7(NM_007557.3)和质粒信息pLVX-zsGreen-C1进行基因序列合成,构建BMP7过表达慢病毒。qPCR检测BMP7过表达慢病毒感染效率;Western blot检测其感染的小鼠主动脉内皮细胞Jagged1蛋白表达。将过表达BMP7慢病毒感染的内皮细胞与VSMCs共培养,茜素红染色观察共培养后VSMCs钙化情况。结果成功构建BMP7过表达慢病毒载体并转染至小鼠主动脉内皮细胞。qPCR检测结果提示,与正常对照组比较,BMP7过表达组的BMP7 mRNA相对表达量显著升高(P<0.01),空载体对照组BMP7 mRNA无显著变化(P>0.05)。Western blot结果显示,BMP7过表达组内皮细胞Jagged1蛋白表达水平较正常对照组显著降低(P<0.01),而空载体对照组内皮细胞Jagged1蛋白水平较正常对照组无显著改变(P>0.05)。茜素红染色结果提示,与感染过表达BMP7慢病毒的内皮细胞共培养后,VSMCs的钙化程度明显增加。结论成功构建小鼠BMP7过表达慢病毒载体,并发现过表达BMP7可以降低小鼠主动脉内皮细胞Jagged1表达,并促进共培养的VSMCs钙化。

LAMB3重组慢病毒载体的构建、包装和鉴定

目的 构建含有LAMB3基因的慢病毒表达载体,并感染HaCaT细胞,评价重组慢病毒载体提高LAMB3基因及蛋白表达的效果。方法 提取皮肤组织的总RNA,通过反转录方法扩增LAMB3基因,将其连入慢病毒载体pCDH-CMV中,在感受态细胞DH5α中扩增培养,并进行LAMB3基因的测序鉴定,将重组的慢病毒质粒转染293T细胞,浓缩纯化病毒液,感染HaCaT细胞并提取细胞的总蛋白和总RNA,用qPCR方法检测LAMB3 mRNA在感染病毒的HaCaT细胞中的表达,通过Western blot方法检测LAMB3蛋白在感染病毒的HaCaT细胞中的表达。结果 构建的慢病毒载体pCDH-CMV-LAMB3经测序分析证实基因序列正确。包装后的慢病毒滴度为108PFU/mL。qPCR方法检测到感染病毒的HaCaT细胞中,LAMB3基因在转录水平上有表达,Western blot方法检测到感染病毒的HaCaT细胞中,LAMB3过表达组与空白对照组相比,LAMB3蛋白表达量显著增加,LAMB3蛋白在翻译水平有表达。结论 本研究构建的携带LAMB3基因的重组慢病毒能够感染HaCaT细胞,并使其LAMB3基因及蛋白含量增加。

C5orf34基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建C5orf34基因的过表达慢病毒载体。方法通过聚合酶链反应(PCR)选择性扩增C5orf34基因目的片段,将目的片段连接至载体,利用基因重组技术构建带有C5orf34基因目的片段的重组载体,将重组载体转化到感受态细胞扩增并对阳性克隆的C5orf34过表达慢病毒载体进行测序,将正确重组的过表达慢病毒载体包装并转染色至293T细胞进行后续的慢病毒转染和滴度测定,采用实时定量PCR法检测C5orf34基因的过表达水平。结果经过测序比对显示,慢病毒载体与设计参考序列一致。重组慢病毒经包装并转染293T细胞后可观察到荧光,显示C5orf34过表达慢病毒载体滴度为1.0×10^(8)TU/mL。实时定量PCR的结果显示,在稳定转染C5orf34基因的细胞中C5orf34基因表达水平明显增高。结论成功构建C5orf34基因过表达慢病毒载体,为进一步研究C5orf34基因在肺癌发生发展过程中的机制奠定了生物学基础。

慢病毒载体介导的稳定表达eIF5A细胞系的建立及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响

本研究旨在通过慢病毒载体构建稳定表达真核翻译起始因子5A(eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145细胞系并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。全基因合成eIF5A序列,双酶切后构建慢病毒表达载体pLV-CMV-MCS-EF1a-Puro。将该载体和慢病毒包装质粒psPAX2与包膜蛋白质粒pMD2.G共转染HEK293T细胞,包装得到能表达eIF5A的慢病毒。将慢病毒转导至MARC-145细胞,经过嘌呤霉素筛选、细胞有限稀释法获得能稳定表达eIF5A的MARC-145细胞系。MTS试验证实构建的细胞系细胞活力无显著变化,病毒TCID50测定、实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹和间接免疫荧光技术检测eIF5A稳定表达对PRRSV滴度、PRRSV N基因及N蛋白表达的影响,发现MARC-145-eIF5A细胞系能显著促进PRRSV的增殖。本研究成功构建了稳定表达eIF5A的细胞系MARC-145-eIF5A,PRRSV感染试验证实体外稳定表达eIF5A可以促进PRRSV在MARC-145细胞的增殖。

鞘内注射shRNA慢病毒载体缓解慢性炎性疼痛的机制研究

目的探究鞘内注射shRNA慢病毒载体对慢性炎性疼痛大鼠疼痛行为学及脊髓胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、OX42蛋白表达的影响。方法将54只SD大鼠随机分为正常组、空病毒组、慢病毒载体组,采用足底注射完全弗氏佐剂(CFA)建立大鼠慢性炎性疼痛模型,正常组大鼠足底注射生理盐水,鞘内注射PBS缓冲液;空病毒组和慢病毒载体组大鼠足底注射CFA,鞘内分别注射空病毒和慢病毒液。于建模前1 d及建模后第1、3、6、9、13天测量机械缩足阈值(PMWT)及热缩足潜伏期(PTWL);于建模后第3、6、13天留取大鼠L4~L5背根神经节(DRG)组织和脊髓节段组织,检测Nav1.7和GFAP、OX42蛋白表达水平。结果与正常组大鼠比较,空病毒组及慢病毒载体组大鼠PMWT值以及慢病毒载体组大鼠PTWL值在建模后第1天明显下降,在建模后第3天下降达最低值,之后逐渐升高;空病毒组PTWL值在建模后第1天明显下降,在建模后第3天下降达最低值,之后较第3天升高,但仍低于基础值。与空病毒组大鼠比较,慢病毒载体组大鼠PMWT、PTWL值从建模后第3天开始逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。在建模后第3、6、13天,正常组大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表达水平基本无变化;空病毒组和慢病毒载体组大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表达水平较正常组增加,差异有统计学意义(P<0.05);慢病毒载体组大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表达水平较空病毒组下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论鞘内注射shRNA慢病毒载体可抑制大鼠DRG中Nav1.7表达,抑制脊髓胶质细胞活化,下调GFAP、OX42蛋白表达,缓解大鼠慢性炎性疼痛。

过表达Miro1慢病毒载体的构建及Miro1高表达间充质干细胞稳定转染细胞株的建立与鉴定

背景线粒体转移是干细胞发挥免疫修复功能的重要机制之一,Miro1是线粒体转移过程的关键蛋白,但其动力学研究欠缺研究模型。目的构建过表达Miro1的间充质干细胞稳转细胞株,为线粒体动力学研究间充质干细胞的抗炎修复机制提供细胞模型。方法通过PCR扩增目的基因后进行Gibson反应、转化及Gateway等方法构建载体,并对载体进行酶切鉴定。慢病毒感染间充质干细胞后,使用嘌呤霉素进行药物筛选获得稳转细胞株。后续分为三组进行相关鉴定。(1)BMSC组:正常间充质干细胞;(2)Con-BMSC组:慢病毒空载体感染的间充质干细胞;(3)Miro^(Hi)-BMSC组:过表达Miro1的慢病毒载体感染的间充质干细胞。通过RT-qPCR、Western blot检测上述三组细胞Miro1的表达水平,并进行划痕试验、水平迁移实验、成骨及成脂诱导分化以鉴定干细胞特性。结果所构建的载体完成酶切鉴定,并成功获得过表达Miro1重组慢病毒载体pLV-EGFP:T2A:Puro-EF1A>mRhot1/HA。经m RNA和蛋白水平检测,Miro^(Hi)-BMSC组的Miro1表达高于BMSC组和Con-BMSC组(P<0.05),干细胞水平、垂直迁移能力三组间差异无统计学意义(P>0.05),三组干细胞均可成功进行成脂及成骨诱导分化。结论通过慢病毒载体成功构建Miro1Hi-BMSCs稳转细胞株,且该稳转株仍保留干细胞特性,可用于间充质干细胞调控线粒体转移的相关研究。

慢病毒载体大规模生产技术的探究

为改进慢病毒载体生产过程中规模小、生产量不足以及滴度偏低等问题,采用悬浮培养293FT细胞方式,从培养基选择、细胞接种密度、质粒用量等方面对慢病毒包装条件进行优化,通过电击转染并结合生物反应器扩大生产,用离子交换色谱进行纯化以实现慢病毒大规模生产。结果显示以国产培养基M1进行前期细胞扩增培养,用3.75μg/mL质粒电击转染293FT细胞,转染后以2.0×10^(6)/m L的密度接种在优化的2 L生物反应器,用M2培养基培养,最终获得的慢病毒载体滴度达到1.8×10^(12)TU/mL。表明本团队研究的慢病毒载体大规模生产技术可以实现单批次、高滴度、无菌性慢病毒载体的生产,从而为满足临床试验与临床治疗提供基础和保障。

牛源TAK1基因慢病毒载体构建及其在MDBK细胞中的表达

为了探究转化生长因子-β激活蛋白1(TAK1)在牛疱疹病毒1型(BHV-1)感染中的作用,构建牛源TAK1基因慢病毒载体,筛选TAK1基因稳转过表达细胞株。根据GenBank中牛源TAK1基因序列(登录号:NM-001081595.1)设计引物,PCR扩增目的片段后插入载体中,构建pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro慢病毒质粒,将其导入293T细胞进行慢病毒包装及滴度测定。用包装好的慢病毒感染牛肾上皮细胞(MDBK),筛选过表达TAK1基因的稳转细胞株,通过荧光显微镜和免疫印迹试验(Western blot)进一步验证该基因的过表达。重组质粒双酶切与测序结果表明成功建立了pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro慢病毒质粒。慢病毒滴度测定结果显示,过表达TAK1基因组病毒滴度为1.0×108 TU/mL,空载体对照组病毒滴度为5.0×108 TU/mL。重组慢病毒以MOI 180转染MDBK细胞,荧光显微镜观察到明显的红色荧光,表明慢病毒质粒转染成功。Western blot结果显示,在相应分子量处检测到目的条带,进一步表明TAK1基因被表达。成功构建了pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro慢病毒质粒,并筛选出了过表达TAK1基因的MDBK稳转细胞株,为深入研究TAK1在BHV-1感染中机制的研究奠定基础。

牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1慢病毒载体构建及其对卵泡GCs凋亡的影响

旨在构建牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒载体,并将其感染牦牛卵泡颗粒细胞(granulosa cells,GCs),了解它对细胞凋亡的影响。本研究提取牦牛卵泡RNA,以RT-PCR技术扩增lncRNA ENSBGRT00000000387.1全长序列,而后构建其重组质粒,并以慢病毒包装系统(pVSVG:pMDL:pRev)包装后利用qPCR法测定在293T细胞上的感染滴度,再感染分离培养的牦牛GCs,以qPCR检测GCs中lncRNA ENSBGRT00000000387.1的表达水平,并以流式细胞仪检测GCs的凋亡率,以Western blot和qPCR分别检测促凋亡基因CASPASE3、BAX和抑凋亡基因BCL-2的mRNA和蛋白表达水平。结果显示,由牦牛卵泡中成功扩增出lncRNA ENSBGRT00000000387.1的全长2566 bp序列,将其与LV-EF1a-EGFP-2A载体同源区的片段同源重组,经酶切鉴定及测序验证表明成功构建了重组质粒,将之经慢病毒包装系统包装和浓缩后,在293T细胞的感染效率达(75.77±0.850)%,qPCR测定结果显示该慢病毒滴度为7.32×10^(8)TU·mL^(-1),表明目的lncRNA过表达慢病毒载体成功构建;以该慢病毒感染牦牛卵泡GCs的感染效率达(52.93±1.168)%,qPCR结果显示感染GCs中目的lncRNA表达水平显著升高(P<0.01);流式细胞仪检测发现慢病毒感染组细胞凋亡率显著下降(P<0.01),促凋亡基因CASPASE3和BAX在mRNA和蛋白水平的表达量显著降低(P<0.01),而抑凋亡基因BCL-2表达量显著升高(P<0.01)。本试验成功构建了lncRNA ENSBGRT00000000387.1慢病毒载体,成功感染牦牛卵泡GCs后发现其具有抑制细胞凋亡的作用,说明其可能在牦牛卵泡功能中发挥作用。

慢病毒载体p24蛋白含量的ELISA检测方法的建立与应用

测定慢病毒载体p24蛋白含量的商业化试剂盒存在成本高、检测线性范围窄和货源可控性差等不足,为解决上述问题,采用由一对鼠抗p24蛋白的单克隆抗体作为捕获抗体与检测抗体,其中检测抗体进行生物素偶联来建立p24蛋白定量的双抗体夹心ELISA检测方法。通过方阵滴定法确定双抗夹心ELISA实验中的包被抗体与检测抗体的最佳工作浓度。对该方法进行了标准曲线线性范围、定量下限、准确度、精密度、特异性等的考察。取本公司自主研发生产的6个批次的慢病毒载体样品进行p24蛋白定量检测和放置稳定性来考察方法的适用性。实验结果显示,双抗夹心ELISA方法中包被抗体和生物素标记检测抗体的最优工作浓度分别为0.8μg·mL^(-1)和0.005μg·mL^(-1),方法在1.25~80.00 ng·mL^(-1)浓度区间有最佳线性,相关系数r2>0.95。批内和批间检测高、中、低质控品的回收率在80%~120%之间,变异系数均小于10.0%,定量检测下限为1.25 ng·mL^(-1)。同一种慢病毒载体6批次的p24蛋白含量检测结果均在30%偏差范围内,4批次样本放置8 h的稳定性检测结果偏差均在10%范围内。对双抗体夹心ELISA法进行了优化开发和全面验证,旨在提升慢病毒载体p24蛋白含量的定量检测水平,以及为慢病毒载体工艺开发、质量控制和批次之间质量的一致性研究提供重要的数据支撑和理论依据。

慢病毒载体在β地中海贫血基因治疗中的研究进展

β地中海贫血(β地贫)是一种由β珠蛋白基因突变导致β珠蛋白合成障碍或结构改变而引起的常见遗传性血液病。当前针对β地贫的慢病毒载体(LVV)介导的基因治疗,主要分为利用LVV将具有完整功能的β-血红蛋白基因添加在染色体上的基因整合策略,以及利用LVV将特异性核酸酶递送到造血干细胞中,对β-珠蛋白(HBB)基因进行原位修复的基因组编辑策略。提高病毒滴度与转导效率、降低脱靶率及推进临床试验是这两种策略的主要研究方向。

TFEB基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建TFEB基因的shRNA慢病毒载体,并鉴定是否成功。采用该载体包装的慢病毒侵染所获得的细胞系可利用TFEB(转录因子EB)作为靶点,用于TFEB相关性疾病发病机制的研究及为临床疾病研究提供新的药物治疗方向。方法:利用PCR、双酶切、连接、转化等分子生物学技术构建TFEB基因的shRNA慢病毒载体,利用测序鉴定序列是否连接成功;通过RNAi技术,将构建成功的重组质粒包装成慢病毒并侵染细胞,建立敲低TFEB的细胞系,利用Western blot检测侵染及对照HeLa细胞TFEB蛋白表达水平。结果:测序结果显示pLKO.1-TFEB-shRNA重组质粒分别包含3U、OR不同干扰序列,重组质粒构建成功;Western blot检测结果表明,序列为3U和OR的慢病毒收集液侵染的细胞内TFEB表达量均降低。结论:利用序列为3U和OR的shRNA构建的重组质粒、包装的慢病毒均成功,干扰了侵染获得的细胞系中TFEB的表达。

猪SBP1基因过表达与干扰重组慢病毒载体的构建及鉴定

【目的】构建硒结合蛋白1基因(SBP1)过表达与干扰重组慢病毒载体,并通过感染猪骨骼肌卫星细胞验证SBP1基因的过表达和沉默效果,为后续揭示SBP1基因调控肌纤维类型转化及猪肉品质的分子机理打下基础。【方法】在对猪SBP1蛋白进行生物信息学分析的基础上,根据GenBank中猪SBP1基因mRNA序列(XM_021089863.1)PCR扩增SBP1基因全长序列,克隆至过表达慢病毒载体pHBLV-CMV上构建SBP1基因过表达重组慢病毒载体;同时针对猪SBP1基因设计3个干扰靶点序列和1个阴性对照序列,分别克隆至干扰慢病毒载体pHBLV-U6上构建SBP1基因干扰重组慢病毒载体。以构建的重组慢病毒载体感染猪骨骼肌卫星细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系,并采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测SBP1基因及其蛋白的表达情况。【结果】猪SBP1蛋白分子式为C_(2523)H_(3916)N_(678)O_(727)S_(24),相对分子量为56.14839 kD,理论等电点(pI)为6.40,为稳定的分泌蛋白;存在39个潜在磷酸化位点,包括20个丝氨酸磷酸化位点、6个酪氨酸磷酸化位点及13个苏氨酸磷酸化位点。以构建的SBP1基因过表达与干扰重组慢病毒载体分别感染猪骨骼肌卫星细胞,经嘌呤霉素筛选2代后,在荧光显微镜下均能观察到绿色荧光。实时荧光定量PCR检测结果表明,过表达组的SBP1基因相对表达量极显著上调32.0倍(P<0.01,下同),干扰组中以shRNA-3的沉默效果达极显著水平,对应的SBP1基因相对表达量下调58.45%;Western blotting检测结果显示,过表达组的SBP1蛋白表达量极显著上调,而shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3干扰组的SBP1蛋白表达量均极显著下调。【结论】基于猪骨骼肌卫星细胞成功构建了猪SBP1基因过表达稳定表达细胞系,同时鉴定出shRNA-3对SBP1基因的沉默效果最佳并获得稳定沉默细胞系,为后续揭示SBP1基因调控猪肉品质的分子机理打下了基础。