抑制性消减杂交技术原理及应用

0引言 抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA消减杂交技术.通过合成两个不同的接头,连接于测试cDNA片段的5'末端,达到选择性扩增差异性表达的cDNA片段,抑制非目的cDNA的扩增.该技术与其他消减杂交技术相比具有假阳性率低、敏感性高、效率高等优点而得到广泛应用.

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因

目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因。方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1000 b插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因。结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。

应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活的相关基因

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建乙型肝炎病毒 (HBV)前 S1蛋白 (pre S1)反式激活的相关基因cDNA消减文库 ,克隆前 S1反式激活相关基因 ,以期发现前 S1蛋白反式激活作用的靶位点 ,为阐明前 S1蛋白的反式激活作用的分子生物学机制 ,以及HBV相关肝细胞癌 (HCC)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向。方法 以HBV前 S1表达质粒pcDNA3 .1(-) preS1转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaⅠ酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与pGEM Teasy载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌DH5α进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 文库扩增后得到 67个阳性克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 5 1个 2 0 0～ 10 0 0bp插入片段。对所得片段测序 ,并进行同源性分析 ,获得 3 2种编码基因 ,其中 2 6个为已知功能基因 ,另外 6个为未知功能序列 ,可能是前 S1蛋白反式激活新的靶基因。结论 成功构建HBV前 S1反式激活的相关基因cDNA消减文库 ,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。为进一步阐明前

应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选HCVp7蛋白的反式调节基因

目的:构建丙型肝炎病毒HCV p7蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA,克隆HCV p7蛋白反式激活相关基因. 方法:以HCV p7表达质粒pcDNA3.1(-)-p7转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建人HCV p7蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA.扩增后得到56个200-1 000 bp插入片段的克隆, 随机挑选其中33个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因,其中1个为未知功能的新基因. 结论:筛选到的cDNA全长序列,包括与细胞生长调节、物质代谢、和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因.

抑制性消减杂交技术(SSH)及其在基因克隆上的应用

简要概述了抑制性消减杂交技术的基本原理、基本过程、优越性。

应用抑制性消减杂交技术筛选三氧化二砷对肝细胞调节的差异表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建As2O3处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆As2O3调节相关基因,阐明As2O3对肝细胞调节作用的分子生物学机制. 方法:以As2O3处理HepG2细胞,同时以PBS处理的相同细胞系作为对照;24 h后制备细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA 消减文库,并转染大肠杆菌J109进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建三As2O3处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到109个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000bp插入片段.挑取含有插入片段的36个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得15种已知基因序列和6个未知功能的新基因. 结论:应用SSH技术成功构建了As2O3处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.

抑制性消减杂交技术及其应用研究进展

抑制性消减杂交(SSH)技术是结合抑制性PCR和消减杂交技术发展起来的一种高效分离差异表达基因的方法,具有特异性高、假阳性率低、操作简便、速度快、效率高等优点。利用SSH技术进行不同状态下基因的表达变化分析、差异基因的克隆和鉴定对了解基因表达调控有着重要意义。为此,综述了SSH技术的原理及其在发育调控基因、疾病发生机制、药物研发、性状筛选及环境生物修复等方面的应用研究进展。

抑制性消减杂交技术在养殖鱼类免疫基因克隆中的应用

抑制性消减杂交技术(SSH)是近年来兴起的一种分离、克隆差异基因的新技术,它结合了消减杂交和抑制PCR的优点,具有操作简便、特异性强、背景低及重复性好的优点。目前已经用SSH技术鉴定出了鱼的许多免疫相关基因,如白细胞介素、趋化因子、肿瘤坏死因子、溶菌酶、NKEF、补体、干扰素及急性期蛋白基因等,对它们的结构和功能进行了较为深入的研究。本文对SSH技术在养殖鱼类中克隆的免疫基因进行了归纳与总结,旨为全面了解鱼类的抗病免疫基因提供基础资料。

应用抑制性消减杂交技术筛选双环醇调节靶基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybrid- ization,SSH)技术构建双环醇处理的人肝癌细胞系HepG2 差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆双环醇调节相关基因,阐明双环醇对肝细胞调节作用的分子生物学机制. 方法:以双环醇处理HepG2细胞,同时以二甲基硫氧化物(DMSO)处理的相同细胞系作为对照;24 h后制备细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到46个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得14 种已知基因序列. 结论:应用SSH技术成功构建了双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明双环醇在体内的调节机制提供依据.

应用抑制性消减杂交技术克隆HCV NS3蛋白反式激活基因2的上调基因

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消文库,克隆HCV NS3蛋白反式激活相关基因. 方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2 细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建人HCV NS3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到61个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到100-1000 bp插入片段.挑取30 个插入片段测序分析,得到30个已知功能基因序列. 结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了NS3TP2可能存在的调控机制的线索.

应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活基因1的反式调节基因

目的:筛选与克隆丙型肝炎病毒(HCV)NS3反式激活基因1 的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索. 方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin- formatics),技术筛选并克隆NS3TP1反式激活的新型靶基因. 以NS3TP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后, 将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA 消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建人NS3TP1反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库.文库扩增后得到68个阳性克隆,进行菌落PCR 分析,均得到200-1000 bp插入片段.随机挑选其中36个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得23种编码基因,其中3个为未知功能的新基因. 结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因, 推测了NS3TP1可能存在的调控机制的线索.

应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒e抗原调节基因

目的 筛选与克隆HBeAg激活基因 ,了解其在体内的凋节功能线索。方法 以HBeAg表达质粒pcDNA3 .1(-) HBeAg转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为平行对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaⅠ酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR) ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染人肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HBeAg激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 40个阳性克隆 ,进行菌落PCR分析 ,均得到 2 0 0～ 80 0bp插入片段。对插入片段测序 ,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列 ,结果共获得 12种编码基因 ,包括 11种已知基因和 1种未知基因。结论 筛选到的cDNA全长序列 ,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因 ,推测了HBeAg在体内可能存在的调控机制的线索 ,尚需进一步的实验证明。

应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCVNS2蛋白的反式调节基因。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析。结果:获得12个差异表达的已知蛋白基因和3个未知功能基因序列,包括:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,GPC3)、酸性核糖体磷蛋白PO、核糖体蛋白L13a、整合素β1、天冬酰胺合成酶、信号肽酶、α2HS糖蛋白、小核糖体蛋白多肽G、蛋白酶样亚单位、黄体酮受体、SDR家族脱氢酶8、Ras家族RAB4A、具有BTB/POZ结构的新蛋白、具有coiled coil helix结构的新蛋白、未知功能基因。结论:成功构建HCVNS2反式调节的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制提供了线索。

应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A-TP4反式激活基因

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建人类新基因NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆NS5A-TP4反式激活相关基因,了解该基因的可能生物学功能。方法:以NS5A-TP4表达质粒pcDNA3.1(-)-TP4转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液,从总RNA中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果:成功构建人类新基因NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到63个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000 bp插入片段。挑取含有插入片段的36个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得20种已知功能基因序列和5个未知功能基因。结论:应用SSH技术成功构建了NS5A-TP4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为阐明NS5A-TP4生物学功能提供理论依据。

应用抑制性消减杂交技术克隆人肺鳞癌差异性表达基因

目的 克隆人肺鳞癌肿瘤差异性表达基因。方法 应用抑制性消减杂交技术 (suppressionsub tractivehybridization,SSH)构建人肺鳞癌cDNA消减杂交文库 ,筛选后挑选阳性克隆进行测序 ,并在GenBank数据库中进行同源性比较 ,最后经RT PCR验证。结果 成功克隆 1 0个差异基因片段 ,其中 2个为新基因 (Gen Bank登录号分别为 :C2 0 :AF3630 68;C34 :AY0 32 661 )。

抑制性消减杂交技术及其在感染病学中的应用

抑制性消减杂交技术(Suppressive subtractive hybridization, SSH)是近年来兴起的一种检测差异表达基因的方法,广泛用于寻找疾病及肿瘤相关基因、生长和发育相关基因、药物的筛选和靶向治疗及其明确基因的功能等.本文从SSH技术的原理、效率、存在的问题和展望及其在感染病学中的应用等方面进行了综述.

应用抑制性消减杂交技术筛选HBxAg蛋白结合蛋白XBP1的上调基因

目的应用酵母双杂交及生物信息学(bioinformatics)技术获得HBxAg蛋白结合蛋白XBP1,为了解该基因的反式调节机制,利用抑制性消减杂交技术筛选并克隆XBP1蛋白反式激活的靶基因。方法以XBP1表达质粒pcD-NA3.1(-)-myc-his(A)-XBP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)-myc-his(A)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析。结果成功构建人XBP1蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到80个200～1 000bp插入片段的克隆,随机挑选其中30个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得28个已知编码序列基因和2个未知的新基因。结论 XBP1在肝细胞内表达后能够上调HepG2细胞中许多不同基因表达的变化,这些基因与细胞信号转导、细胞增殖与分化、免疫应答、能量代谢、细胞凋亡、肿瘤发生等生物过程密切相关。

应用抑制性消减杂交技术筛选HBV DNA聚合酶中RNase H的反式调节基因

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建HBV DNA聚合酶(DNA P)末端蛋白反式激活基因. 方法:以RNase H表达质粒pcDNA3.1(-)-RNase H转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI 酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:文库扩增后得到38个白色克隆,经菌落PCR分析, 得到36个200-1 000 bp插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,显示33种已知基因编码蛋白和3种未知功能基因序列,可能是RNase H反式激活靶基因, 结论:成功构建HBV RNase H反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.

抑制性消减杂交技术在研究热适应机制中的应用

目的探索热适应动物体内在常温静息状态下是否存在与热适应相关的基因差异表达,评估从基因差异表达角度研究热适应机理的可行性。方法在大鼠肝组织标本上提取mRNA,反转录成双链cDNA,应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)比较热适应组与常温对照组基因的差异,构建差异表达基因消减文库。采用PCR-Select Differential Screening技术鉴定是否存在差异表达的基因。结果初期实验证实6个cDNA片段为差异表达。结论热适应大鼠在常温静息状态下肝脏组织中存在热适应相关基因的差异表达,推测可能与大鼠保持热适应能力有关。提示通过分离热适应相关的差异表达基因研究热适应机制是一种可行的思路。