藤黄健骨胶囊通过SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路抑制绝经后骨质疏松大鼠成骨细胞凋亡

藤黄健骨胶囊可以提高绝经后骨质疏松模型鼠的骨密度来改善其骨微结构损害,但具体机制尚未阐明。本文主要研究藤黄健骨胶囊抑制绝经后骨质疏松症大鼠成骨细胞凋亡与SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路的关系,旨在探讨藤黄健骨胶囊对绝经后骨质疏松症的作用机制。采用去卵巢法建立绝经后骨质疏松大鼠模型,分别给予藤黄健骨胶囊(0.09、0.18、0.36 g/kg)灌胃,连续干预8周后进行指标检测。采用TUNEL染色观察股骨组织凋亡情况,结果发现,藤黄健骨胶囊各剂量组股骨组织凋亡阳性细胞和凋亡率均减少(P<0.01)。采用双重免疫荧光染色观察股骨组织成骨细胞中SIRT1、PGC-1α和Nrf2表达水平表达情况,结果发现,藤黄健骨胶囊中、高剂量组成骨细胞PGC-1α表达荧光面积明显升高,各剂量组成骨细胞SIRT1和Nrf2表达荧光面积也明显升高(P<0.01)。qPCR和Western印迹检测股骨组织SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Runx2、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表达水平和翻译水平变化,结果显示,藤黄健骨胶囊中、高剂量组股骨组织Runx2 mRNA水平和蛋白质水平、Nrf2蛋白质水平均明显升高,Caspase-9蛋白质水平明显下降,各剂量组股骨组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2 mRNA水平和蛋白质水平、Nrf2 mRNA水平也均明显升高,而其各剂量组股骨组织Caspase-3mRNA水平、蛋白质水平和Caspase-9 mRNA水平均则明显降低(P<0.01)。综上,本研究初步揭示了藤黄健骨胶囊对绝经后骨质疏松模型鼠成骨细胞凋亡的抑制与SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路有关,SIRT1可能是调控成骨细胞凋亡的重要靶点。

肿瘤坏死因子-α诱导成骨细胞凋亡时Bcl-2和Bax蛋白表达变化

目的:了解成骨细胞凋亡发生机制,观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导大鼠成骨细胞凋亡过程中Bcl-2,Bax蛋白表达变化及意义。方法:以原代培养的SD大鼠颅骨成骨细胞为实验对象,分别用含量为0,10,20,30,40μg/LTNF-α刺激成骨细胞。通过对细胞活性、超微结构变化观察TNF-α对成骨细胞凋亡的诱导作用;同时检测细胞Bcl-2,Bax蛋白表达变化。结果:随刺激含量的加大,成骨细胞的活性逐渐降低,细胞凋亡逐渐增加。TNF-α含量为<30μg/L时Bax表达呈稳步上升趋势,30～40μg/L时开始下降。Bcl-2表达在含量为10μg/L的时候轻度上升,在20μg/L回复到正常,后随着剂量的加大Bcl-2表达开始明显下降,30～40μg/L时下降非常显著。对于Bax/Bcl-2相对表达强度与细胞死亡率做相关性分析两者呈显著性正相关(n=25,r=0.827,P<0.001)。结论:蛋白相对比例是决定成骨细胞对TNF-α诱导凋亡的易患性的重要因素。

整合素在牙龈蛋白酶诱导人成骨细胞凋亡中的表达变化及其机制

目的探讨整合素α5、β1在牙龈蛋白酶诱导人成骨细胞凋亡中的表达变化及其机制。方法厌氧环境下培养牙龈卟啉单胞菌,分离牙龈蛋白酶。用6.840 U/L的牙龈蛋白酶处理人颅骨成骨细胞(HCO)48 h,生物素原位缺口末端标记法(TUNEL)-4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光双染色法检测细胞凋亡情况;Western印迹检测不同牙龈蛋白酶浓度和不同作用时间HCO中整合素a5、β1蛋白表达变化;用磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信号通路抑制剂LY294002处理HCO后观察不同时间点整合素a5、β1蛋白表达变化。结果 TUNEL-DAPI染色显示,牙龈蛋白酶作用48 h后阳性对照组及观察组HCO凋亡的细胞数目较空白对照组明显增多。与空白对照组相比,牙龈蛋白酶可明显下调HCO中整合素α5、β1蛋白表达水平,且随浓度增加逐渐增强,各浓度之间差异有统计学意义(P<0.05)。随着牙龈蛋白酶作用时间延长,HCO中整合素α5、β1蛋白表达水平逐渐下调,各时间点之间差异均有统计学意义(P<0.05);整合素β1蛋白表达水平降低程度明显大于整合素α5,牙龈蛋白酶作用16 h、24 h、48 h、72 h时整合素β1蛋白表达水平均明显低于同期整合素α5,差异有统计学意义(P<0.05)。LY294002处理HCO后,各时间点整合素α5、β1蛋白表达水平之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论牙龈蛋白酶通过PI3K-AKT信号通路下调整合素α5、β1表达来诱导人成骨细胞凋亡,且呈时间和剂量依赖性。

流体剪切力对成骨细胞凋亡及bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的影响

目的:探讨流体剪切力对成骨细胞凋亡及相关蛋白bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响。方法:对培养的第3代新生大鼠成骨细胞分别加载0(对照组)、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0Pa流体剪切力1h后,静止培养24h。应用TUNEL法检测凋亡,采用免疫组化法检测bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白。采用SPSS11.5软件包对数据进行单因素方差分析。结果:在0、0.6、1.0、2.0Pa组,细胞凋亡及bcl-2、Caspase-3表达量无显著差异,P>0.05。3.0、4.0、5.0Pa组间,随剪切力增大,细胞凋亡增加,Bcl-2表达量减少,Caspase-3增加,P<0.05。所有实验组间Bax无显著差异,P>0.05。结论:生理范围的流体剪切力对成骨细胞凋亡无影响,而过大力值导致bcl-2表达减少,进而活化caspase-3,成骨细胞凋亡增加。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路探讨健骨颗粒对UMR-106细胞内质网应激凋亡的影响

目的探讨健骨颗粒含药血清对UMR-106成骨样细胞内质网应激ERS凋亡的影响和作用机制。方法选用UMR-106成骨样细胞,采用0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L不同浓度的GSK2606414(PERK抑制剂)对细胞进行干预,采用CCK8法筛选GSK2606414最佳干预浓度。将生长状态较好的UMR-106细胞随机分为阴性对照组(NC组)、模型组(H_(2)O_(2)组)、健骨颗粒组(H_(2)O_(2)+JG组)和阳性对照组(H_(2)O_(2)+GSK2606414组)4组。NC组和H_(2)O_(2)组采用10%生理盐水血清干预12 h,H_(2)O_(2)+JG组采用10%健骨颗粒含药血清干预12 h,H_(2)O_(2)+GSK2606414组采用0.03μmol/L的GSK2606414和10%生理盐水血清干预12 h,除NC组外,其余各组在不更换新培养基的情况下,再分别加入10μmol/L H_(2)O_(2)干预12 h。采用激光共聚焦显微镜观察细胞内NC组和H_(2)O_(2)组GRP78和Caspase-12荧光表达情况,DCFH-DA检测活性氧(ROS)含量,激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子实时动态变化判断ROS/ERS模型是否成立。再采用An⁃nexin V-FITC/PI检测4组细胞晚期凋亡率,qPCR和Western blot检测4组ERS相关标志指标GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量。结果与0μmol/L组比较,0.03μmol/L的GSK2606414是干预UMR-106细胞12 h后对细胞活力没有影响的最大浓度,故使用该浓度作为后续H_(2)O_(2)+GSK2606414组的实验干预条件。与NC组相比,H_(2)O_(2)组ROS含量显著增高(P<0.01),GRP78和Caspase-12的蛋白荧光表达量明显增加,细胞内钙离子流动速度加快并持续增高,表明H_(2)O_(2)诱导UMR-106细胞ROS/ERS模型的成功建立。与NC组相比,H_(2)O_(2)组凋亡率显著增高(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量均显著增高(P<0.01)。与H_(2)O_(2)组相比,H_(2)O_(2)+JG组和H_(2)O_(2)+GSK2606414组ROS含量显著降低(P<0.01),凋亡率显著降低(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平(P<0.05)和蛋白相对表达量(P<0.01)均显著降低。结论健骨颗粒可通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路缓解内质网过度应激,降低成骨细胞凋亡率,发挥防治绝经后骨质疏松症的作用。

脑源性神经生长因子对成骨细胞凋亡的影响及其机制

成骨细胞是骨形成中重要的功能细胞，过多或过快的凋亡会使骨代谢紊乱，进而引起骨量减少、骨骼微结构变化、弹性下降及骨质变脆。研究结果显示，脑源性神经生长因子（BDNF）与成骨细胞凋亡密切相关，但具体的作用及机制未知。我们通过在体外培养的成骨细胞中加入BDNF，探讨BDNF对成骨细胞凋亡的影响及其机制。

肿瘤坏死因子α诱导人成骨细胞和人成骨细胞系HOS-8603凋亡的作用

目的:观察不同浓度重组肿瘤坏死因子α对于培养的人原代成骨细胞和人成骨细胞系HOS-8603的凋亡作用,并分析浓度效应。方法:实验于1998-04/2000-04在第二军医大学卫生毒理学教研室完成。在人成骨细胞和人成骨细胞系HOS-8603中,实验组加浓度为1,10,100,1000ng/L的肿瘤坏死因子α,对照组加等量的无肿瘤坏死因子培养基,培养后检测细胞活力应用噻唑兰法,检测细胞凋亡情况应用DNA梯形条带和透射电镜等方法。结果:①肿瘤坏死因子α对培养成骨细胞和HOS-8603细胞的作用(噻唑兰法):肿瘤坏死因子α浓度为100和1000ng/L实验组均高于对照组犤成骨细胞:(0.14±0.006),(0.10±0.010),(0.27±0.013)ng/L;HOS-8603细胞:(0.15±0.012),(0.09±0.015),(0.27±0.013)ng/L,P<0.05犦。②DNA梯形条带结果:凋亡细胞使DNA在核小体外降解,形成180～200bp或与之成倍的DNA片段。在琼脂糖凝胶电泳时呈现梯形结果。在肿瘤坏死因子α浓度为1000ng/L时,成骨细胞可检测到典型DNA梯形条带。③成骨细胞的凋亡情况:应用透射电镜检查,浓度为1000ng/L实验组较浓度为100ng/L实验组凋亡细胞多。肿瘤坏死因子α同样可以诱导HOS-8603的凋亡,未加肿瘤坏死因子α时,凋亡很少,加入100ng/L及1000ng/L肿瘤坏死因子α时,凋亡细胞数量明显增加。结论:肿瘤坏死因子α质量浓度达到100g/L时,可以引起体外培养的成骨细胞和成骨细胞系HOS-8603细胞凋亡,并随浓度加大出现凋亡细胞增多的剂量-效应关系,结果验证了肿瘤坏死因子能刺激成骨细胞凋亡的假说。

咖啡酸苯乙酯对地塞米松作用下成骨细胞凋亡的影响

糖皮质激素性骨质疏松症（GIOP）是糖皮质激素诱导的以骨量丢失、骨微观结构破坏、骨脆性增加为特征的继发性骨质疏松症。本研究旨在探讨咖啡酸苯乙酯（CAPE）对地塞米松诱导小鼠MC3T3-E1细胞凋亡的影响及其机制。

人脐带血干细胞外泌体对大鼠股骨头坏死的影响

[目的]探讨人脐带间充质干细胞外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cell-exosomes, hUCMSC-Exos)防治大鼠激素性股骨头坏死的疗效及其潜在机制。[方法] 36只雄性7周龄Sprague-Dawley大鼠随机分为3组,每组12只。空白对照组给予0.9%的盐水静脉注射;模型组给予静脉注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和甲泼尼龙(methylprednisolone,MPS)制备股骨头坏死模型;外泌体组在模型组给予的基础上,静脉注射hUCMSC-Exos。在第28 d处死大鼠,取股骨头行组织学Micro CT检测。[结果]透射电子显微镜和Western blot的检测表明,所提取分离物符合Exos基本特征。HE染色组织形态观察,三组的空骨陷窝率:模型组>外泌体组>空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。TUNEL染色成骨细胞凋亡率,模型组>外泌体组>空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Micro CT检测方面,与空白对照组相比,模型组大鼠的BV/TV、Tb.Th、Tb.N数目均显著降低(P<0.05),而Tb.Sp显著升高(P<0.05);与模型组比较,外泌体组大鼠的BV/TV、Tb.Th、Tb.N数目均显著升高(P<0.05),而Tb.Sp显著降低(P<0.05)。[结论]人脐带间充质干细胞外泌体可能通过抑制成骨细胞凋亡,预防大鼠激素性股骨头坏死。