扩增子测序技术在中药分子鉴定中的应用

中药鉴定是保证中药用药安全的关键环节。中药分子鉴定通过分析遗传物质的差异实现鉴定,弥补了传统鉴定方法主观性较强的不足,成为中药鉴定方法的有力补充。扩增子测序技术通过对特定片段进行扩增,结合不同测序技术实现物种鉴定。文章对扩增子测序技术在生物鉴定中的优势、扩增子测序技术在中成药及中药材中的应用,以及扩增子测序技术在中药鉴定中的关键技术步骤进行总结梳理,分析扩增子测序技术在中药分子鉴定中的应用现状及未来发展,为后续中药分子鉴定工作提供研究思路。

扩增子与宏基因组策略在猴痘病毒全基因组测序考核中的应用比较

目的比较扩增子与宏基因组测序在猴痘病毒全基因组测序考核中的应用效果,为猴痘病毒测序溯源与疫情防控提供技术参考。方法扩增子测序:对猴痘DNA先进行全基因组靶向扩增,再对扩增产物进行二代测序;宏基因组测序:对猴痘DNA直接进行二代测序。获得序列后使用CLC、IGV等软件分析2种不同测序方法的有效数据百分比、测序深度及不同测序深度下的病毒全基因组测序覆盖度等质量参数,评估测序质量。使用Nextclade进行病毒分型、序列突变及缺失情况分析,比较2种测序方法所获得序列的一致性及完整性。结果使用猴痘参比毒株MPXV-M5312_HM12_Rivers全基因序列(GenBank登录号:NC_063383.1)进行拼接后,扩增子测序和宏基因测序所获得有效数据百分比分别为99.72%和7.54%,测序深度范围分别为0×~334839×和44×~1000×,测序深度10×以上的位点覆盖度分别为90.3%和100%。通过IGV查看全基因组在不同测序深度下的覆盖情况发现,宏基因测序的全基因组位点测序深度覆盖均匀,而扩增子测序的全基因组位点测序深度覆盖不均、差异明显。病毒分型及序列一致性分析显示,2种方法所获得序列均为猴痘病毒IIb B.1分支,与参比序列相比宏基因测序结果存在73个突变位点,扩增子测序存在68个突变位点,深入分析发现扩增子测序有7个IIb B.1分支的共有突变位点未测到,还存在2个假阳性私有突变位点。结论在猴痘病毒全基因测序中可灵活使用扩增子测序或宏基因组测序方法,其中扩增子测序可以获得更多的有效数据量,而宏基因组测序在序列覆盖的均一性和准确性方面较好,本研究旨在为提高猴痘病毒全基因组测序成功率提供一点启发与技术参考。

扩增子测序技术在牡蛎GⅡ型诺如病毒基因多样性研究中的评估

牡蛎中诺如病毒基因多样的研究对病毒的流行传播和疫情防控具有十分重要的意义,二代测序技术(next generation sequencing, NGS)的扩增子测序具有高通量、高准确性等优势,被广泛应用于基因组学、转录组学和表观基因组学等领域。为评估扩增子测序技术对牡蛎中诺如病毒多样性研究的可行性,采用经典的巢式反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)方法对人为污染诺如病毒的牡蛎样品进行检测并将产物进行扩增子测序,对病毒基因型覆盖度和灵敏度进行分析。结果显示,在覆盖度方面,扩增子测序技术能够检测出人为添加到牡蛎中的6种GⅡ型诺如病毒,覆盖率达到100%;在灵敏度方面,对人为污染有不同数量诺如病毒的牡蛎进行检测及测序分析,证实扩增子测序的灵敏性较高,低于50个病毒粒子也能检测出。综上,扩增子测序技术提高了牡蛎中诺如病毒检测的准确性以及基因型的丰富度。

黄瓜基于扩增子测序的TILLING技术体系的建立

定向诱导基因组局部突变(TILLING)技术能够对突变群体中的点突变进行快速筛选,而样品混池深度是影响其效率的主要因素。为提高TILLING的突变检测效率,本研究以甲基磺酸乙酯(EMS)诱变群体构建的突变体库为基础,对其中部分M2代植株进行突变性状观察,结果表明表型突变率为10.80%。同时利用已知矮化突变体与野生型进行混池,分别构建96、192、288、384四个不同深度的测序池,使用GATK软件进行突变检测,为对假阳性位点进行有效过滤,候选突变位点分别根据突变类型及归一化深度作为阈值两次进行过滤。结果表明,96~288倍的混池深度均能稳定检出预设的已知突变位点,并与Sanger测序结果相一致。与前人相比,本研究通过优化混池深度与过滤阈值,实现了更高混池深度的突变检测,并在黄瓜中建立了基于扩增子测序的TILLING技术体系,可实现更高通量地对大规模突变群体进行目标突变的鉴定。

不同DNA提取方法对大曲基因组DNA提取效果及扩增子文库的影响

大曲是中国传统白酒典型的“多酶多菌”的发酵剂。免培养的分子生物学方法已经成为大曲微生物群落研究的常规方法。通过评估不同DNA提取方法对大曲基因组DNA提取效果及扩增子文库的影响,选择适合用于大曲DNA提取的最佳方法。该研究选择4种DNA提取方法分别对2种大曲进行大曲微生物DNA的提取,结合DNA提取质量、qPCR定量结果、细菌16S rRNA基因和真菌ITS基因扩增子文库的Illumina Miseq测序结果,评估大曲基因组DNA不同提取方法的效果。从DNA得率和生物量的综合分析表明,SDS-based提取法的DNA得率高于试剂盒提取法,其中原位SDS-based提取法DNA得率高达5.46×10^(4)ng/g,但DNA纯度较低;SDS-based提取法的qPCR定量结果比试剂盒提取法高10^(1)~10^(6)量级,其中洗脱加SDS-based提取法的微生物生物量最高,比原位SDS-based提取法的生物量高10^(1)~10^(3)量级;试剂盒提取法的微生物生物量最低,细菌和真菌的生物量只有10^(2)~10^(4)copies/g。扩增子文库间Shannon多样性指数的比较结果表明,不同DNA提取方法在真菌ITS扩增子文库间存在显著差异,而在细菌16S rDNA扩增子文库间差异不显著。洗脱处理样本的真菌扩增子文库Shannon指数要高于原位处理的样本。通过对扩增子文库间存在显著性差异操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)的比较可以看出,在细菌16S rDNA扩增子文库中,多数OTUs存在丰度差异,但它们大多数能在不同DNA提取方法中检测到;然而在真菌ITS扩增子文库间,少数OTUs在不同DNA提取方法中检测不到,说明DNA提取方法对部分真菌微生物基因组的提取存在显著影响,且洗脱处理有利于真菌基因组DNA的提取。综合对比4种DNA提取方法,洗脱加SDS-based提取法最适合用于大曲微生物的定量和群落结构分析。

微生物扩增子高通量测序技术在水产品加工与贮藏中的应用

简介了微生物扩增子高通量测序技术,简述该技术在水产品加工与贮藏研究中的应用现状。在发酵水产品、水产品低温加工和保鲜防腐等方向,众多研究以高通量方法测定细菌和古菌的16S rRNA基因片段,准确获得水产品中微生物的种类和数量信息。微生物扩增子高通量测序技术优于传统的可培养法,也优于许多非培养分析技术。同时还指出了该技术的存在问题及对策,并探讨了该技术的发展方向和应用前景。

单纯疱疹病毒I型扩增子系列载体的构建

我们先前已报道了构建成一种能在ＨＳＶｔｓＫ株辅助下进行复制和包装，并表达β－半乳糖苷酶基因ｌａｃＺ的ＨＳＶ－１扩增子质粒ｐＨＳＬ，以及它的应用〔１〕。该质粒中依次含有ＨＳＶ－１复制起点ｏｒｉＳ序列及ＩＥ６８启动子、ｌａｃＺ基因、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ＨＳＶ－１包装信号‘ａ’序列和大肠杆菌质粒骨架。然而，该质粒中的报告基因ｌａｃＺ无法用简单的酶切方法卸载下来，继而装入目的基因。本研究在此基础上，新构建了一系列质粒型单纯疱疹病毒载体。首先构建了ＨＳＶ－１扩增子载体质粒ｐＨＳＶＩＥ６８，在ＩＥ６８启动子的下游带有可供外源基因插入的ＨｉｎｄⅢ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ等克隆位点，其后没有ｐｏｌｙＡ加尾信号。为检验ｐＨＳＶＩＥ６８载体的有效性，将报告基因ｌａｃＺ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ片段通过ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨＩ位点插入该载体中，构建成重组扩增子质粒ｐＨＳＶ－ｌａｃＺ１。将该质粒转入ＢＨＫ细胞，并辅以ＨＳＶ－１ｔｓＫ株病毒感染，３１℃培养４８～７２小时后收获的细胞上清感染新鲜的ＢＨＫ细胞，用Ｘ－ｇａｌ液染色可见有大量细胞蓝染，提示所构建的ｐＨＳＶＩＥ６８质粒能有效地工作。在此基础上，我们又构建了含有ＳＶ４０ｐｌｏｙ?

扩增子测序技术分析红茶菌中优势微生物的研究

红茶菌作为一种传统健康保健饮品,由于发酵过程中需要多种微生物的参与,因此需要对混合菌种进行高效的分离鉴定。本文通过提取红茶菌中的基因组DNA,采用高通量测序的方法对16S rDNA和ITS的扩增子进行测序,实现对红茶菌中优势微生物的分析鉴定。通过对可操作分类单元进行丰度分析和物种分类树统计,最终得到主要的细菌组成为:醋酸菌89.11%,拟杆菌5.56%,颤螺旋杆菌1.77%;优势真菌组成为:酵母菌为93.48%,其中嗜酒假丝酵母61.76%,酵母菌Blastobotrys adeninivorans 30.97%;α多样性分析结果显示:测序数据较为合理,测序数据量大,可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。

单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质粒载体的构建及LacZ基因的表达

从单纯疱疹病毒Ⅰ型ＨＳＶ－１基因组中分离出其包装信号序列，与含ＨＳＶ－１复制起点及ＩＥ－６８基因启动子的ＤＮＡ序列、β半乳糖苷酶基因和大肠杆菌质粒骨架，构建了一种ＨＳＶ－１扩增子质粒载体ｐＨＳＬ，其中ＬａｃＺ基因置于ＩＥ－６８基因启动子控制下。将此质粒转染已感染了ＨＳＶ－１温度敏感株ｔｓＫ株的Ｖｅｒｏ细胞，ｐＨＳＬ可在ＨＳＶ－１ｔｓＫ的辅助下包装成假病毒颗粒，这样就可得到同时含有假病毒和ＨＳＶ－１ｔｓＫ的混合毒株ｄｖＨＳＬ。将此混合毒株感染传代细胞和神经细胞，可在其中表达ＬａｃＺ基因，而在生理温度（３７℃）下，混合毒株的复制受到抑制。提示这种缺陷型疱疹病毒载体有用于向神经系统基因转移的可能性。

应用rrf(5s)-(23s)间隔区扩增子的RFLP对伯氏疏螺旋体的基因鉴定

作者对吉林省9个地区,分离的12株伯氏疏螺旋体菌株,利用rrf(5s) -rrl(23s)间隔区扩增(RFLP)进行基因分型。同时应用特异性单抗对菌株进行菌株鉴定。结果表明: 12株菌株PCR检测都为B. garinii基因型,菌株鉴定同国内分离株M7相同。(B. garinii基因型常从脑脊液分离出来,损伤神经系统,引起皮肤游走性红斑。该基因型菌株是北方疫苗研制的最佳选择。)该结果为吉林省莱姆病的发病机理、临床症状、诊断治疗、免疫诊断及疫苗制备提供了极有价值的技术性参考依据。

基于HRM的小扩增子法研究ABCA1基因变异与良性前列腺增生及前列腺癌的关联

目的基于HRM的小扩增子法(small-amplicon),探索胆固醇相关转运蛋白ABCA1基因变异rs2230806,rs2066882与良性前列腺增生(BPH)及前列腺癌(PCA)之间的关联。方法基于高分辨熔解曲线(HRM)技术,建立变异位点的小扩增子分型方法,通过Idaho Light Scanner分析,对391例BPH患者,222例PCA患者和86例正常对照者的DNA样本进行分型应用。结果所建立的HRM技术成功对两个SNP位点进行基因分型,不受限于基因变异的位置特征,可成功区分三个变异位点的不同突变型和野生型,并且达到较高的重复性和准确性,经Sanger法测序验证结果完全一致。风险等位基因rs2066882-A的携带可增加BPH(P<0.001,OR=3.871)及PCA(P<0.001,OR=3.708)的风险;rs2230806在各组间的分布未见统计学差异。结论基于小扩增子法的HRM分型技术,可成功对ABCA1基因变异rs2230806,rs2066882进行分型,风险等位基因rs2066882-A的携带可增加BPH和PCA的风险。

多重任意扩增子图谱技术在中药材鉴定中的应用

我国现行使用的1.2万余种中药材中动植物占99%,品种繁多,来源复杂,互混、互代现象屡屡发生.由于受到经济利益的驱使,近年来药材伪、混品种有增无减.由于中药的疗效与药材品质密不可分,所以为确保中药使用安全、有效,对各种药材进行准确、迅速、简捷地鉴定十分重要[1].

单纯疱疹病毒扩增子载体转导的ATM基因在活体的异位表达(英文)

小脑性共济失调与血管扩张症 (A-T)是一种常染色体隐性遗传性疾病 ,具多效表型。此病的特征是小脑变性、免疫缺陷、生长迟缓、早熟性衰老、染色体不稳定、肿瘤易患体质和对辐射的过度敏感。目前尚未发现有效的方法阻断此病的进行性发展。基因治疗是此病的潜在希望。ATM是此病的致病基因 ,编码 ATM蛋白激酶。本研究将 ATM c DNA完整的读码框架克隆进 1型单纯疱疹病毒 (HSV-1)扩增子载体 (p TO-ATM)。培养的 A-T细胞经 p TO-ATM病毒载体转导后 ,用免疫组织化学方法证明了 ATM在这些细胞的异位表达。为了进一步研究在活体应用此载体系统的可能性 ,选择大鼠脑作为实验靶区。先用免疫组织化学方法观察了内源性 ATM在成年大鼠前脑和小脑的正常分布 ,发现在尾壳核有低水平的 ATM出现 ,而在其余脑区 ,ATM水平则显著地高于尾壳核区。将 p TO-ATM病毒载体注射到成年大鼠的一侧尾壳核 ,3 d后在注射区 (包括针道周围的区域 )观察到密集的 ATM免疫反应阳性神经元。本研究结果证明 ,HSV扩增子病毒载体可以稳定地运载相当大的 c DNA片段 ,转基因在离体和活体均能有效地表达。本研究为使用基因治疗的方法治疗

扩增子测序分析助力传统发酵食品微生物群落研究

高通量测序技术的发展促进了基因组学技术在中国传统发酵食品微生物研究中的应用,而扩增子测序是目前相对成熟且普遍使用的基因组学技术。采用生物信息学方法分析由测序产生的大量序列数据,揭示数据隐藏的生物学信息至关重要。生物信息学贯穿于扩增子测序数据的收集、存储、处理和分析等各个阶段。该文归纳了目前在扩增子数据分析中常用的数据库、算法及生物信息分析工具,总结了近几年基于扩增子测序的生物信息学方法在中国传统发酵食品研究中的应用,为扩增子测序分析技术的改进和发展提供参考。

基于16S rDNA扩增子测序分析灵芝连作覆土细菌群落的变化

揭示不同连作年限灵芝覆土中细菌群落的变化情况,为灵芝连作障碍机制的研究提供理论依据。以邻近沙壤土(GL0)为对照,采用Illumina MiSeq平台对灵芝栽培1年(GL1)、连作1年(GL2)、2年(GL3)和3年(GL4)的覆土进行扩增子测序。多样性分析表明,连作会加大灵芝覆土中细菌群落的物种组成差异,且细菌群落的丰富度和多样性均呈现先增加后减少的趋势。在门水平上,变形菌门和放线菌门的相对丰度随着连作年限的增加而显著性增加;绿弯菌门的相对丰度逐年递减。在属水平上,鞘氨醇单胞菌属、Anaeromyxobacter、慢生根瘤菌属、脱氯菌属和Ktedonobacter等在灵芝覆土中的相对丰度逐年递减,溶杆菌属、Gp6和Gp16的相对丰度显著提高。灵芝连作障碍可能与覆土中鞘氨醇单胞菌属、Anaeromyxobacter、慢生根瘤菌属、脱氯菌属等有益细菌相对丰度逐年降低有关。

扩增子测序法筛选结核分枝杆菌的耐药突变

结核病是严重的公共健康问题之一,而耐药结核病的增加是控制结核病流行的难点之一。快速、准确的诊断是提高结核患者治愈率和降低死亡率的关键因素。本研究建立了基于二代测序技术的扩增子测序方法,对5种一线抗结核药物的17个耐药基因进行检测。在26个临床耐药结核菌株中共鉴定出65个突变,包括33个热点突变,9个稀有突变和23个新突变。对18个新发现的错义突变进行了蛋白质序列保守性和蛋白质局部结构的分析。结果表明,14个新的错义突变在9种分枝杆菌中显示出高度保守性,并且导致了该蛋白质局部结构的改变。根据本研究检测和分析结果,推测这些新发现的突变可能是潜在的耐药突变。在本研究中,构建了扩增子测序的检测方法,可同时检测10株临床结核菌株的17个耐药基因,是一种快速、准确并且全面的检测耐药结核分枝杆菌一线治疗药物耐药突变的方法,该方法不仅能检测热点突变和稀有突变,还能发现一些未报道过的新突变。该检测方法或可用于临床诊断和基础研究。

扩增子测序技术应用于乳腺癌循环游离DNA无创性检测的研究

目的:应用扩增子测序方法检测乳腺癌循环游离DNA肿瘤相关突变。方法:军事医学科学院附属医院的10例HER2阳性晚期乳腺癌患者血样入组,应用扩增子测序技术检测血细胞和血浆中的循环游离DNA(cfDNA),筛选出肿瘤相关基因突变,即循环肿瘤DNA(ctDNA)。结果:检测10例晚期乳腺癌患者外周循环血50个基因,共检出11个突变基因,其中PIK3CA、ERBB4的阳性检出率均达到100%,AKT、TP53的阳性检出率为90%。结论:检测覆盖度及深度均良好,结果提示11个基因的热点突变区域出现单核苷酸的多态性基因突变,突变基因与PI3K-AKT-m TOR通路、Ras-Raf-MEK-ERK通路明显相关。扩增子测序技术和筛选方法可以用于乳腺癌ctDNA的无创性检测。

基于微生物组扩增子ITS的茯砖茶发花特征真菌菌群演替规律分析

茯砖茶是一种微生物参与发酵的黑茶。菌花香是茯砖茶独特的香气品质,其成因可能与发花过程中的真菌演替有关。为揭示茯砖茶发花特征真菌菌群演替规律,以薮北种茶树为原料制成黑茶与白茶,之后同时、同地发花分别制成茯砖茶与白茶砖。采用微生物组扩增子ITS分析发花过程中真菌演替规律。结果表明:1)不同茶类在发花过程中的特征真菌丰度的变化规律不同。2)渥堆改变了茯砖茶的菌群结构及微生物生长环境,导致茯砖茶与其它茶类的发花真菌菌群演替有差异。3)茯砖茶发花特征真菌菌群演替规律:茯砖茶发花前期,由渥堆影响丰度较高的黑曲霉、局限曲霉、萨氏曲霉、岐皱青霉、西兰花青霉、汉逊德巴利酵母等在发花6 d出现丰度峰。发花第9天散囊菌属、卡利比克迈耶氏酵母、海洋嗜杀酵母等真菌出现丰度峰,黑曲霉、汉逊德巴利酵母、局限曲霉维持丰度;发花12 d假灰绿曲霉出现丰度峰,黑曲霉维持丰度。第22天发花结束,散囊菌属最终成为优势菌种。

利用扩增子测序技术分析不同红茶菌中微生物多样性

为探究红茶菌中的优势菌群及其饮品风味与微生物之间的关联性,采用扩增子测序技术研究11个不同来源的红茶菌样品中微生物多样性,并基于感官评价对物种进行聚类分析。结果表明,11个红茶菌样品中的优势细菌均为葡糖醋杆菌属(相对丰度85.40%~99.56%),其次为假单胞菌属(相对丰度<14%);而不同红茶菌样品中优势真菌表现不同,样品SD1、SD10、SX11和SY6中优势菌属为接合酵母属(相对丰度95.43%~99.99%),样品BJ4和GD9中优势菌属为假丝酵母属(相对丰度40.54%和97.40%),样品AH7、AH8、AJ2、BJ3和XJ5中优势菌属为酒香酵母属(相对丰度54.81%~74.09%)。非优势细菌和优势真菌不同程度地影响红茶菌的风味。扩增子测序技术较为全面准确地分析了红茶菌样品中的微生物多样性,为工业化生产红茶菌饮品提供理论依据。

扩增子测序检测SNP位点与子宫内膜异位症的发病风险

目的:探索外周血单核苷酸多态性(SNP)多态位点的检测与子宫内膜异位症(简称内异症)的发病风险的关系。方法:选择内异症患者66例,对照组34例,采集受试者子宫内膜组织做病理活检HE染色;取外周血,提取DNA,构建文库,按照筛选出的SNP位点进行扩增子测序检测。结果:在筛选出的21个位点中,7p15.2(rs12700667)(p=0.170×10^(-10),OR=1.26)、CDKN2BAS基因16号内含子内的rs10965235(p=0.35×10^(-11),OR=1.39)、WNT4的rs16826658(p=0.110×10^(-9),OR=1.18)的SNP在内异症患者与对照组中比较,差异有统计学意义。结论:外周血样本SNP位点7p15.2(rs12700667)、WNT4(rs16826658)、CDKN2BAS(rs10965235)可能与内异症的发病风险有关。