铁调素干预成骨细胞(hFOB1.19)后细胞膜转铁蛋白1、铁离子、矿化及成骨基因变化研究

目的探讨铁调素对成骨细胞铁代谢指标、骨代谢指标的影响和相互关系。方法成骨细胞(hFOB1.19)培养3 d后,使用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测成骨细胞(hFOB1.19)的膜转铁蛋白1(ferroportin1,Fpn1)的表达;再用不同浓度的铁调素(25 noml/L,50 noml/L,100 noml/L)干预培养环境,对照组加相同体积双蒸水,干预20 h,MTT法检测细胞增殖情况;激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)检测成骨细胞内铁离子荧光染色后荧光强度变化情况;Von Kossa染色检测成骨细胞矿化情况;RT-PCR检测骨钙素(BGP)、I型胶原(COL1)、骨保护素(OPG)基因表达。结果 1、成骨细胞存在Fpn1表达;2、铁调素对成骨细胞增殖无显著影响(P>0.05);3、铁调素干预后,成骨细胞内铁离子含量增多,且与铁调素干预存剂量依赖性关系(P<0.05);4、铁调素干预后,成骨细胞矿化功能增强,且与铁调素干预存剂量依赖性关系(P<0.05);5、RT-PCR检测显示不同浓度铁调素干预后,各组COL1、OPG、BGP mRNA均有表达;不同浓度组的COL1、OPG、BGP mRNA表达光密度比值不同,组间密度比值比较存在统计学意义(P<0.05),但铁调素在400 nmol/L时抑制OPG的表达(P<0.05)。结论成骨细胞存在铁调素作用的膜转铁蛋白-1,所以铁调素干预成骨细胞培养环境后细胞内铁离子发生特异性变化,同时细胞矿化指标显著增加、细胞COL1、OPG、BGP mRNA表达含量增加;研究提示:铁调素可能通过膜转铁蛋白影响成骨细胞铁离子变化,细胞铁代谢变化可能引起细胞成骨指标上调改变。

携带低氧诱导因子1α慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞后成骨基因的表达

背景:人低氧诱导因子1α可调控其下游成骨及成血管基因的表达,具有提高成骨活性的作用。目的:观察携带人低氧诱导因子1α慢病毒感染的大鼠骨髓间充质干细胞中成骨基因表达情况。方法:通过RT-PCR方法从Hela细胞中获得低氧诱导因子1α,构建携带低氧诱导因子1α的慢病毒表达质粒Lenti-HIF-1α-eGFP,与LentiPac HIV混合包装质粒共包装293Ta细胞,获得病毒;采用全骨髓直接贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,使用流式细胞仪对骨髓间充质干细胞进行鉴定。分别在慢病毒感染骨髓间充质干细胞1,4,7,14 d后,用实时荧光定量PCR检测骨髓间充质干细胞中成骨基因骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶的表达水平。结果与结论:Lenti-HIF-1α-eGFP有效地感染骨髓间充质干细胞,实时荧光定量PCR检测结果显示成骨基因骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶在Lenti-HIF-1α-eGFP感染后第4天开始明显过表达,且持续至14 d。结果表明低氧诱导因子1α可以提高骨髓间充质干细胞的成骨活性。

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成骨基因表达谱的检测

目的:探讨体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)成骨相关基因的表达谱,明确体外培养大鼠骨髓MSC的成骨潜能。方法:体外培养SD大鼠骨髓MSC,取第3代细胞提取总核糖核酸(RNA),制备杂交探针,并运用SuperArray公司提供的大鼠Oligo GEArray骨再生基因芯片(每张芯片可测113种基因)进行杂交,化学发光检测,通过X线胶片或台式扫描获得化学发光的芯片图像,使用网上提供的综合型GEArry表达分析配套软件(GEArryExpression Analysis Suite)进行完整的芯片数据分析。结果:检测体外培养大鼠骨髓MSC的113种成骨相关的基因,其中有31种基因表达强度较低,45种基因呈中等强度表达,37种基因表达强度较高。结论:体外培养大鼠骨髓MSC具有部分成骨细胞基因表型特征,但成熟成骨细胞的特征基因表达量较低,提示大鼠MSC是具有较强成骨细胞分化潜能的成纤维样细胞。

辛伐他汀对成骨细胞分化和成骨基因的影响

目的探讨辛伐他汀对成骨细胞分化及成骨基因表达的影响。方法选取成骨肉瘤细胞株MG-63,采用不同浓度辛伐他汀(0.0625、0.125、0.25、0.5和1.0μmol/L)处理成骨细胞,ALP活性检测辛伐他汀对成骨细胞分化作用的影响;实时定量RT-PCR和免疫印迹检测细胞成骨基因mRNA的表达。结果通过不同浓度辛伐他汀处理成骨细胞后,不同浓度辛伐他汀组与对照组比较,成骨细胞ALP活性差异均有统计学意义(P<0.05),其中0.25μmol/L浓度组作用对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响最为显著。采用0.25μmol/L辛伐他汀处理成骨细胞后,辛伐他汀组与对照组比较,成骨细胞骨钙蛋白、ALP、I型胶原mRNA表达差异均有统计学意义(P<0.05)。结论辛伐他汀可能通过上调成骨基因mRNA的表达水平来促进其分化,这为他汀类药物治疗骨质疏松症提供新的干预靶点。

国产多孔钽对成骨细胞生物相容性及其相关成骨基因表达的影响

目的 探讨国产多孔钽材料对成骨细胞粘附、增殖及成骨基因OPN、OC及FN mRNA表达的影响。 方法 分离培养新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞并鉴定。根据国家标准制备多孔钽浸提液，以多孔钽浸提液与成骨细胞作为实验组，以DMEM完全培养基培养成骨细胞作为对照组。MTT法检测多孔钽浸提液对成骨细胞生长及增殖的影响；倒置相差显微镜及扫描电镜观察成骨细胞在多孔钽上粘附、生长及增殖的情况；实时荧光定量PCR技术检测OPN、OC及FN mRNA的表达并进行定量分析。 结果 肉眼及扫描电镜观察多孔钽外观呈深灰色、多孔状三维立体结构，表面及断面均匀分布直径400～600 μm的微孔，内部孔隙相互连通。MTT法检测结果显示，实验组及对照组成骨细胞培养1～8 d，除第3天外，各时间点细胞光密度值差异无统计学意义（P〉0.05）。成骨细胞种植于多孔钽培养结果显示，材料表面和孔隙内细胞叠层生长，分泌的骨基质完全覆盖材料表面。实时荧光定量PCR检测结果显示，实验组成骨基因OPN、OC、FN mRNA的相对表达量分别为1.45、1.79、1.69。 结论 国产多孔钽材料具有良好三维立体空间构型及良好的生物相容性，可刺激成骨细胞的粘附、增殖及成骨基因OPN、OC及FN mRNA的表达。

降钙素基因相关肽基因转染干细胞移植在兔股骨头坏死模型中的成骨基因表达

目的 观察人降钙素基因相关肽α（hCGRPα）转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）联合自体骨移植在兔股骨头坏死（ONFH）模型中成骨基因的表达.方法 采用液氮冷冻法成功制作出家兔股骨头坏死兔.将72只ONFH模型兔随机分为3组.hCGRPα基因转染BMSCs组（A组）：将hCGRPα基因转染BMSCs移植于股骨头内;BMSCs组（B组）：植入BMSCs;无关序列组（C组）：植入干细胞为无关基因BMSCs.3组中均同时将自体骨植入股骨头.于实验第1个月末观察兔股骨头的细胞内hCGRPα和成骨基因骨钙素的表达.结果 将hCGRPα基因转染BMSCs植入股骨头1个月时,A、B、C组中hCGRPα mRNA与其蛋白的相对表达量分别为0.84±0.06、0.31±0.02、0.29±0.02与0.76±0.07、0.21±0.02、0.18±0.02.3组中骨钙素mRNA与其蛋白的相对表达量分别为0.76±0.07、0.39±0.04、0.29±0.04与0.68±0.06、0.33±0.03、0.31±0.03.A组股骨头细胞中hCGRPα基因和骨钙素基因均呈高表达,明显高于B组和C组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 hCGRPα修饰BMSCs植入ONFH动物模型股骨头中,可促进细胞中成骨因子hCGRPα和骨钙素基因的表达.

Nel样Ⅰ型分子基因及其促进成骨作用的研究进展

Nel样Ⅰ型分子基因作为一种新发现的颅颌面组织特异性的成骨相关基因,可能操纵了成骨基因的下游途径,并影响了信号通路,促进成骨细胞的分化。对于它的研究可能成为颅颌面骨组织工程中新的研究热点。本文对此基因的发现、作用机制和在骨组织工程中的应用前景作一综述。

体外培养人牙周膜细胞成骨基因表达谱的检测

目的:探讨体外培养人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDL)成骨相关基因的表达谱,明确体外培养人牙周膜细胞的成骨潜能。方法:消化离心法收集体外培养人牙周膜细胞,提取总RNA,使用Super-array公司的点样数96点的人骨再生基因表达谱芯片检测人牙周膜细胞成骨相关基因的表达。结果:体外培养人牙周膜细胞有15种成骨相关基因无表达,81种基因有表达,其中表达较高的基因22种。结论:体外培养人牙周膜细胞具有部分成骨细胞基因表型特征,但成熟成骨细胞的特征基因表达量较低,提示人牙周膜细胞是具有成骨细胞分化潜能的成纤维细胞。

双基因重组载体转染乙醇诱导的兔干细胞对其成脂与成骨基因表达的影响

目的观察双基因重组载体转染乙醇诱导的兔干细胞对其成脂与成骨基因表达的影响。方法取第3代兔骨髓间充质干细胞（BMSCs），随机分为6组：（1）正常组：正常BMSCs，无特殊处理。以下5组均给予终质量浓度0.09 mol/L乙醇。（2）模型组：无基因转染BMSCs；（3）无关序列组：10 μl无关序列载体转染BMSCs；（4）干扰过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）表达组（siPPARγ组）：10 μl siPPARγ基因载体转染BMSCs；（5）exCGRP组：10 μl降钙素基因相关肽（CGRP）基因载体转染BMSCs；（6）双基因组：10 μl双基因重组载体转染BMSCs。实验第7、14天检测各组细胞中PPARγ、CGRP、Runt相关基因2（Runx2）、骨钙素mRNA与其蛋白表达。结果实验第7天，双基因组、siPPARγ组、正常组中PPARγ mRNA与蛋白均呈低表达（0.329±0.037与0.162±0.013、0.413±0.045与0.174±0.023、0.376±0.042与0.169±0.021），明显低于模型组（0.672±0.079与0.871±0.096）、无关序列组（0.674±0.083与0.823±0.089）、exCGRP组（0.683±0.079与0.839±0.091），差异均有统计学意义（均P＝0.000）。双基因组、exCGRP组中均明显表达CGRP mRNA与蛋白，显著高于模型组、无关序列组、siPPARγ组、正常组，差异均有统计学意义（均P＝0.000）。双基因组、exCGRP组、siPPARγ组、正常组中Runx2 mRNA、骨钙素mRNA与蛋白均呈高表达，双基因组显著高于模型组、无关序列组，且明显高于exCGRP组、siPPARγ组、正常组，差异均有统计学意义（均P＝0.000）。实验第14天，各组表达量与第7天一致。结论双基因重组载体转染乙醇诱导的兔干细胞，能够同时高效阻止细胞中成脂基因表达并上调成骨基因表达，显著优于单一基因的作用。

微图案化表面对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制

目的探讨两种形状微图案化表面对大鼠骨髓间充质干细胞(r BMSCs)成骨分化的影响及机制。方法利用q RT-PCR技术检测三角形和圆形微图案化表面上r BMSCs成骨基因Runx-2、Opn、Alp、Col-1、Ocn和成脂基因Pparγ、C/ebpα、AP2的表达情况,利用免疫荧光和q RT-PCR技术检测三角形微图案化表面上Piezo1、F-actin、Myosin和YAP的表达情况。结果三角形微图案化表面上r BMSCs的成骨基因Runx-2、Opn、Alp、Col-1、Ocn的表达均升高,且边长为15μm时表达最强,而成脂基因Pparγ、C/ebpα、AP2表达均降低。在圆形微图案化表面,r BMSCs的成骨和成脂基因表达均下调。此外,在15μm三角形微图案化表面上,r BMSCs的Piezo1、F-actin、Myosin和YAP表达均升高。通过使用Piezo1抑制剂Dooku1处理,观察到这些蛋白的表达均降低,且细胞的成骨能力受到抑制。结论三角形微图案化表面能够显著促进r BMSCs的成骨分化,尤其是在边长为15μm时效果最为显著。该表面通过Piezo1信号通路促进r BMSCs成骨分化,涉及的关键信号分子包括Piezo1、F-actin、Myosin和YAP。

中药及其活性成分诱导骨髓间充质干细胞成骨分化相关信号通路的研究进展

诱导骨髓间充质干细胞分化的常规方法存在成本高和安全性问题。研究发现中药及其有效成分具有与细胞因子类似的生理活性,可通过多渠道影响骨髓间充质干细胞的增殖及分化过程,增强与成骨相关基因的转录与表达,这一发现对于治疗骨质疏松和骨缺损等疾病具有潜在价值,但其具体作用机制仍需深入研究。笔者旨在综述中药及其有效成分在诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程中Wnt/β-catenin、BMP/Smad、PI3K/AKT、p38 MAPK和Hedgehog相关信号通路及机制,以期为骨科疾病的防治、中医药开发、细胞与组织工程等科学技术领域的研究提供参考。然而,现有研究中多通路的复杂调节知之甚少,因此未来研究应关注多通路间的交互作用和协同效应。同时,鉴于中药成分的复杂性和潜在的毒副作用,未来研究需在保证安全性的基础上,探索更有效的成分组合和剂量优化,提高骨髓间充质干细胞诱导分化效率和稳定性。此外,结合传统中医理论与现代医学,开发新的治疗策略,为骨科疾病防治提供新的方向。

骨形成相关基因的研究进展

骨组织形成是一个由多种生长因子调节的复杂而有序的过程。骨组织的形成是生物大分子在细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的信息传递及类骨质形成、类骨质钙化的过程。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞,负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨细胞是骨形成的前提,骨矿化、钙化是骨形成的关键过程。很多骨生长因子可调节这几个阶段,从而最终调控骨形成。骨在形成过程中也不断地进行骨重塑和骨改建来适应外界因素的变化。

MAPK-ERK1/2信号通路调控成骨性基因表达和细胞增殖

目的观察在不同浓度大鼠血清作用下,激活或抑制MAPK-ERK1/2信号通路对大鼠成骨细胞的成骨性基因表达和增殖的影响。方法原代培养大鼠成骨细胞,进行形态和碱性磷酸酶初步鉴定后,分别用1%和5%的大鼠血清进行培养24 h,WB检测MAPK-ERK1/2信号通路蛋白p-ERK1/2和ERK1/2表达,同时检测成骨性基因(Runx2、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶)和增殖蛋白PCNA的表达;MAPK-ERK1/2信号通路阻断剂PD0325901抑制P-ERK1/2的表达后观察对Runx2、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶和增殖蛋白PCNA的表达。结果 5%大鼠血清激活p-ERK1/2水平明显高于1%大鼠血清(P<0.05),在MAPK-ERK1/2高水平激活状态下,成骨性基因如Runx2、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶的表达水平出现显著的增加及促进PCNA的表达;当抑制MAPK-ERK1/2信号通路时,成骨性基因Runx2、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶的表达水平也随之下调,且PCNA表达也受到抑制。结论激活MAPKERK1/2通路促进成骨基因表达和成骨细胞增殖,抑制此通路将抑制成骨性基因表达和细胞增殖,此通路可能作为治疗骨质疏松症的药物靶点。

实时定量PCR检测Nel样I型分子基因对大鼠骨髓基质细胞成骨相关基因表达的影响

目的:研究Nel-like1型分子(Nell-1)基因对体外培养大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,bMSCs)成骨相关基因表达的影响。方法:取6周龄雄性Fischer344大鼠胫骨和股骨骨髓体外培养,以腺病毒为载体,进行基因转染,绘制生长曲线并测定转染效率。以转染β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase,LacZ)基因的bMSCs为对照组,转染Nell-1的bMSCs为试验组,用实时定量PCR(real-time PCR)测定成骨相关基因碱性磷酸酶基因(alkaline phosphatase,ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨钙素(osteocalcin,OC)、骨桥蛋白(osteopontin,OP)和Sox9的表达。以2-ΔΔCT法计算基因表达的相对比值。结果:随着Nell-1基因转染滴度的增高,细胞增殖速度减慢。基因转染效率随滴度增加而增高。Nell-1基因转染大鼠bMSCs,早期下调、中期和晚期上调ALP的表达,晚期上调OC的表达,整个成骨周期中均上调OP和BSP的表达。结论:Nell-1基因可能通过影响各成骨相关基因的表达而促进大鼠bMSCs的成骨分化。

钛表面锶改性后骨髓基质干细胞黏附、迁移、增殖及成骨相关基因的表达

背景:锶是一种既刺激骨形成、又抑制骨吸收的元素,纯钛种植体表面锶改性促进骨质疏松状态下种植体骨结合是当前研究的热点,具有非常重要的意义。目的:探讨改良锶改性纯钛表面对大鼠骨髓基质干细胞黏附、铺展、迁移、增殖及成骨相关基因表达的影响。方法:将TA2纯钛片打磨清洗后,依次放于5mol/L NaOH溶液、100mmol/L醋酸锶溶液内处理,并以600℃或者700℃进行热处理1h,去离子水80℃水化处理(W)24 h,以纯钛为对照,共分为5组,分别为Ti、Sr600、Sr600W、Sr700、Sr700W组。采用全骨髓培养法获取大鼠骨髓基质干细胞,将改性钛片置于24孔培养板中与细胞悬液培养,CCK-8法检测骨髓基质干细胞的黏附和增殖情况。骨髓基质干细胞与钛片共培养24 h后对细胞肌动蛋白进行染色,观察细胞黏附伸展形态;通过细胞划痕实验和荧光染色,观察骨髓基质干细胞在各组钛片表面迁移的能力;qRT-PCR法检测各组细胞Ⅰ型胶原、Runx2、骨保护蛋白、RANKL、骨桥蛋白的mRNA表达。结果与结论:锶改性纯钛片可以促进骨髓基质干细胞的铺展、迁移。在5d和7d时,锶改性钛片表面细胞增殖较纯钛组均明显升高(P<0.001)。在5d时,Sr700组的细胞增殖数目较Sr600组高(P<0.01)。在14 d时,锶改性纯钛片可以促进骨髓基质干细胞Ⅰ型胶原、Runx2、骨桥蛋白的表达。结果表明,改良锶改性纯钛可以促进大鼠骨髓基质干细胞的黏附、铺展、迁移、增殖及成骨相关基因的表达,水化处理对大鼠骨髓基质干细胞成骨向分化具有促进作用。

人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达

目的:系统研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。方法:应用密度梯度离心法分离hBMSCs,取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定;应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。结果:第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90,具有成脂和成骨分化潜能。成骨相关基因在诱导早期部分表达,中期均有表达,基因表达大部分在14天达高峰,与矿化相关的基因表达在21天达高峰。结论:hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达,其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。

纳米淡水珍珠粉对成骨相关基因表达的影响

背景:珍珠中高含量的钙离子可以促进钙盐沉积,抑制破骨细胞的骨吸收活性,促进骨再生,且其含有的水溶性蛋白具有骨诱导作用,可促进成骨细胞的分化。目的:观察纳米淡水珍珠粉对成骨细胞成骨相关基因表达的影响。方法:取第3代小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞,分别与纳米淡水珍珠粉(实验组)、纳米羟基磷灰石(对照组)共培养,以单独培养的细胞为阴性对照。培养7 d后,采用RT-PCR实验检测各组Runx2、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果与结论:①实验组、对照组Runx2与骨桥蛋白mRNA表达量高于阴性对照组(P<0.05),并且实验组Runx2与骨桥蛋白mRNA表达量高于对照组(P<0.05);②实验组Ⅰ型胶原mRNA表达量高于对照组、阴性对照组(P<0.05),对照组与阴性对照组Ⅰ型胶原mRNA表达量比较差异无显著性意义(P>0.05);③结果表明,纳米淡水珍珠粉较纳米羟基磷灰石更能显著促进成骨相关基因Runx2、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原mRNA的表达。

山羊骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导后成骨分化相关基因表达的变化

目的:研究山羊骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导后成骨分化相关基因ALP、OCN、COL I mRNA表达水平的变化。方法:采用全骨髓培养法培养骨髓基质干细胞,使用成骨条件培养液体外诱导成骨细胞,通过细胞形态学观察、免疫组化染色、钙结节等检测手段进行成骨细胞鉴定,采用RT-PCR和实时定量PCR检测诱导2周后骨髓基质干细胞ALP、OCN、COL I的表达水平,未诱导的骨髓基质干细胞作为对照组。结果:通过成骨细胞鉴定,骨髓基质干细胞成功诱导分化为成骨细胞;OCN和COL I基因在细胞诱导组表达上调,ALP基因表达在诱导组和未诱导组间无显著差异。结论:成功诱导山羊BMSCs向成骨细胞分化,成骨分化相关基因在诱导后为适应成骨细胞的功能发生变化。

人成骨蛋白成熟肽基因在毕赤酵母中的克隆及其序列分析

采用PCR方法,根据文献报道的人成骨蛋白-1(OP-1)成熟肽基因序列,设计并合成一对引物,从含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小为420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段,继之以pPIC3.5K为表达载体构建重组表达质粒,并经PCR及酶切鉴定。

初级纤毛对人牙周膜细胞成骨相关基因表达的影响

目的:通过沉默纤毛运输蛋白88(intraflagellar transport 88,IFT88)基因抑制人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)中初级纤毛的形成,进一步研究其对hPDLCs成骨相关基因表达的影响。方法:实验分为对照组和shIFT88组。对照组感染无意序列,shIFT88组感染含IFT88基因有效短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)的慢病毒。qRT-PCR、Western blot检测各组细胞中IFT88表达情况,免疫荧光检测初级纤毛形成,qRT-PCR检测成骨相关基因COL1A1,OCN,Runx2,BMP2表达量的变化。结果:与对照组相比,shIFT88组IFT88表达量明显下调(P<0.01),纤毛率降低(P<0.01),成骨相关基因COL1A,OCN,Runx2,BMP2基础表达量明显下调(P<0.01)。结论:沉默IFT88基因后,hPDLCs初级纤毛形成受阻,成骨相关基因表达量明显下调。