“脾肾相赞”理论探讨不同治法对大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化中TNF-α、JNK含量影响

目的在“脾肾相赞”理论指导下,比较不同中医治法对大鼠BMSCs成肌分化及过程中TNF-α、JNK蛋白表达的影响,分析中医治疗骨质疏松症的机制。方法将大鼠分为正常组、诱导组、补肾组、健脾组、补肾健脾组(随机数字表法),制备含药血清,选取第4代BMSCs进行实验,运用免疫荧光法分析各组成肌分化情况,酶联免疫吸附法检测TNF-α、JNK蛋白表达量。结果①BMSCs经诱导15d后,通过免疫荧光化学染色法检测MyoG荧光平均强度,结果显示:各组均显著高于正常组(P<0.01),补肾健脾组最高。②TNF-α蛋白检测:补肾组、补肾健脾组显著低于正常组(P<0.01)。③JNK蛋白检测:各组显著低于正常组(P<0.01)。结论①各治法中,补肾健脾法对大鼠BMSCs成肌分化的促进效果最佳,为通过脾肾、肌骨双方向治疗OP提供可能。②各中医治法均对大鼠BMSCs的成肌分化存在促进作用,这可能与降低TNF-α、JNK水平有关。

山柰酚对TNF-α/INF-γ诱导C2C12细胞炎症及成肌分化的作用

目的探讨山柰酚对TNF-α/INF-γ诱导C2C12细胞炎症及成肌分化的作用。方法采用生长培养基培养C2C12成肌细胞,用山柰酚(10、20、30、40、50、60μmol/L)处理24 h,CCK8法检测细胞活力。10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL IFN-γ与山柰酚(30、50μmol/L)共处理C2C12细胞24 h,RT-qPCR法检测炎性因子mRNA表达。采用分化培养基诱导C2C12细胞肌分化,在分化第5天,加入TNF-α/INF-γ与山柰酚共处理细胞24 h,RT-qPCR法检测生肌调节因子(MRFs)mRNA表达,免疫荧光观察肌管细胞形态,Western blot法检测PI3K/Akt和MAPKs相关功能蛋白表达。结果与刺激组比较,山柰酚组成肌细胞促炎因子(IL-1β、IL-6),α趋化因子(CCL 2~5)、β趋化因子(CCL 9~11)mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01);肌管细胞形态萎缩得到改善,Myogenin、Myf 6 mRNA表达和p-PI3K、p-ERK1/2蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论山柰酚通过降低促炎因子和α、β趋化因子mRNA表达抑制TNF-α/INF-γ诱导C2C12细胞炎症进程;山柰酚促进肌源性分化,其机制可能与上调PI3K和ERK1/2有关。

CircCEP85L对牛肌肉干细胞增殖、成肌分化的调控

【目的】目前,越来越多的研究证明环状RNA(circRNA)在牛肌肉发育过程中扮演着重要的角色,但其分子调控机理尚未完善。通过挖掘与牛肌肉发育相关的circRNA的作用机制,为进一步阐明其调控牛肌肉发育的分子机制奠定基础。【方法】以前期分析的增殖期(GM)与成肌分化期(DM)黄牛肌肉干细胞(MuSCs)的RNA-seq测序结果为基础,筛选出显著差异表达的circRNA,circCEP85L。采集新鲜黄牛胎牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、肠和胃的组织样本,分离培养黄牛肌肉干细胞并诱导成肌分化,收集黄牛体外培养的GM与DM细胞,分别提取RNA并反转录为cDNA。通过实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)检测circCEP85L在不同组织及不同细胞状态的表达规律。同时,设计特异性引物扩增circCEP85L全长,构建过表达载体p-circCEP85L,质粒转染MuSCs后收集过表达circCEP85L细胞样本。以过表达质粒pCD5-ciR细胞样本为对照,采用qRT-PCR、流式细胞术、Western Blot及免疫荧光等技术检测过表达circCEP85L对黄牛MuSCs增殖、凋亡及成肌分化的影响。【结果】PCR电泳结果证明circCEP85L环化位点真实存在。CircCEP85L在多种组织中表达,并在DM期的表达量显著高于GM期(P<0.001);为了进一步探究对circCEP85L黄牛MuSCs的影响。将过表达载体p-circCEP85L与对照载体pCD5-ciR转染体外培养的黄牛MuSCs,继续培养24 h之后,EdU结果表明过表达circCEP85L能显著降低EdU阳性细胞比例(P<0.001);流式周期检测结果表明,过表达circCEP85L增加了G0/G1期细胞比例,显著减少S期细胞比例(P<0.001);流式凋亡结果表明,过表达circCEP85L显著抑制MuSCs的凋亡率(P<0.05)。QRT-PCR及Western blot检测黄牛MuSCs增殖及凋亡相关基因的表达情况,结果表明过表达circCEP85L后显著降低了黄牛MuSCs增殖及凋亡相关基因的mRNA表达水平(P<0.001),凋亡蛋白BAX的表达量也显著降低(P<0.01)。此外,为了检测过表达circCEP85L对黄牛MuSCs成肌分化的影响,在转染24h后更换分化培养基诱导细胞分化,Western blot及免疫荧光结果显示过表达circCEP85L后显著促进分化标志基因MyH6的表达水平(P<0.001),细胞融合形成肌管的数量和大小均显著高于对照组。【结论】研究表明,circCEP85L通过抑制黄牛MuSCs增殖和凋亡、促进细胞成肌分化,从而影响黄牛骨骼肌的生长发育过程,为circRNA调控黄牛骨骼肌的生长发育机制研究奠定基础。

RNA甲基化转移酶METTL3对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究RNA甲基化转移酶样3(methyltransferase-like 3,METTL3)对牛骨骼肌卫星细胞(bovine skeletal muscle satellite cells,BSMSCs)增殖和成肌分化的影响。【方法】利用体外诱导BSMSCs分化模型模拟牛骨骼肌生长发育过程,采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹技术(Western blotting)检测METTL3在BSMSCs分化前后mRNA和蛋白表达水平的差异。设计合成METTL3干扰RNA(si-METTL3),且构建METTL3的过表达载体pcDNA3.1-METTL3,分别转染至BSMSCs中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测转染效果和BSMSCs增殖标志因子盒转录家族成员7(paired box 7,Pax7)的表达情况,EdU检测细胞增殖情况。将转染si-METTL3和pcDNA3.1-METTL3的BSMSCs进行体外诱导分化,通过光学显微镜观察BSMSCs进入分化期的细胞形态,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测BSMSCs分化标志因子肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)、肌细胞生成素(myogenin,MyoG)的表达情况。通过比色法检测干扰或过表达METTL3后,BSMSCs不同时期的m 6 A RNA甲基化水平。【结果】BSMSCs分化后METTL3蛋白表达水平极显著高于增殖期(P<0.01);干扰或过表达METTL3后,Pax7的mRNA水平以及蛋白水平均无显著变化(P>0.05),EdU阳性细胞率与对照组相比均无显著差异(P>0.05);干扰METTL3后,细胞肌管数量明显增多,肌管直径明显增大,MyHC的mRNA和蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),MyoG的蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),并且BSMSCs增殖和分化期的m 6 A RNA甲基化水平均极显著下调(P<0.01);过表达METTL3后,细胞肌管数量明显减少,肌管直径明显变小,MyHC的mRNA和蛋白表达水平极显著降低(P<0.01),MyoG的蛋白表达水平极显著降低(P<0.01),并且BSMSCs增殖和分化期的m 6 A RNA甲基化水平均极显著上升(P<0.01)。【结论】METTL3对BSMSCs的增殖过程没有显著影响,但对BSMSCs的成肌分化过程具有调控作用,并影响BSMSCs的m 6 A RNA甲基化水平。干扰METTL3可以促进BSMSCs的成肌分化进程,降低BSMSCs的m 6 A RNA甲基化水平;而过表达METTL3会抑制BSMSCs的分化,提高BSMSCs的m 6 A RNA甲基化水平。试验结果为进一步探明METTL3在牛肌肉发育中的调控机制奠定了基础。

绞股蓝皂苷对C2C12细胞成肌分化的影响

目的研究发现,绞股蓝皂苷不仅具有抗炎、抗衰老等多重作用,而且还能促进成骨细胞增殖分化,保护其氧化应激损伤;本研究拟探讨绞股蓝皂苷对C2C12细胞成肌分化的影响。方法完全培养基培养C2C12细胞,细胞增殖贴壁后用含有不同浓度绞股蓝皂苷的分化培养基诱导细胞分化,每个浓度均设置3个复孔;第5天观察细胞分化的形态、计算细胞的分化活力,Western blot检测相关成肌标志物MYF5和MyoD1的表达,免疫荧光检测MyoD1的表达,Image J软件计算肌管融合指数。结果诱导C2C12细胞分化的第5天可见细胞分化为典型的肌管形态,10 mg/L和5 mg/L的绞股蓝皂苷浓度干预下的MYF5和MyoD1的表达较为显著,且肌管融合指数更高,相较于对照组差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论绞股蓝皂苷可促进C2C12细胞的成肌分化,以10 mg/L和5 mg/L的浓度较好。

UCH-L3通过影响RAD51调控牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化

本研究旨在探究泛素蛋白酶体系统中羧基末端水解酶L3(Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L3,UCH-L3)通过影响RAD51调控牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的机制。使用已经建立的牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化模型,体外模拟骨骼肌的发育过程,采用免疫沉淀技术检测UCH-L3与RAD51是否相互作用,检测UCH-L3是否调控RAD51的泛素化水平,设计并合成RAD51的si-RNA,转染牛骨骼肌卫星细胞,筛选出有显著干扰效果的si-RNA,研究干扰RAD51后增殖和分化标志基因PAX7和MyHC表达水平变化,综合分析UCH-L3通过影响RAD51调控牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的机制。结果表明:过表达UCH-L3后RAD51的蛋白水平显著升高,UCH-L3可以调控RAD51的表达水平。UCH-L3与RAD51存在体内相互作用,UCH-L3可以影响RAD51的蛋白稳定性,干扰UCH-L3表达可以缩短RAD51的半衰期,UCH-L3能够调控RAD51泛素化水平,干扰RAD51后,牛骨骼肌卫星细胞增殖标志因子PAX7的蛋白水平与对照组无差异,分化标志因子MyHC的蛋白水平显著低于对照组(P<0.05),干扰RAD51表达对细胞增殖没有明显影响,但可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化。本研究结果表明,UCH-L3可以通过影响RAD51调控牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化进程。

运动对衰老骨骼肌卫星细胞成肌分化中线粒体活性氧生成的影响及调控机制

目的:观察耐力运动训练对衰老骨骼肌卫星细胞成肌分化中线粒体活性氧(ROS)生成的影响,并探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1(PGC-1α)对ROS生成调控的潜在机制。方法:C57BL/6小鼠分为青年对照组(YN组,2月龄,12只)、老年对照组(ON组,12月龄,12只)和老年运动训练组(OT组,12月龄,12只),其中OT组进行中等强度跑台训练(0°,17 m/min,25 min/天,5天/周)。12周后,HE染色鉴定骨骼肌萎缩程度。两步酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,原代培养并体外诱导成肌分化24 h。倒置显微镜观察卫星细胞成肌分化程度,测定线粒体呼吸功能、细胞ROS水平、线粒体ROS生成速率、肌球蛋白重链(MyHC)各亚基mRNA表达,及MyHC、PGC-1α、Tfam、COXⅣ、MnSOD蛋白表达量。结果:与YN组比较,ON组肌纤维横截面积、肌管形成数量、My-HC蛋白表达、MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡx mRNA表达、态3呼吸速率(ST3)、呼吸控制比(RCR)和PGC-1α、Tfam、COXⅣ、MnSOD蛋白表达均显著降低(P<0.05～0.01),ON组态4呼吸速率(ST4)、细胞ROS水平、线粒体ROS生成速率及MyHCⅡb mRNA表达显著升高(P<0.05～0.01)。与ON组比较,OT组湿重/体重比值、肌纤维横截面积、肌管形成数量、MyHC蛋白表达、MyHCⅠ、MyHCⅡa、My-HCⅡx mRNA表达、ST3、RCR和PGC-1α、Tfam、COXⅣ、MnSOD蛋白表达均显著升高(P<0.05～0.01),OT组细胞ROS水平、线粒体ROS生成速率及MyHCⅡb mRNA表达显著降低(P<0.05～0.01)。结论:耐力运动训练提高衰老骨骼肌卫星细胞成肌分化中PGC-1α表达,继而通过上调Tfam和MnSOD提高线粒体能量代谢,减少线粒体ROS产生,以促进成肌分化。

广西麻鸡m6A甲基转移酶基因表达与肌纤维类型及成肌分化的关系

【目的】肌纤维类型及其转化的调节是改善肉质的重要途径,最新研究表明,m6A RNA甲基化修饰在肌肉的分化中发挥着重要作用。以优良的地方品种--广西麻鸡作为研究对象,研究其性成熟日龄不同部位肌纤维类型的组成差异,探究m6A甲基化转移酶相关基因甲基化转移酶样蛋白3/14(methyltransferase like 3/14,METTL3/14)、Wilm肿瘤1-相关蛋白(Wilms’tumor 1-associating protein,WTAP)和病毒样m6A甲基转化酶(vir like m6A methyltransferase associated,VIRMA,也称KIAA1429)在不同部位肌肉组织和成肌细胞分化前后的表达差异,为阐明肌纤维类型组成及转换的调控机理提供参考。【方法】采用ATPase染色法比较广西麻鸡胸部、腿部和背部肌肉群7个部位肌纤维类型、直径和密度等肌纤维性状差异,采用比色法检测成肌细胞分化前后不同时间点内源性m6A甲基化水平,采用实时荧光定量PCR方法检测上述4个基因在广西麻鸡7个部位肌肉以及成肌细胞分化前后的表达差异,并将其与肌纤维性状和m6A甲基化水平进行相关性分析。【结果】广西麻鸡性成熟日龄胸部肌肉群的胸大肌和胸小肌全部由白肌纤维组成,腿部肌肉群的耻坐骨肌内侧头、腓肠肌内侧头和缝匠肌均以红肌纤维为主,而髂胫外侧肌以白肌纤维为主,背部肌肉群的背阔肌则以红肌纤维为主;总体上,红肌纤维比例多的肌肉肌纤维密度显著高于白肌纤维比例多的肌肉。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429基因表达存在显著的组织和时间特异性,总体上,在红肌纤维为主的肌肉中的表达量高于白肌纤维为主的肌肉,在分化期成肌细胞中的表达量要显著高于增殖期成肌细胞。肌肉中METTL3、METTL14和WTAP具有相似的表达模式,均在背阔肌中表达量最高,显著高于其他肌肉组织;在耻坐骨肌内侧头和腓肠肌内侧头的表达量次之,显著高于缝匠肌、胸大肌、胸小肌和髂胫外侧肌。KIAA1429基因在腓肠肌内侧头的表达量最高,显著高于其他组织;在背阔肌中的表达量次之,显著高于耻坐骨肌内侧头、缝匠肌、胸大肌、胸小肌和髂胫外侧肌;在胸大肌中表达量最低,但与在胸小肌和髂胫外侧肌中的表达量差异不显著。在鸡成肌细胞中,METTL3和METTL14基因表达变化趋势较为一致,均表现出先持续升高后下降的趋势,在刚分离0 h细胞中的表达量最低,在诱导分化后2 d(D2)细胞中的表达量最高,显著的高于增殖期和诱导分化当天(D0)细胞中的表达量。WTAP和KIAA1429基因表达变化趋势也较为一致,均呈现持续上升的趋势,在刚分离细胞中的表达量最低,显著低于其他时间点,至19 h显著上升,D0天略有增加,接着显著上升至D5天达到高峰。同时发现,随着成肌细胞的分化,内源性RNA m6A甲基化水平逐步上升,分化期的水平显著高于增殖期,在D2天甲基化水平最高,显著高于其他各时间点,随后在D5天显著下降,但略高于D0天。肌肉和成肌细胞中,METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429基因的表达两两之间均表现出极显著的正相关关系;肌肉中4个基因的表达与红肌纤维比例存在显著的正相关关系,与白肌纤维比例则呈显著的负相关关系;成肌细胞中4个基因的表达与m6A甲基化水平之间也存在正相关关系。【结论】广西麻鸡不同部位肌肉肌纤维类型组成存在差异,所研究的m6A甲基化转移酶4个基因之间协同表达,并可能对鸡肌纤维类型组成、维持及成肌细胞分化具有一定的调控作用。

miR-127-3p对C2C12细胞成肌分化和转录组的影响

前期研究表明,miR-127-3p参与骨骼肌细胞分化的调控,但对于miR-127-3p调控的靶基因及其在成肌分化中的作用还不清楚。应用qRT-PCR与细胞形态学方法研究过表达miR-127-3p对C2C12成肌细胞分化及成肌标志基因MyoD、MyoG和Myosin表达的影响;RNA-Seq分析过表达miR-127-3p对成肌细胞转录组的影响,鉴定差异表达基因并对其功能进行初步研究。结果表明,过表达miR-127-3p显著促进C2C12细胞的成肌分化与MyoD、MyoG和Myosin表达;RNA-Seq分析共鉴定到3个差异基因,均为下调基因,其中包括2个转录因子(Irf7和Ddit3)。GO与KEGG分析显示,这些差异基因显著富集于免疫和能量代谢过程/信号通路。生物信息学分析发现,miR-127-3p可与Ddit3基因的CDS区发生碱基互补配对,进而抑制其表达。表明在转录组水平上,miR-127-3p可能通过直接靶向Ddit3基因/转录因子调控免疫与能量代谢类基因的表达,进而调节成肌细胞分化。

耐力运动促进骨骼肌卫星细胞线粒体能量代谢及其对成肌分化的影响

目的:观察耐力运动训练对骨骼肌卫星细胞线粒体能量代谢的影响,并探讨其对成肌分化的调控机制。方法:C57BL/6小鼠随机分为安静对照组(N组)和运动训练组(T组)。12周训练后,两步酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,免疫化学染色鉴定卫星细胞纯度。原代培养并体外诱导成肌分化,倒置显微镜观察卫星细胞成肌分化程度。分别在分化0 h和24 h测定线粒体呼吸功能、ATP合成活力、膜电位和MyHC、COXⅣ、AMPK、p-AMPK、p21蛋白表达量。结果 :免疫化学染色显示desmin阳性细胞>90%,表明获取的卫星细胞纯度高。HE染色结果显示T组腓肠肌肌纤维横截面积显著高于N组(P<0.05)。分化0 h时,T组态3呼吸速率(ST3)、呼吸控制比(RCR)、线粒体ATP合成活力、p21表达较N组显著升高(P<0.05),p-AMPK表达显著降低(P<0.05)。分化24 h时,T组肌管形成数量及MyHC表达较N组显著升高(P<0.05),ST3、RCR、ATP合成活力、膜电位、p21及COXⅣ表达显著增加(P<0.05),p-AMPK表达显著降低(P<0.05)。结论:耐力运动训练可提高未分化卫星细胞线粒体能量代谢水平,继而抑制AMPK活化而增加p21表达,从而促进成肌分化的启动和进程。

微小RNA分子miR-21和miR-22对C2C12细胞成肌分化影响的研究

目的探讨微小RNA(microRNAs)分子miR-21和miR-22对于C2C12细胞体外成肌分化进程的影响。方法以C2C12细胞体外成肌分化为模型,Northern blot检测miR-21和miR-22两个分子在分化过程中的表达变化及组织表达谱,转染DNA/LNA杂合体反义链进行loss-of-fuction功能研究,RT-PCR分析其对分化相关分子的影响。结果成功建立C2C12细胞体外成肌分化模型,2个分子在分化过程中均表达上调,且它们具有各自的组织分布特点;建立了以DNA/LNA杂合体反义链为手段的microRNAs研究的loss-of-fuction平台;与对照组比较,抑制这2个microRNAs对于成肌分化相关的骨骼肌α-肌动蛋白、成肌素和MEF-2D等分子的表达没有影响。结论抑制miR-21和miR-22在C2C12细胞成肌分化过程中的上调不影响其分化,说明这2个分子对于分化的进程影响不大。

高糖条件下小鼠巨噬细胞对骨骼肌细胞成肌分化和胰岛素敏感性的影响

目的:探讨高糖环境下小鼠巨噬细胞对骨骼肌细胞成肌分化和胰岛素敏感性的影响。方法:Transwell小室内共培养小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12细胞和单核巨噬细胞RAW264.7细胞并给予60 mmol/L葡萄糖处理,结合培养条件随机分为单独培养对照组(SC组,n=12)、共培养对照组(CC组,n=12)、单独培养高糖组(SH组,n=12)和共培养高糖组(CH组,n=12)。相差显微镜观察细胞形态,共培养1 d和3 d后收集C2C12细胞,CCK-8检测细胞活性,免疫荧光技术检测细胞融合率和基础与胰岛素刺激的GLUT4蛋白表达,实时定量PCR检测成肌调节因子Myf5、MyoD和myogenin基因表达,2-NBDG法检测细胞基础和胰岛素刺激的糖摄取。结果:正常糖浓度下,与RAW264.7细胞共培养促进C2C12细胞肌管形成,促进E-MHC蛋白表达(P<0.01),促进MyoD和myogenin基因表达(P<0.05),提高胰岛素刺激的2-NBDG摄取(P<0.05),提高基础GLUT4水平(P<0.05)。高糖刺激抑制C2C12细胞肌管形成,抑制成肌调节因子基因表达,抑制2-NBDG摄取,抑制GLUT4表达(P<0.05)。高糖环境下与RAW264.7细胞共培养时未见明显肌管形成,与共培养对照组和单独培养高糖组相比,细胞活性、E-MHC蛋白水平、成肌调节因子基因水平、2-NBDG摄取和GLUT4蛋白水平均明显下降(P<0.05)。结论:与RAW264.7共培养促进C2C12成肌分化并提高胰岛素敏感性,高糖条件处理这一作用可逆转,抑制C2C12成肌分化的同时诱发C2C12细胞胰岛素抵抗。

小鼠骨髓间充质干细胞体外成肌分化中基质金属蛋白酶1的作用

背景:小鼠骨髓间充质干细胞体外成肌诱导分化效率较低。目的:观察基质金属蛋白酶1在体外对小鼠骨髓间充质干细胞成肌分化的作用。方法:利用差速贴壁法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定后,按照不同基质金属蛋白酶1药物处理浓度将小鼠骨髓间充质干细胞分成4组,即10μg/L组、1μg/L组、0.1μg/L组、对照组,给予相应处理后,Real-time定量PCR检测MyoD、Desmin mRNA表达,WesternBlotting检测Desmin蛋白表达。结果与结论:利用差速贴壁法分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞形态较一致,表面分子检测示CD29+、Sca-1+、CD45-、CD34-,并具有多向分化潜能;经基质金属蛋白酶1处理后,Real-time定量PCR检测示Desmin、MyoD mRNA表达上调,Western Blotting检测示Desmin蛋白表达上调,并且以上各成肌相关基因、蛋白表达增高程度与基质金属蛋白酶1具有浓度依赖性。提示基质金属蛋白酶1在体外可促进骨髓间充质干细胞向肌肉细胞分化。

MyoD介导肌肉特异性基因染色质重塑激活与成肌分化控制

骨骼肌纤维的数目由出生前肌源细胞的成肌分化进程所决定,直接影响家畜的生长潜能和肉质。Myo D依赖的肌肉特异性基因的染色质重塑激活是控制成肌分化的重要方式,其作用模式已有一些报道。PI3K/Akt和p38信号也参与了这一过程的调控。对这一研究进展进行了综述。

过表达BCOR基因抑制根尖牙乳头干细胞成肌分化

目的:研究B细胞淋巴瘤因子6共抑制因子(BCL6co-repressor,BCOR)对根尖牙乳头干细胞成肌分化能力的影响。方法:利用HA-BCOR逆转录病毒载体过表达BCOR进行获得性功能研究;Western Blot检测HA-BCOR的过表达效果;重组人肿瘤生长因子β1(TGF-β1)蛋白诱导根尖牙乳头干细胞体外成肌分化;通过检测成肌分化相关基因smoothened(SMO)、smooth muscle actin alpha2(ACTA2)和caldeson(CALD1)的表达研究根尖牙乳头干细胞体外成肌分化能力。结果:Western Blot结果显示HA-BCOR可以在根尖牙乳头干细胞有效的过表达;过表达BCOR抑制根尖牙乳头干细胞成肌分化相关基因SMO和CALD1的表达。结论:过表达BCOR基因抑制根尖牙乳头干细胞体外成肌分化,证实BCOR是根尖牙乳头干细胞成肌分化的抑制基因。

敲减DTX4表达抑制C2C12细胞成肌分化

DTX4(Deltex 4 homolog)蛋白属于Deltex家族成员;Deltex家族是Notch信号通路的调节因子.已知Notch信号通路在成肌分化中发挥重要作用.然而,DTX4是否参与调控肌肉发育尚未有报道.本研究探索DTX4对成肌分化的影响及作用机制.实时定量PCR和蛋白质印迹分析揭示,伴随小鼠C2C12成肌细胞(myoblast)分化为肌管(myotube)过程,成肌分化标志蛋白肌球蛋白重链(myosin heavy-chain,My HC)、肌细胞生成素(myogenin)表达逐渐升高,DTX4 mRNA及蛋白质表达水平也逐渐升高.通过顺序专一的siRNA敲减DTX4表达后,C2C12成肌细胞肌管面积和肌管融合指数明显减少;My HC、肌细胞生成素蛋白表达水平明显降低;但ERK信号通路未见明显变化.上述结果表明,敲减DTX4表达抑制C2C12细胞成肌分化.我们的结果提示,DTX4可能参与C2C12细胞成肌分化.

诱导骨髓间充质干细胞成肌分化时GDF-8表达的变化

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体外诱导成肌分化时转化生长因子-8(GDF-8)表达的变化。方法原代培养后扩增的第5代BMSCs以5-氮胞苷(5-Azc)进行成肌诱导分化,用免疫荧光、逆转录定量聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹(Western Blot)检测GDF-8的表达。结果体外诱导BMSCs成肌分化时免疫荧光检测发现,在不同时间点于绝大多数细胞的胞浆内都有明显的GDF-8表达,而没有用5-Azc处理的BMSCs则无表达,RT-PCR和Western Blot的检测也支持免疫组织化学的结果。结论在促使BMSCs向肌细胞分化的同时,细胞内同时也有抑制成肌分化的负性调节因子GDF-8的表达。

骨髓间充质干细胞移植与成肌分化

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC),是中胚层发育的早期细胞,具有向其他胚层分化的潜能.因其来源容易,且易于体外培养扩增及外源基因的转染和表达,移植排斥反应较弱,是很有前途的细胞工程和基因工程载体细胞之一.本文就骨髓间充质干细胞成肌分化和细胞移植治疗心血管疾病及肌病的现状及应用前景做一综述.

补骨脂素通过刺激成肌分化促进骨质疏松性骨折愈合的疗效观察

目的研究补骨脂素对成肌分化的影响,观察补骨脂素对雄性小鼠骨质疏松性骨折愈合的疗效。方法将30只雄性3月龄C57BL/6小鼠按质量随机分为:对照组、补骨脂素组,每组均15只。对照组给予生理盐水灌胃,另一组小鼠给予补骨脂素灌胃。两组均制备骨质疏松性骨折模型。在骨折术后第2天,两组小鼠给予相应灌胃干预,连续灌胃28d,隔天1次,灌胃结束后处死,取材,进行病理组织学染色、影像学观察及Western-blotting、RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)方法检测MEF2C(Myocyte enhancer factor 2C)、Myf5(myogenic factor 5)、MyoD1(myogenic regulatory protein1)Myogenin的表达量。结果Micro-CT结果显示,补骨脂素可加速骨痂形成;比目鱼肌HE染色显示,对照组肌纤维排列较疏松,而补骨脂素组肌纤维排列紧密,肌细胞较多;RT-PCR、Western-blotting结果表明,与对照组比较,补骨脂素促进胫骨后肌中MyoD1、MEF2C、Myf5、Myogenin成肌分化基因和蛋白表达(P<0.05)。结论补骨脂素促进了骨质疏松性骨折愈合,该作用可能通过增加胫骨附着肌内MyoD1、MEF2C、Myf5、Myogenin的表达实现的。

Lrtm1基因在成肌分化过程中的功能探索

目的:观察成肌分化过程中C2C12细胞Lrtm1表达;构建小鼠Lrtm1慢病毒过表达载体;筛选稳定表达外源Lrtm1细胞株诱导其分化后观察对成肌分化标志基因Myogenin、Myosin的影响;发现Lrtm1蛋白质表达水平受调控的机制。方法:诱导C2C12细胞分化用Hoechst染色细胞核;将小鼠Lrtm1基因连接到慢病毒载体质粒pLJM1-GFP上并进行慢病毒包装;筛选稳定过表达Lrtm1基因的C2C12细胞系,诱导分化Lrtm1-DDK组、GFP组检测对成肌分化标志基因Myogenin、Myosin表达的影响;MG132处理C2C12-Lrtm1-DDK细胞系后,观察内源性Lrtm1蛋白质表达。结果:诱导分化过程中,肌管形成,Lrmt1、Myosin mRNA水平随分化的进行表达上升;成功构建重组pLJM1-Lrtm1-DDK表达载体;成功筛选稳定表达外源Lrtm1细胞株;诱导稳定细胞系分化后,real-time PCR在144 h时显示Lrtm1-DDK组(272.1±18.22)Myogenin mRNA水平较GFP组(332.41±41.21)减少(P<0.05);Lrtm1-DDK组(76.11±10.47)Myogenin mRNA水平较GFP组(145.51±10.02)减少(P<0.05);C2C12细胞中Lrtm1蛋白质被蛋白酶体降解。结论:Lrtm1基因在成肌分化过程中高表达;过表达Lrtm1基因部分抑制了Myogenin、Myosin基因的表达;Lrtm1蛋白质表达水平受蛋白酶体降解调控。