柠檬干片高效褐变抑制剂筛选

检测了几种天然、安全的褐变抑制剂对柠檬干片褐变抑制效果的影响,并就柠檬干片褐变抑制剂配方进行探索,结果显示0.25%L-Cys结合0.20%肉桂酸及0.50%EDTA-2Na可显著抑制柠檬干片的褐变。

鲜切马铃薯丝褐变抑制剂筛选

检测了几种天然、安全的褐变抑制剂对马铃薯PPO活性的抑制效果,并就鲜切马铃薯丝褐变抑制剂配方进行探索,结果显示,0.10g/100mLL-Cys结合0.15g/100mL抗坏血酸、0.3g/100mL植酸以及0.40g/100mLEDTA可有效延长马铃薯丝的货架期。

毛细管电泳-激光诱导荧光检测用于多个胞内蛋白激酶的抑制剂筛选和选择性评价(英文)

发展了一种基于毛细管电泳(CE)-激光诱导荧光(LIF)检测的多个细胞内源激酶的抑制剂平行筛选及选择性评价方法。CE高效的分离能力和LIF检测器的高选择性,使得同时测试多个胞内激酶的活性成为可能。共4种细胞系、3种特异性蛋白激酶底物肽、2种选择性蛋白激酶抑制剂和1种非选择性蛋白激酶抑制剂用于方法的建立。特异性底物肽与细胞裂解液混合后孵育,被其相应的激酶选择性地磷酸化,利用CE-LIF分离检测磷酸化产物和底物肽。同时测定一个抑制剂对几种蛋白激酶的抑制活性,用于评价抑制剂的选择性。与传统的单靶标筛选模式相比,这种基于细胞裂解液的多靶标筛选方法能提供更多的信息,更加高效,且细胞裂解液作为一种廉价的激酶来源大大降低了筛选成本。

表皮生长因子受体酪氨酸激酶的克隆表达和酶抑制剂筛选模型的构建

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)属受体酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)家族,其胞内的酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中具有十分重要的作用。许多肿瘤的发生、发展都与EGFR胞内酪氨酸激酶的异常表达密切相关。因此,EGFR胞内酪氨酸激酶的抑制剂有可能成为治疗肿瘤的有效药物。从人脐静脉内皮细胞(HUVEC)提取总RNA,采用RT-PCR获得EGFR酪氨酸激酶催化域的编码基因。将其克隆至载体pET-30a,在E.coliBL21(DE3)中进行了成功表达,采用Ni-NTA亲和层析对其进行了纯化。通过对酶的活性的测定,证明重组EGFR酪氨酸激酶蛋白具有利用ATP催化底物发生磷酸化反应的激酶活性。以该重组激酶为靶位构建了酶抑制剂筛选模型,拟对微生物代谢产物进行筛选。

菜青虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制剂筛选

以菜青虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)为研究对象,比较了不同菜青虫部位来源及不同生长期的菜青虫NAGase活性.结果表明,5龄虫和预蛹表皮来源的NAGase比活最高.选取肉桂酸等天然化合物及其衍生物以及一些具有抗虫或杀虫活性的植物的粗提物,以其对菜青虫NAGase的抑制作用为指标来粗筛NAGase抑制剂.结果表明茴香酸、异丙基苯甲酸、间-羟基苯甲酸、2,4-二甲氧基苯甲酸以及肉桂酸对该酶具有一定的抑制效果,6 mmol/L浓度可以分别使酶活力被抑制35.3%、25.9%、26.7%、29.1%和20.0%;银杏外种皮粗提物有较强的抑制效果,0.4 mg/mL的银杏酸可以让酶活力几乎完全丧失.上述结果提示有望从粗筛得到的几种植物中进一步分离纯化出高效的NAGase抑制剂,为开发新型生物农药提供理论依据.

灰霉菌MyosinⅠ的体外表达纯化及抑制剂筛选

[目的]本文旨在体外表达纯化灰霉菌Ⅰ型肌球蛋白(MyosinⅠ)及筛选抑制剂。[方法]采用SF9昆虫细胞蛋白表达系统表达灰霉菌MyosinⅠ(BcMyosinⅠ)马达结构域,用亲和层析和凝胶过滤层析纯化方法纯化蛋白,用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达情况。从实验室已有的化合物库中,用ATPase活性试剂盒测定化合物对BcMyosinⅠ的酶活性抑制率。采用菌丝生长速率法测定部分化合物对灰霉菌的菌丝生长抑制活性。以禾谷镰刀菌Ⅰ型肌球蛋白(FgMyosinⅠ)三维结构为模板,同源模建预测BcMyosinⅠ三维结构。用AutoDock-Vina软件将部分化合物与BcMyosinⅠ进行分子对接。[结果]成功在体外表达纯化BcMyosinⅠ。20μmol·L^(-1)条件下,化合物B1和B17对BcMyosinⅠ的酶活性抑制率分别为56.24%和65.39%,显著高于对照药剂氰烯菌酯对酶活性的抑制率(27.29%);B1和B17对灰霉菌的菌丝生长抑制率分别为32.90%和83.44%,显著高于对照药剂氰烯菌酯对菌丝生长的抑制率(1.06%)。对照药剂氰烯菌酯与BcMyosinⅠ的结合自由能为-29.26 kJ·mol^(-1),而化合物B1和B17与BcMyosinⅠ的结合自由能分别为-35.53和-36.78 kJ·mol^(-1),结合自由能低,说明化合物B1和B17对BcMyosinⅠ的抑制活性均高于氰烯菌酯。[结论]成功获得BcMyosinⅠ单体蛋白;筛选出B1和B17两个灰霉菌肌球蛋白抑制剂。

中草药来源的Ⅰ类HDAC抑制剂筛选

为从中药来源的化合物中筛选Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂,采用HDAC抑制剂筛选试剂盒从60个化合物中筛选出对HDAC活性抑制作用较强的化合物,再用HDAC3/8抑制剂筛选试剂盒进一步评价其HDAC抑制,同时Western-blot法检测其对人宫颈癌细胞株(He La)Ⅰ类HDAC表达的影响。结果显示:血根碱、胡椒碱、异甘草素、丹酚酸C对HDAC抑制活性较强;异甘草素和异甘草苷显著抑制HDAC3/8活性;血根碱对He La细胞有明显的增殖抑制作用,对Ⅰ类HDAC的表达有明显的抑制作用。本研究提示血根碱、异甘草素和异甘草苷是Ⅰ类HDAC的抑制剂,其中血根碱值得进一步深入研究。

超高效液相色谱串联质谱联用法快速筛选3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂

建立了超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MS/MS)检测酶促反应体系中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)浓度变化,快速筛选3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)抑制剂的方法。优化了HMGCR酶促反应体系和检测NADPH的色谱-质谱条件,探讨了NADPH的离子化试剂的作用和质谱碎裂机理。采用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),以三乙胺/六氟异丙醇缓冲液(pH=8.0)为流动相,流速0.3 mL/min,柱温30℃,电喷雾离子源-多反应监测模式,对酶促反应体系中的NADPH进行分析。NADPH的峰面积与其浓度在0.05～50μmol/L范围内呈良好的线性关系(r>0.9996),定量限(S/N=10)为0.05μmol/L。

人细胞色素P450 CYP2C19与CYPOR、CYPb5共表达模型的构建及其抑制剂筛选

目的:获得人细胞色素P450 2C19(CYP2C19)蛋白重组酶,用特征性底物表征重组酶活性,并将该重组酶用于天然产物CYP2C19抑制剂的筛选。方法:构建含人CYP2C19基因的重组杆状病毒穿梭质粒,使用昆虫细胞-杆状病毒表达系统共表达人CYP2C19、细胞色素氧化还原酶(CYPOR)和细胞色素b5(CYPb5);用蛋白印迹分析(Western Blot)鉴定重组酶的表达;以奥美拉唑为底物进行代谢孵育,HPLC分析鉴定酶的活性;并使用该重组蛋白对70种天然产物进行抑制能力的筛选。结果:Western Blot结果显示重组人CYP2C19蛋白在Sf 9细胞中成功表达,该重组酶代谢经典底物奥美拉唑的酶动力学参数分别为:米氏常数Km为(4.99±0.22)μmol.L-1,最大反应速率Vmax为(0.2539±0.0024)μmol.min-1.mg-1蛋白,表观清除率CLint值为0.0509 L.min-1.mg-1蛋白。对70种天然产物的抑制筛选实验显示白藜芦醇、大黄素、异土木香内酯、莪术醇、薄荷脑、鬼臼毒素、补骨脂素、五味子甲素、五味子乙素、新狼毒素B等对人CYP2C19有比较明显的抑制能力。结论:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统,可获得代谢活性良好的重组人CYP2C19蛋白,该重组酶可进一步用于其他底物的Ⅰ相代谢研究以及各种抑制剂的筛选。

基于固定化酶的乙酰胆碱酯酶抑制剂体外筛选模型的建立

以可重复使用的固定化酶代替游离态酶,建立一种基于比色分析的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂体外筛选新模型.采用以氨基化硅胶为载体固定的AChE优化了实验条件,用AChE抑制剂阳性对照物他克林和毒扁豆碱对该模型进行验证,还对模型技术参数进行评价,并将新模型用于单体化合物及天然产物粗提物AChE抑制活性评价.结果表明,最佳实验条件为:固定化酶用量55μL,底物浓度5 mmol/L,甲醇、乙醇及体积分数不高于6%的二甲基亚砜水溶液均可作为样品溶剂;模型验证及模型技术参数评价结果良好,该模型对AChE抑制剂筛选有较好的特异性和灵敏度,可用于筛选AChE抑制剂.该模型具有适用性强、固定化酶可重复使用及结果可靠等优点,是单体化合物及天然产物粗提物AChE抑制剂活性评价的有效方法.

化学发光法用于芳香酯酶抑制剂体外筛选(英文)

在前期的研究中,我们将9-(4-氯苯氧羰基)-10-甲基吖啶酯三氟甲基磺酸盐(CPOCMA)用于测定血清芳香酯酶活性,取得满意结果.在此基础上,本文以CPOCMA为底物,建立化学发光法评估药物对芳香酯活性影响的新方法.以硝酸甘油为模型药物,比较了化学发光法与UV方法的一致性.并将此法应用于评价三种抗炎药吲哚美辛、阿司匹林和乙酰氨基酚对芳香酯酶活性的影响.药物的加入使血清催化CPOCMA水解的动力学减缓,这表明这些药物均为抑制剂.吲哚美辛、阿司匹林和乙酰氨基酚表现出的IC50值分别为0.254、0.564和0.656 mmol/L,抑制常数ki分别为0.154、1.38和2.98 mmol/L.加入药物后的Lineweaver-Burk曲线表明这三种药物对PON的抑制均为竞争性抑制.根据加入药物后的动力学曲线,其IC50值、抑制常数和米氏常数的变化均表明这三种药物的抑制能力大小顺序:吲哚美辛>阿司匹林>乙酰氨基酚.CPOCMA可以作为PON底物体外评价药物对PON的抑制能力和抑制机理.UV法不适合评价紫外吸收峰与UV法的检测波长重叠的药物,而新建立的化学发光法对这类药物的筛选有独特优势.

建立稳定表达人有机阴离子转运体OAT1细胞的活性检测方法及抑制剂的筛选

目的:建立稳定表达人有机阴离子转运体OAT1的细胞(hOAT1)中6-羧基荧光素浓度测定的荧光分析方法,并用于hOAT1细胞活性的测定及其抑制剂的筛选。方法:采用荧光分光光度法,检测波长为激发波长485 nm,发射波长520 nm,BCA法检测样品蛋白浓度。以6-羧基荧光素的荧光强度对蛋白浓度的比值作为衡量转运体OAT1活性的指标。结果:在hOAT1细胞中,6-羧基荧光素检测浓度的线性范围为0.08~3.2μmol·L^(-1)(r=0.9991),低、中、高浓度6-羧基荧光素溶液测定的日内RSD分别为6.08%、2.66%、0.86%,日间RSD分别为7.83%、3.73%、0.72%,绝对回收率分别为(111.35±9.8)%、(86.61±3.89)%、(100.15±1.10)%。抑制剂筛选结果显示1mmol·L^(-1)缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦、替米沙坦、辛伐他汀、瑞舒伐他汀对hOAT1抑制率分别为103.45%、110.34%、93.41%、90.33%、79.84%、95.22%。结论:本方法简单易行,可用于hOAT1细胞活性测定,缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦、替米沙坦、辛伐他汀、瑞舒伐他汀对hOAT1存在抑制作用。

微流控技术筛选酶抑制剂的研究进展

随着近年新合成或提取的化合物大量涌现,药物筛选朝着快速、高效、高通量方向发展。微流控分析技术具有的分析微型化、高通量化、可集成化和良好的生物相容性等特点,为药物的筛选提供了新的方法和技术平台。本文简要介绍了酶抑制剂筛选,重点评述基于微流控技术筛选酶抑制剂的研究进展。

SGLT2选择性抑制剂筛选及药效评价方法建立

本研究的目的是建立SGLT2选择性抑制剂筛选及药效学评价体系。分别将人全长SGLT2和SGLT1c DNA连接至p MSCVpuro载体并转染HEK293细胞,嘌呤霉素筛选单克隆细胞,RT-PCR、Western blot或细胞免疫荧光染色检测目的基因、蛋白在细胞中的表达。采用荧光标记的1-脱氧葡萄糖(1-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-1-deoxy-D-glucose,1-NBDG)作为底物进行葡萄糖转运实验,检测模型细胞的Na+依赖的葡萄糖摄取功能,并对阳性药达格列净、根皮苷选择性进行评价。最后,进行整体药效评价,观察达格列净对正常小鼠及四氧嘧啶诱导的T1DM小鼠血糖的影响。结果显示p MSCVpuro-SGLT1转染组细胞SGLT1基因及蛋白水平均显著升高,p MSCVpuro-SGLT2转染组SGLT2蛋白高表达于细胞膜及细胞质,说明SGLT1/SGLT2稳定过表达细胞构建成功。葡萄糖转运实验结果显示,与p MSCVpuro-null转染组相比,p MSCVpuro-SGLT1、p MSCVpuroSGLT2转染组细胞Na^+依赖性1-NBDG摄取明显增高。达格列净具有良好的选择性,对SGLT1的半数抑制浓度(IC50,6.20×10^(-7) mol·L^(-1))远高于对SGLT2抑制的IC50值(2.24×10^(-10) mol·L^(-1)),优于非选择性抑制剂根皮苷。达格列净单次给药即可改善正常小鼠葡萄糖耐量。对T1DM小鼠,达格列净从给药后1 h血糖水平即显著降低,能够剂量依赖地降低0~24 h血糖-时间曲线下面积。连续给药20天,能够较平稳地降低小鼠餐后血糖。本研究建立了较完善的SGLT2选择性抑制剂的体外筛选方法和整体药效学评价方法。该方法具有无同位素污染,高转运效率、良好稳定性等优点,将为新的SGLT2高选择性抑制剂研发提供良好的技术平台。

质谱技术在酶抑制剂筛选中的研究进展

酶是调控人体机能使机体进行正常生命活动的物质,酶抑制剂能特异性调节酶的活性并可能成为药物发现的起点。目前,质谱具有对酶反应进行快速定量分析的优势,使其在酶抑制剂筛选发现新药领域发展迅猛。本文综述了近几年国内外应用质谱以及质谱联用技术(前沿亲和色谱、固定化酶磁珠、超滤、表面等离子体共振、毛细管电泳和微流控芯片)筛选酶抑制剂的方法。按照两种不同筛选原理进行阐述:活性筛选和亲和筛选。

HIV-1整合酶核心区可溶性表达及抑制剂筛选

为了实现HIV-1整合酶蛋白核心区(central core domain of integrase,IN-CCD)的可溶性表达,并建立以IN-CCD为靶点的抑制剂体外筛选方法,从包含F185K突变HIV-1 IN基因的质粒中经PCR扩增得到含有F185K突变的IN-CCD基因,克隆到pET28b载体上构建重组质粒pIN-CCD,转化pIN-CCD至E.coli BL21(DE3)中经IPTG诱导、表达,Ni-亲和层析纯化,获得IN-CCD蛋白。修饰DNA底物,以链亲和素包被的磁珠为载体捕获DNA产物,结合酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测IN-CCD的去整合活性,并筛选以IN-CCD为靶点的抑制剂。结果表明重组蛋白IN-CCD实现了高效可溶性表达,纯化后蛋白纯度达95%。建立的ELISA可以检测IN-CCD的去整合活性,且方法特异性和灵敏度好,可以实现高通量抑制剂筛选。从100个样品中筛选得到5个具有初步抑制IN-CCD去整合活性的样品。

基于Caco-2细胞裂解液的DPP-4抑制剂筛选方法的建立

使用结直肠腺癌Caco-2细胞裂解液对西格列汀的DPP-4抑制率和抑制类型进行测定,建立体外筛选DPP-4抑制剂的模型。将成熟分化的Caco-2细胞于Tris-HCl缓冲液内超声破碎制成细胞裂解液,以甘氨酰-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Gly-Pro-AMC)为底物对裂解液中DPP-4的比活力进行测定。以Gly-Pro-AMC为底物、稀释后的Caco-2细胞裂解液为DPP-4酶溶液,使用一系列底物浓度测得西格列汀对DPP-4抑制的IC50,使用双倒数作图法在一系列底物以及抑制剂浓度下测得西格列汀的抑制类型。在实验条件下测得西格列汀的IC50为18.68 nmol/L(95%CI,15.44~21.90 nmol/L)(拟合曲线R^(2)>0.99),抑制类型为竞争性抑制(拟合曲线R^(2)>0.99)。测得模型条件下的酶反应动力学参数Km为(75.11±2.15)μmol/L,Vmax为(1.00±0.03)μmol/(L·min),以及西格列汀的Ki为6.07 nmol/L(95%CI,5.61~6.58 nmol/L)(拟合曲线R2>0.99)。使用该模型测得西格列汀的DPP-4抑制率和抑制类型与文献报道相符,证明该模型可以用于DPP-4抑制剂的筛选。

从噬菌体表面展示肽库中筛选葡萄球菌B型肠毒素抑制剂

通过生物淘选,从噬菌体表面展示12肽肽库中筛选能与葡萄球菌B型肠毒素(staphylococcalenterotoxinB ,SEB)结合且能抑制其肠毒活性的特异性短肽.采用Phage ELISA和MTT鉴定所得目的肽的亲和性;根据优势噬菌体阳性克隆序列合成相应多肽.利用竞争ELISA研究合成肽与SEB单克隆抗体竞争结合SEB的情况;通过动物实验考察其抑制SEB的超抗原特性和肠毒活性情况.筛选所得短肽在一定浓度范围内可以抑制SEB对鼠脾淋巴细胞的激活;合成肽与SEB质量比为16 0∶1时,合成肽可较好地抑制SEB对乳猫的肠毒活性,并对SEB引起的小鼠致死具有明显保护作用.结果表明,初步得到了能与SEB特异结合并能抑制SEB超抗原特性和肠毒活性的短肽,为进一步研制SEB高效抑制剂奠定了基础.

Ⅲ型分泌系统及其抑制剂的研究进展

细菌分泌系统的发现是近年来细菌致病机制研究的重点。致病菌为在宿主体内生存、繁殖、扩散,会分泌一些蛋白性质的毒性因子。目前认为革兰阴性致病菌在长期进化过程中形成入侵宿主细胞的特异性分泌系统共有5种类型(Ⅰ~Ⅴ型),其中最显著的是细菌Ⅲ型分泌系统(type three secretion system,T3SS),与细菌致病性密切相关。T3SS抑制剂的策略是细菌分泌毒力蛋白,阻止其对宿主细胞的侵染。本文对细菌T3SS的组成、T3SS抑制剂筛选系统、T3SS抑制剂以及作用机制等进行综述,为深入研究以T3SS为靶点的药物设计提供参考。

CDDO-Me对三阴性乳腺癌细胞泛素特异性蛋白酶2a活性及细胞增殖的抑制作用

目的·在三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)细胞中研究筛选得到的泛素特异性蛋白酶2a(ubiquitin-specific protease 2a,USP2a)抑制剂甲基巴多索隆(bardoxolone methyl,CDDO-Me)对USP2a活性及细胞增殖的影响。方法·利用泛素特异性蛋白酶抑制剂筛选系统筛选得到USP2a抑制剂CDDO-Me,采用分子对接分析技术预测CDDO-Me与USP2a的结合情况,采用细胞热迁移实验(cellular thermal shift assay,CETSA)检测CDDO-Me与3种TNBC细胞株内USP2a蛋白的结合情况。通过Western blotting检测USP2a的底物β连环素(β-catenin)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)蛋白水平以及凋亡相关蛋白胱天蛋白酶3(caspase3)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose)polymerase1,PARP1]的变化。利用细胞活性检测试剂盒8(cell counting kit-8,CCK8)检测CDDO-Me对TNBC细胞增殖的影响。MDA-MB-468细胞瞬时转染pLVX(pLVX组)或pLVX-USP2a(pLVX-USP2a组)质粒,经CDDO-Me处理后,采用Western blotting检测β-catenin和TRAF6的蛋白水平,流式细胞术检测细胞周期以及台盼蓝拒染法检测活细胞数。结果·CDDO-Me在体外可以抑制USP2a活性,50%抑制浓度为3.84μmol/L。分子对接分析结果显示,CDDO-Me可以和USP2a的His456残基之间形成氢键,和Phe409、Tyr514残基之间具有疏水相互作用。CETSA实验结果显示,CDDO-Me能够和3种TNBC细胞中的USP2a蛋白结合。Western blotting结果显示,CDDO-Me可以下调USP2a底物β-catenin和TRAF6的蛋白水平,而相同浓度的CDDO-Me处理USP2a过表达的MDA-MB-468细胞,发现β-catenin和TRAF6蛋白水平未出现明显降低。CDDO-Me呈剂量依赖性抑制TNBC细胞的增殖,使细胞发生caspase3活化和PARP1的剪切并且导致细胞出现S期和G2/M期阻滞。与pLVX组相比,pLVX-USP2a组活细胞数目更多,细胞也未出现周期阻滞。结论·CDDO-Me可以抑制TNBC细胞中USP2a的活性,并且抑制TNBC细胞的增殖,诱导其凋亡。