扩增子测序技术在中药分子鉴定中的应用

中药鉴定是保证中药用药安全的关键环节。中药分子鉴定通过分析遗传物质的差异实现鉴定,弥补了传统鉴定方法主观性较强的不足,成为中药鉴定方法的有力补充。扩增子测序技术通过对特定片段进行扩增,结合不同测序技术实现物种鉴定。文章对扩增子测序技术在生物鉴定中的优势、扩增子测序技术在中成药及中药材中的应用,以及扩增子测序技术在中药鉴定中的关键技术步骤进行总结梳理,分析扩增子测序技术在中药分子鉴定中的应用现状及未来发展,为后续中药分子鉴定工作提供研究思路。

扩增子测序技术在牡蛎GⅡ型诺如病毒基因多样性研究中的评估

牡蛎中诺如病毒基因多样的研究对病毒的流行传播和疫情防控具有十分重要的意义,二代测序技术(next generation sequencing, NGS)的扩增子测序具有高通量、高准确性等优势,被广泛应用于基因组学、转录组学和表观基因组学等领域。为评估扩增子测序技术对牡蛎中诺如病毒多样性研究的可行性,采用经典的巢式反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)方法对人为污染诺如病毒的牡蛎样品进行检测并将产物进行扩增子测序,对病毒基因型覆盖度和灵敏度进行分析。结果显示,在覆盖度方面,扩增子测序技术能够检测出人为添加到牡蛎中的6种GⅡ型诺如病毒,覆盖率达到100%;在灵敏度方面,对人为污染有不同数量诺如病毒的牡蛎进行检测及测序分析,证实扩增子测序的灵敏性较高,低于50个病毒粒子也能检测出。综上,扩增子测序技术提高了牡蛎中诺如病毒检测的准确性以及基因型的丰富度。

黄瓜基于扩增子测序的TILLING技术体系的建立

定向诱导基因组局部突变(TILLING)技术能够对突变群体中的点突变进行快速筛选,而样品混池深度是影响其效率的主要因素。为提高TILLING的突变检测效率,本研究以甲基磺酸乙酯(EMS)诱变群体构建的突变体库为基础,对其中部分M2代植株进行突变性状观察,结果表明表型突变率为10.80%。同时利用已知矮化突变体与野生型进行混池,分别构建96、192、288、384四个不同深度的测序池,使用GATK软件进行突变检测,为对假阳性位点进行有效过滤,候选突变位点分别根据突变类型及归一化深度作为阈值两次进行过滤。结果表明,96~288倍的混池深度均能稳定检出预设的已知突变位点,并与Sanger测序结果相一致。与前人相比,本研究通过优化混池深度与过滤阈值,实现了更高混池深度的突变检测,并在黄瓜中建立了基于扩增子测序的TILLING技术体系,可实现更高通量地对大规模突变群体进行目标突变的鉴定。

扩增子测序技术分析红茶菌中优势微生物的研究

红茶菌作为一种传统健康保健饮品,由于发酵过程中需要多种微生物的参与,因此需要对混合菌种进行高效的分离鉴定。本文通过提取红茶菌中的基因组DNA,采用高通量测序的方法对16S rDNA和ITS的扩增子进行测序,实现对红茶菌中优势微生物的分析鉴定。通过对可操作分类单元进行丰度分析和物种分类树统计,最终得到主要的细菌组成为:醋酸菌89.11%,拟杆菌5.56%,颤螺旋杆菌1.77%;优势真菌组成为:酵母菌为93.48%,其中嗜酒假丝酵母61.76%,酵母菌Blastobotrys adeninivorans 30.97%;α多样性分析结果显示:测序数据较为合理,测序数据量大,可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。

扩增子测序分析助力传统发酵食品微生物群落研究

高通量测序技术的发展促进了基因组学技术在中国传统发酵食品微生物研究中的应用,而扩增子测序是目前相对成熟且普遍使用的基因组学技术。采用生物信息学方法分析由测序产生的大量序列数据,揭示数据隐藏的生物学信息至关重要。生物信息学贯穿于扩增子测序数据的收集、存储、处理和分析等各个阶段。该文归纳了目前在扩增子数据分析中常用的数据库、算法及生物信息分析工具,总结了近几年基于扩增子测序的生物信息学方法在中国传统发酵食品研究中的应用,为扩增子测序分析技术的改进和发展提供参考。

基于16S rDNA扩增子测序分析灵芝连作覆土细菌群落的变化

揭示不同连作年限灵芝覆土中细菌群落的变化情况,为灵芝连作障碍机制的研究提供理论依据。以邻近沙壤土(GL0)为对照,采用Illumina MiSeq平台对灵芝栽培1年(GL1)、连作1年(GL2)、2年(GL3)和3年(GL4)的覆土进行扩增子测序。多样性分析表明,连作会加大灵芝覆土中细菌群落的物种组成差异,且细菌群落的丰富度和多样性均呈现先增加后减少的趋势。在门水平上,变形菌门和放线菌门的相对丰度随着连作年限的增加而显著性增加;绿弯菌门的相对丰度逐年递减。在属水平上,鞘氨醇单胞菌属、Anaeromyxobacter、慢生根瘤菌属、脱氯菌属和Ktedonobacter等在灵芝覆土中的相对丰度逐年递减,溶杆菌属、Gp6和Gp16的相对丰度显著提高。灵芝连作障碍可能与覆土中鞘氨醇单胞菌属、Anaeromyxobacter、慢生根瘤菌属、脱氯菌属等有益细菌相对丰度逐年降低有关。

扩增子测序法筛选结核分枝杆菌的耐药突变

结核病是严重的公共健康问题之一,而耐药结核病的增加是控制结核病流行的难点之一。快速、准确的诊断是提高结核患者治愈率和降低死亡率的关键因素。本研究建立了基于二代测序技术的扩增子测序方法,对5种一线抗结核药物的17个耐药基因进行检测。在26个临床耐药结核菌株中共鉴定出65个突变,包括33个热点突变,9个稀有突变和23个新突变。对18个新发现的错义突变进行了蛋白质序列保守性和蛋白质局部结构的分析。结果表明,14个新的错义突变在9种分枝杆菌中显示出高度保守性,并且导致了该蛋白质局部结构的改变。根据本研究检测和分析结果,推测这些新发现的突变可能是潜在的耐药突变。在本研究中,构建了扩增子测序的检测方法,可同时检测10株临床结核菌株的17个耐药基因,是一种快速、准确并且全面的检测耐药结核分枝杆菌一线治疗药物耐药突变的方法,该方法不仅能检测热点突变和稀有突变,还能发现一些未报道过的新突变。该检测方法或可用于临床诊断和基础研究。

扩增子测序技术应用于乳腺癌循环游离DNA无创性检测的研究

目的:应用扩增子测序方法检测乳腺癌循环游离DNA肿瘤相关突变。方法:军事医学科学院附属医院的10例HER2阳性晚期乳腺癌患者血样入组,应用扩增子测序技术检测血细胞和血浆中的循环游离DNA(cfDNA),筛选出肿瘤相关基因突变,即循环肿瘤DNA(ctDNA)。结果:检测10例晚期乳腺癌患者外周循环血50个基因,共检出11个突变基因,其中PIK3CA、ERBB4的阳性检出率均达到100%,AKT、TP53的阳性检出率为90%。结论:检测覆盖度及深度均良好,结果提示11个基因的热点突变区域出现单核苷酸的多态性基因突变,突变基因与PI3K-AKT-m TOR通路、Ras-Raf-MEK-ERK通路明显相关。扩增子测序技术和筛选方法可以用于乳腺癌ctDNA的无创性检测。

利用扩增子测序技术分析不同红茶菌中微生物多样性

为探究红茶菌中的优势菌群及其饮品风味与微生物之间的关联性,采用扩增子测序技术研究11个不同来源的红茶菌样品中微生物多样性,并基于感官评价对物种进行聚类分析。结果表明,11个红茶菌样品中的优势细菌均为葡糖醋杆菌属(相对丰度85.40%~99.56%),其次为假单胞菌属(相对丰度<14%);而不同红茶菌样品中优势真菌表现不同,样品SD1、SD10、SX11和SY6中优势菌属为接合酵母属(相对丰度95.43%~99.99%),样品BJ4和GD9中优势菌属为假丝酵母属(相对丰度40.54%和97.40%),样品AH7、AH8、AJ2、BJ3和XJ5中优势菌属为酒香酵母属(相对丰度54.81%~74.09%)。非优势细菌和优势真菌不同程度地影响红茶菌的风味。扩增子测序技术较为全面准确地分析了红茶菌样品中的微生物多样性,为工业化生产红茶菌饮品提供理论依据。

扩增子测序检测SNP位点与子宫内膜异位症的发病风险

目的:探索外周血单核苷酸多态性(SNP)多态位点的检测与子宫内膜异位症(简称内异症)的发病风险的关系。方法:选择内异症患者66例,对照组34例,采集受试者子宫内膜组织做病理活检HE染色;取外周血,提取DNA,构建文库,按照筛选出的SNP位点进行扩增子测序检测。结果:在筛选出的21个位点中,7p15.2(rs12700667)(p=0.170×10^(-10),OR=1.26)、CDKN2BAS基因16号内含子内的rs10965235(p=0.35×10^(-11),OR=1.39)、WNT4的rs16826658(p=0.110×10^(-9),OR=1.18)的SNP在内异症患者与对照组中比较,差异有统计学意义。结论:外周血样本SNP位点7p15.2(rs12700667)、WNT4(rs16826658)、CDKN2BAS(rs10965235)可能与内异症的发病风险有关。

基于16S rRNA基因扩增子测序技术研究云南野生小型哺乳动物肠道菌群多样性

以生活在同一生境,但具有不同进化关系和不同食性的野生哺乳类动物(鼠科、猬科和鼩鼱科)为研究对象,通过16S rRNA基因扩增子测序,分析和比较其肠道菌群。共识别出5378个操作分类单位(OTUs),主要隶属Firmicutes(40.55%),Proteobacteria(34.60%)和Bacteroidetes(13.67%)。Firmicutes和Bacteroidetes是鼠科的优势菌门,Proteobacteria是猬科和鼩鼱科的优势菌门。多样性分析表明,鼠科、猬科与鼩鼱科的肠道微生物多样性及群落结构具有显著性差异;LEfSe分析表明,鼠科中存在更多与复杂碳水化合物发酵相关的细菌,猬科和鼩鼱科中含较多氨基酸发酵菌;益生菌(如Lactobacillus和Lactococcus等)共存于这3类野生小型哺乳类动物中,起调控宿主健康的作用。研究结果揭示,宿主食性与进化关系影响着野生小型哺乳动物肠道菌群结构,而肠道菌群可能在多种方面对宿主起益生作用。

基于扩增子测序的瘤胃内含物中木聚糖酶基因多样性研究

采用高通量扩增子测序技术,对山羊瘤胃微生物宏基因组第10家族(GH10)和第11家族(GH11)木聚糖酶基因多样性进行分析.经序列拼接、过滤和可操作分类单元聚类(<95%),获得348个GH10木聚糖酶基因.GH10木聚糖酶基因片段与GenBank数据库中已知蛋白序列的一致性为46%~97%,其中一半以上的序列与已知木聚糖酶的一致性低于80%.序列注释结果表明,GH10木聚糖酶基因分布于5个门,其中拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)为优势门.经序列处理分析,获得143个GH11木聚糖酶基因,与GenBank中已知蛋白序列的一致性为51%~100%.GH11木聚糖酶基因分布于6个门,其中子囊菌门(Ascomycota)和放线菌门(Actinobacteria)为优势门.基于片段序列和染色体步移技术,获得两个新的全长木聚糖酶基因,由其编码的蛋白具有特殊的结构域组成.本研究表明,山羊瘤胃环境中GH10木聚糖酶基因的多样性远高于GH11,且两者的分布存在较大差异.此外,该环境中还存在大量的新木聚糖酶基因,可为后续木聚糖酶基因资源的发掘和应用奠定基础.

预处理对基于扩增子测序技术酒醅微生物菌群结构的影响

磷酸盐缓冲液(PBS)常被用作酒醅预处理,但目前对于预处理前后酒醅菌群结构的改变尚不清晰。采用扩增子测序技术对比分析预处理前后的2种酒醅(酱香型、浓香型)微生物菌群结构变化。结果表明,PBS预处理后两种酒醅真核微生物物种丰度显著增加而原核微生物显著减少(P<0.05),物种种类上无显著改变(P>0.05)。优势真菌及细菌在门水平上组成和相对丰度上均变化较小,但在属水平上组成和相对丰度有明显改变。预处理前后酱香型酒醅真菌属组成相似而细菌属组成有差异;浓香型白酒酒醅真菌属和细菌属均有差异。因此,预处理会在丰度水平上对酒醅微生物菌群结构造成影响,这进一步为酒醅、大曲、窖泥等发酵样品的预处理提供参考价值。

基于扩增子测序技术非定向筛查食品中的植物成分

为进一步解决食品中基于扩增子测序的植物成分掺假非定向筛查问题,实现对植物源性成分高通量的检测和评估,该研究基于扩增子测序技术,利用植物通用引物RbcL,开发了常见植物成分非定向筛查方法。通过PCR技术,以红小豆、大豆、绿豆、红薯、马铃薯、木薯、薏米、小麦、玉米、小米、水稻、杏、腰果、榛子、芝麻、巴旦木、核桃、桃、香蕉、梨、小番茄、南瓜、胡萝卜、苹果、花生、开心果、芸豆27种植物物种提取的DNA为模板对该方法进行特异性、通用性、灵敏度验证。结果表明,通过DNAMAN软件与美国国立生物技术信息中心数据库比对测序,可有效区分不同植物物种。此外,利用二代测序分析技术对4个混合植物源性成分样本进行高通量、非定向筛查,测序结果与产品标识一致。该方法的建立对于植物源性成分的掺杂掺假鉴定和监管、消费者权益的保护具有重要意义。

基于扩增子测序分析益生菌牙膏中菌群多样性

通过常规方法检测益生菌牙膏中的活性菌,并采用高通量测序技术对20种市售益生菌牙膏16S rDNA的V3、V4区进行测序,扩增子测序分析不同牙膏中的菌群结构并进行α多样性分析,最后基于特异性引物,使用PCR方法检测20种牙膏中副干酪乳杆菌成分。结果表明:1)20种益生菌牙膏菌落总数均<10 CFU/g,乳酸菌总数均<10 CFU/g;2)通过扩增子测序结果分析,牙膏中还添加了干酪乳杆菌以外的乳酸菌,有18种牙膏中添加了发酵乳杆菌、嗜酸乳酸杆菌和德氏乳杆菌亚种,20种牙膏中添加了植物乳杆菌,19种牙膏中添加了罗伊氏乳杆菌。高通量测序对原核微生物的α多样性分析,表明牙膏中原核微生物丰度和菌落多样性较高;3)牙膏DNA提取物通过PCR及测序,结果表明20种牙膏均按标签标识添加了副干酪乳杆菌。

基于16S rDNA扩增子测序与流式细胞仪分析葛根改善免疫与肠道微生物的关系

本文基于16S rDNA扩增子测序与流式细胞仪深入探索葛根改善免疫的机制,并分析肠道微生物与免疫的关系。葛根灌胃四周后,取血,测定血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6,运用流式细胞仪测定血清中T、B淋巴细胞数量,16S rDNA扩增子测序粪便中肠道微生物菌群变化。结果显示,与空白对照组比较,各剂量葛根皆降低炎性因子,改善机体免疫状态,其中以低剂量最为显著(P < 0.05)。流式细胞仪结果显示,各剂量组葛根提取物都显著增加血清中T、B淋巴细胞数量(P < 0.05),增长幅度以低剂量最为显著(P < 0.01)。16S rDNA扩增子测序结果显示,葛根提取物可以特异性增高与免疫相关肠道微生物的丰度,如梭状芽孢杆菌、罗氏杆菌、狄氏副拟杆菌、肠球菌等,以狄氏副拟杆菌最为显著。Alpha多样性指数组间差异分析提示葛根能够提高肠道微生物的丰度,提高微生物分布均匀性。PCoA分析提示葛根能较显著改变肠道内微生物的菌种丰度与组成结构。因此,葛根能够提高免疫功能,降低炎性因子,增加T、B淋巴细胞数量,并可能通过特异性改变肠道微生物,如狄氏副拟杆菌,增加肠道微生物多样性等途径发挥免疫调节作用。

基于16S rDNA扩增子测序技术分析猪乳汁中微生物菌落多样性

为了掌握猪乳汁中微生物的多样性,并为研究仔猪饲料中的益生菌添加提供科学依据,本研究利用16S rDNA扩增子测序技术对两常见猪品种(大白猪和皮特兰猪)在不同泌乳阶段的乳汁微生物多样性进行比较分析。结果显示,母猪成熟乳微生物多样性和丰富度降低,不同泌乳阶段菌群结构差异较大;随着时间的增加,两品种母猪乳汁中的优势菌门和优势属种类和相对丰度发生不同程度的变化;埃希氏-志贺氏菌属、链球菌属、莫拉氏菌属和拟杆菌属等为猪乳汁中的致病菌。本研究表明猪乳汁微生物多样性受品种和泌乳阶段的显著影响。

扩增子与宏基因组策略在猴痘病毒全基因组测序考核中的应用比较

目的比较扩增子与宏基因组测序在猴痘病毒全基因组测序考核中的应用效果,为猴痘病毒测序溯源与疫情防控提供技术参考。方法扩增子测序:对猴痘DNA先进行全基因组靶向扩增,再对扩增产物进行二代测序;宏基因组测序:对猴痘DNA直接进行二代测序。获得序列后使用CLC、IGV等软件分析2种不同测序方法的有效数据百分比、测序深度及不同测序深度下的病毒全基因组测序覆盖度等质量参数,评估测序质量。使用Nextclade进行病毒分型、序列突变及缺失情况分析,比较2种测序方法所获得序列的一致性及完整性。结果使用猴痘参比毒株MPXV-M5312_HM12_Rivers全基因序列(GenBank登录号:NC_063383.1)进行拼接后,扩增子测序和宏基因测序所获得有效数据百分比分别为99.72%和7.54%,测序深度范围分别为0×~334839×和44×~1000×,测序深度10×以上的位点覆盖度分别为90.3%和100%。通过IGV查看全基因组在不同测序深度下的覆盖情况发现,宏基因测序的全基因组位点测序深度覆盖均匀,而扩增子测序的全基因组位点测序深度覆盖不均、差异明显。病毒分型及序列一致性分析显示,2种方法所获得序列均为猴痘病毒IIb B.1分支,与参比序列相比宏基因测序结果存在73个突变位点,扩增子测序存在68个突变位点,深入分析发现扩增子测序有7个IIb B.1分支的共有突变位点未测到,还存在2个假阳性私有突变位点。结论在猴痘病毒全基因测序中可灵活使用扩增子测序或宏基因组测序方法,其中扩增子测序可以获得更多的有效数据量,而宏基因组测序在序列覆盖的均一性和准确性方面较好,本研究旨在为提高猴痘病毒全基因组测序成功率提供一点启发与技术参考。

一种基于扩增子测序检测丛枝菌根真菌的方法

丛枝菌根真菌可以通过与植物建立共生关系促进植物吸收矿质营养,在植物抵御逆境过程中起到重要的作用。新一代测序技术的快速发展极大地推动了微生物多样性研究,扩增子测序技术对植物和土壤样本中丛枝菌根真菌的检测起到了重要的作用。本研究报道一种基于Illumina MiSeq扩增子测序的丛枝菌根真菌检测方法,通过设计专门针对丛枝菌根真菌的引物,对植物和土壤样本中的丛枝菌根真菌进行扩增子测序检测。研究结果表明,设计的引物相较于通用引物f ITS7/ITS4在属水平上对丛枝菌根真菌有更高的检出率。建立了一种将测序数据与丛枝菌根真菌代表序列直接比对注释的方法,与OTU代表序列注释的方法相比具有较高的准确度。对丛枝菌根真菌代表序列和检出序列的系统发育分析显示出较好的系统发育关系。本研究有助于更高效检测植物和土壤样本中的丛枝菌根真菌。

基于16S rDNA扩增子测序及靶向代谢组学探究“脾应长夏”的物质基础

目的:通过长夏时节肠道菌群及其代谢短链脂肪酸的季节性特征研究松果腺介导的“脾应长夏”的物质基础,丰富中医“天人相应”理论内涵。方法:将SD大鼠随机分为空白组、伪手术组和手术组,采用人工气候模拟系统模拟长夏气候特征饲养4周,观察各组大鼠一般状态及粪便含水率,从宏观上对比研究脾运化水液能力;应用16S rDNA扩增子测序和靶向代谢组学技术进一步剖析松果腺对大鼠肠道菌群及短链脂肪酸的调控情况。,结果:切除大鼠松果腺后,第14、28天,手术组大鼠体质量与伪手术组比较,显著下降(P<0.05),粪便含水率比空白组显著增加(P<0.01);长夏环境中大鼠肠道菌群以厚壁菌门为主,伪手术组代表性物种为梭菌目、毛螺菌科和瘤胃菌科等,而手术组厚壁菌门丰度有所减少,代表性物种为脱硫弧菌属、韦荣球菌科以及苏黎世杆菌科;手术组大鼠肠道短链脂肪酸与空白组比较,乙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、异戊酸和己酸显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论:“脾应长夏”的物质基础可能与松果腺通过调节肠道菌群及短链脂肪酸代谢实现机体对自然环境的适应调节相关。