利用抑制消减杂交技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因

为了筛选线虫的性别特异性基因,为线虫乃至寄生虫的性别控制提供新的工具,本研究选择猪蛔虫(Ascarissuum)为模型,分别提取雌性和雄性成虫的mRNA后,采用Clontech公司的PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交(SSH),构建猪蛔虫雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库,并采用地高辛(DIG)标记的cDNA探针进行Southern杂交检验所构建文库的消减效率。结果表明,雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库均具有很强的性别特异性。随机从各库中各抽取25个克隆进行测序及在线BLAST分析,发现在25个雄虫ESTs中有20个已知ESTs,5个新的ESTs;25个雌虫ESTs中有11个已知ESTs,还有8个可能为新基因。猪蛔虫性别差异表达的消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究性别特异基因的功能奠定了基础。

抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中的应用

用抑制性消减杂交技术（SSH）研究与鲤鱼（Cyprinus carpio）抗寒性状相关的基因。通过对荷包红鲤抗寒品系（Cyprinus carpio wuyanensis Tchang）和柏氏鲤（Cyprinus pellegnini Tchang）杂交F2代进行降温诱导实验，获得不同温度下的实验材料。利用抑制消减杂交技术构建了一个低温下差异表达基因的消减cDNA文库，共含有2000个克降。对其叶1480个克隆进行斑点杂交筛选，共得到60个阳性克隆，选取其中29个克隆测序。通过序列分析比对，13个克隆与已知基因序列高度同源，同源性为85％-98％；另外的13个克隆为未知新基因序列。在13个同源性较高的克隆序列巾，有brevican基因、AMP—acid连接酶、CFL2基因、催产素基因、主要组织兼容复合体（MHC）Ⅱβ链、锌指蛋白、细胞色素氧化酶、EPD-1基因、透明质酸结合蛋白多糖类、核受体／类视色素信号调节器等，其中9个基因上调表达，另有4个则抑制表达。这些基因的获得可为研究鱼类抗寒性状以及从分子水平上阐明其机制提供重要依据。

茶树休眠芽与萌动芽抑制消减杂交文库的构建与初步分析

为了解茶树越冬芽休眠及其解除的分子机理,以休眠芽和萌动芽为材料,构建了茶树休眠芽与萌发芽的正、反向抑制消减杂交文库,并从两个文库各随机挑选96个阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。建库质量分析结果表明,所构建的正、反向消减文库有效富集了差异基因,消减效率达到要求,插入片段集中于250-750bp之间,文库质量较好。对正、反向文库随机挑选的阳性克隆测序和分析结果表明,正、反向文库在基因表达谱上存在一定的差异,萌动芽文库在亚细胞器形成、转运载体等方面的基因与休眠芽文库有较大差异,而休眠芽文库在抗氧化、翻译调控以及胁迫响应等方面的基因与萌动芽文库有较大差异。这两个文库的建立为进一步了解茶树芽休眠与解除的分子机制奠定了基础。

应用抑制消减杂交技术构建肝癌差异表达基因消减cDNA文库

目的 构建肝癌及癌旁肝组织差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交方法 ,以肝癌组织及癌旁肝组织作为对比材料 ,分离肝癌组织中差异表达基因的cDNA片段 ,将其与T载体进行T/A连接构建文库 ,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩增后 ,随机挑取 1 0 0个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得 30 0 0余个白色阳性克隆 ,随机挑取 1 0 0个白色克隆用PCR进行扩增 ,95%的克隆中均有 1 0 0～ 6 0 0bp的插入片段 ,这些片段可能是肝癌差异表达基因的cDNA片段。结论 用SSH法及T/A克隆技术成功构建了肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库 ,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆肝癌差异表达的新基因奠定了基础。

应用抑制消减杂交分离雌、雄鸡胚性分化早期的差异表达基因

分离不同性别的鸡胚性分化早期差异表达基因,可为禽类性别决定和性分化机制研究提供基本信息。本研究分别以孵化3.5-6d的雌、雄鸡胚性腺为材料,利用抑制性消减杂交技术成功构建了雌-雄鸡胚间正、反向消减cDNA文库,并利用斑点印迹杂交从中筛选出了39个性别差异表达的阳性cDNA克隆。以持家基因GAPDH为参照指标检测消减文库的消减效率,结果发现两个文库的消减效率均高达25倍。插入片段PCR鉴定结果显示,消减文库中cDNA插入片段的长度主要分布于250-750bp之间。分别对雌、雄鸡胚消减文库中的252和168个cDNA克隆进行斑点杂交筛选,再随机从两个消减文库中共抽取39个阳性差异表达克隆进行序列测定及序列比对分析。结果表明:这39个cDNA克隆分别代表了定位于鸡不同染色体上的18个已知功能的基因和11个假定基因;参照哺乳动物同源基因的功能,所得的18个已知差异基因可能参与多种生物反应过程。用半定量RT-PCR方法对雌、雄鸡胚消减文库中各5个基因的表达情况进行进一步验证,发现除雌性库中的一个基因外其它9个基因均有较明显的性别差异表达。

用抑制消减杂交法分离巴西橡胶树胶乳特异表达基因

采用巴西橡胶树常割树胶乳的Poly(A+)RNA为Tester,叶片Poly(A+)RNA为Driver,通过抑制消减杂交法(suppressivesubtractivehybridization,SSH)构建了一个胶乳特异表达基因差减文库,通过菌落PCR及反式NorthernDot-Blot筛选鉴定阳性差异片段,获得79个胶乳特异表达阳性克隆,部分阳性克隆还通过NorthernBlot杂交及RT-PCR进一步验证。随机挑选部分阳性克隆序列比较分析,结果表明有部分克隆与巴西橡胶树中已知的基因相同,而多数克隆在巴西橡胶树中是新发现,它们与橡胶生物合成、物质代谢运输、信号传导和形态建成等相关。

镰形扇头蜱唾液腺抑制消减杂交文库的构建和分析

【目的】寻找镰形扇头蜱吸血后较吸血前唾液腺差异表达基因。【方法】以抑制消减杂交法分别构建镰形扇头蜱半饱血雌蜱和吸血雄蜱唾液腺以pGEM-T-easy为载体的cDNA文库,并测序进行生物信息学分析。【结果】分别测得247个雌蜱有效EST序列和168个雄蜱有效EST序列,并预测雌蜱可能含有5′末端和3′末端的EST序列分别为25个和44个,雄蜱可能含有5′末端和3′末端EST序列分别为53个和74个。随机选择非重复的24个雌蜱序列和21个雄蜱序列以RT-PCR方法验证消减效果;在吸血后唾液腺中,雌蜱有13个基因表达上调或新表达,消减效率为54%,雄蜱有9个基因表达上调或新表达,消减效率为43%。对所测有效序列经BLAST分析,检索247个雌蜱序列获得141个匹配,匹配率为57%,其中有32个蜱基因,占141个匹配基因的23%;检索168个雄蜱序列获得125个匹配,匹配率为74%,其中有29个蜱基因,占125个匹配基因的23%。BLAST检索结果显示这些蛋白主要包括帮助蜱口器固定免疫调节蛋白、抗凝血蛋白、加强能量代谢的线粒体蛋白和促进基因转录的各种转录因子。【结论】这些蛋白主要是为了适应蜱吸血的生理过程及应变蜱因吸血而产生的免疫防御和排斥。

应用抑制消减杂交(SSH)克隆肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因

目的 克隆和筛选肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因。方法 将肺腺癌多药耐药细胞 (SPC A 1/CDDP)作为实验组 ,肺腺癌细胞 (SPC A 1)作为对照组 ,应用抑制消减杂交技术 ,构建实验组特异表达cDNA消减文库 ;用斑点杂交初步筛选cDNA消减文库后 ,将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析 (Genebank)。结果 建立了一个肺腺癌多药耐药细胞 (SPC A 1/CDDP)特异表达cDNA消减文库 ,斑点杂交初步筛选显示 2 3个克隆中有SPC A 1/CDDP特异表达cDNA片断 ,测序和同源性分析表明 2个cDNA片断为新序列 ,其余cDNA片断与已知基因有 96%～ 10 0 %的同源性。结论 2个新的cDNA序列可能为未知肺腺癌多药耐药相关基因序列 ;抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法。

应用抑制消减杂交克隆内皮细胞内毒素刺激后相关基因

提取人脐静脉内皮细胞经内毒素刺激 6h后的mRNA并合成cDNA ,与对照组进行抑制消减杂交 ,经菌落斑点杂交筛选出阳性克隆 ,进行测序和同源性分析 ,并采用Northern杂交验证新的cDNA序列。共获得 2 5条差异表达基因 ,涉及与编码炎症介质、胞内信号传导、细胞骨架、细胞凋亡和能量代谢相关的基因 ,其中 3条为新基因序列。结果表明 ,抑制消减杂交技术有效地克隆了内皮细胞内毒素刺激后相关基因 ,有助于阐明内毒素激活血管内皮细胞的机制 。

应用抑制消减杂交技术筛选葡萄冬芽和夏芽生理休眠相关基因

【目的】葡萄新梢上的芽有冬芽和夏芽两种,根据这两种芽休眠特性的差异,筛选与芽生理休眠相关基因,进而从分子水平研究葡萄芽生理休眠的相关机制。【方法】以‘赤霞珠’葡萄新梢上冬芽和夏芽为材料,夏芽作为驱动方(driver),冬芽作为实验方(tester),采用抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建冬芽和夏芽的SSH-cDNA文库,筛选冬芽和夏芽差异表达的基因片段。通过NCBI同源比对,寻找与葡萄芽生理休眠相关的基因,并对差异表达基因进行功能注释和分类。最后,运用Real-time PCR技术对部分候选基因进行检测,以验证其与葡萄芽生理休眠的相关性。【结果】共获得359条有效、高质量的差异基因片段,经CAP3软件聚类拼接,得到106个unique EST。在GenBank中进行BLASTN同源比对,有98条EST与已知蛋白或基因具有不同程度的同源性,占全部EST的92.4%。进行BLASTX同源比对,有54条EST与功能已知蛋白或基因具有不同程度的同源性,占全部EST的51%。已知功能的EST涉及休眠、逆境胁迫、细胞代谢、胞内物质运输等方面,且绝大多数基因信息来源于葡萄、苜蓿、橄榄、油菜、高粱、棉花、大蒜、拟南芥等植物。对差异基因片段进一步的功能分析发现,调控开花的基因占生物学过程的20%;与环境胁迫相关的基因占生物学过程的6%;与细胞代谢相关的基因占生物学过程的20%;与胞内物质运输相关的基因占总生物学过程的6%;其他包括DNA转录、减数分裂、细胞死亡及细胞壁松弛作用等。这些基因的分子功能主要有半胱氨酸型肽链内切酶、甲基转移酶、蛋白激酶、催化活性、结构分子活性、蛋白结合功能、DNA结合功能、ATP结合功能、蛋白质二聚体催化活性及丙酮酸氨基转移酶活性等。经Real-time PCR检测得知,在夏芽萌发过程中,候选基因在冬芽和夏芽中表达量呈不规律变化,且同一基因在相同节位的冬芽和夏芽中表达量均有较大差异。【结论】发现了一些在冬芽中表达频率较高的基因,如编码MADS FLC-like蛋白、钙依赖蛋白激酶、NADP依赖型的苹果酸酶、细胞壁水解酶、细胞壁松弛蛋白、外被体蛋白β亚基、热激蛋白、衰老相关蛋白、细胞色素P450、细胞壁关联蛋白等基因,认为线粒体蛋白基因、未知蛋白基因、开花相关基因、ATP合成酶β亚基基因、MADs FLC-like蛋白基因等与葡萄芽生理休眠具有相关性。

利用抑制消减杂交技术筛选鹅就巢行为相关基因

旨在利用抑制消减杂交技术构建鹅就巢与产蛋cDNA基因文库,筛选就巢母鹅上调与下调表达的基因。以就巢期和产蛋期鹅卵巢组织互为检测子和驱动子,进行正反双向消减杂交,获得鹅卵巢差异表达基因文库。从双向文库随机挑选单菌落进行PCR验证,结果表明文库质量良好。选取654个阳性克隆进行测序分析,获得641条表达序列标签(ESTs)。对ESTs进行去除载体序列、质量检测、聚类及拼接,经BLASTn比对,有166条ESTs找到与之匹配的同源序列,其中92个是功能基因。比较就巢与产蛋SSH文库,发现就巢SSH库中参与细胞凋亡、信号转导及细胞结构的基因出现频率较高;产蛋特异性基因文库中参与物质能量代谢、细胞防御的基因较多;尚有许多差异片段属于未知功能蛋白或理论推定蛋白。结果提示,催乳素受体、抗苗勒管激素以及雌激素受体基因在就巢期上调表达可能与鹅就巢行为的启动与维持有关。该结果为进一步研究鹅就巢行为分子调控机制奠定基础。

应用抑制消减杂交技术筛选人肾癌差异表达新基因

背景与目的:认识肾癌差异表达基因有助于阐明肾癌发生、发展的分子机制,但至今有关肾癌差异基因尤其肾癌特异相关基因的研究仍不令人满意。本实验应用抑制消减杂交技术筛选人肾癌组织与正常肾组织间差异表达的新基因,以期克隆出新的肾癌特异相关基因。方法:以肾癌组织mRNA为检测对象(Tester),正常肾组织mRNA为驱赶者(Driver),构建cDNA消减文库。随机挑取文库克隆进行酶切及测序,所得结果在GenBank中做同源性比对分析,对感兴趣的片段进行电子定位确定其在染色体的位置。用Northernblot、半定量RT-PCR方法检测新基因在肾癌组织与正常肾组织中的差异表达。结果:文库包含414个阳性克隆;随机挑取280个克隆提取质粒并酶切分析,其中265个有插入片段;将其中80个克隆进行测序,初步显示28、158、170、249号4个克隆为新基因片段,电子定位表明上述4个基因分别位于染色体21q22、4p15.3、9q34、22q11.2,已在GenBank中登录(BM181083,BI784487,BI863835,BI863386)。对其中28、170号克隆用Northern杂交、半定量RT-PCR检测,证实新基因在肾癌组织中表达较正常肾组织显著增高。结论:抑制消减杂交技术是筛选、克隆肾癌差异表达新基因的有效手段;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长、研究基因功能提供了实验基础。

大豆再生抑制消减杂交文库的构建

大豆再生受基因型限制，高效稳定再生体系建立难、遗传转化效率低，影响生物技术的应用。为获得与大豆再生相关基因，解析大豆再生基因分子机制，从而建立高效、稳定再生体系，为生物技术在大豆分子育种中的应用奠定基础。文章利用抑制性消减杂交技术（Suppression subtractive hybridization，SSH），以东农50子叶节为材料构建消减杂交cDNA文库，从文库中随机挑取917个阳性克隆，PCR鉴定插入片段大部分集中在100~750 bp，利用BLAST在GenBank数据库进行序列相似性比对，经过同源性比对归并后得到411个高质量ESTs片段，功能分析表明，这些基因与信号转导、葡萄糖、蛋白质大分子生物合成代谢，光、叶形态发生相关；调控细胞凋亡、细胞自身防御、细胞壁分化；参与各种激素及细胞分裂素介导的信号通路。

应用抑制消减杂交和cDNA芯片技术筛选流行性感冒病毒感染相关基因

病毒基因组有限的编码能力和以病毒蛋白为靶的抗病毒药物易出现耐药性 ,使从病毒感染宿主筛选病毒感染相关生物大分子作为抗病毒药靶和诊断标志物成为新的研究方向。为了筛选流行性感冒 (流感 )病毒感染相关基因 ,采用抑制消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术 ,以流感病毒A/鲁防 / 93 - 9(H3N2 )感染的MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料 ,构建病毒感染特异性差减cDNA文库。从文库中随机挑取约 80 0个克隆 ,PCR扩增其中插入片段 ,经纯化、紫外定量后 ,用基因芯片自动点样仪点在氨基片上 ,制备cDNA芯片。将流感病毒感染的MDCK细胞和正常MDCK细胞的总RNA分别用Cy3、Cy5反转录荧光标记后 ,与cDNA芯片杂交 ,用芯片扫描仪扫描获得芯片杂交信号 ,经阳性对照校正和归一化处理后 ,以如下条件作为判定基因差异表达的标准 ;(a)Cy3与Cy5的信号比值大于 1 5 (正常细胞用Cy5标记 )或小于 0 6 7(正常细胞用Cy3标记 ) ;(b)Cy3和Cy5信号值之一必须大于 10 0 0。经cDNA芯片筛选获得了 18个流感病毒感染特异性克隆 ,经测序和生物信息学分析发现均为流感病毒感染相关新基因EST。流感病毒感染相关基因cDNA片段的获得 ,为新型病毒药靶诊断标志物发现和功能研究提供了基础。

‘安吉白茶’抑制消减杂交cDNA文库的构建及初步分析

应用抑制消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)分离‘安吉白茶’全白期与全绿期叶片差异表达基因,成功构建了‘安吉白茶’白期叶与绿期叶的正、反向消减文库。随机挑选80个阳性克隆测序,通过BLASTX比对分析,80个序列中有30个没有找到任何同源序列,8个序列太短,且同源性不高,42个序列与已知蛋白有着或高或低的同源性。其中有3个基因片段可能与‘安吉白茶’高氨基酸形成相关。

黄瓜芽黄突变体抑制消减杂交文库的构建及初步分析

利用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）分离了黄瓜芽黄突变体及其野生型之间差异表达的cDNA片段.以突变体和野生型分别作检测子和驱赶子,建立正向和反向两个消减杂交cDNA文库;经阳性克隆鉴定,在正向文库中获得特异表达的阳性克隆有133个,在反向文库中得到的阳性克隆有73个.测序后将所得到的159条非重复且非黄瓜的ESTs（登录号：GH270133~GH270291）进行序列同源性比对分析,发现这些ESTs分别与叶绿素合成、光合系统、信号转导、转录因子、氨基酸代谢、糖类代谢、脂类代谢等相关酶及蛋白基因高度同源.

应用抑制消减杂交技术构建耐多药结核杆菌差异表达基因消减cDNA文库

目的:构建结核杆菌耐多药株与敏感株的差异表达消减cDNA文库,进一步探索结核杆菌耐多药的分子机制。方法:以耐多药菌株cDNA为实验组(Tester),敏感株cDNA为驱动组(Driver)应用抑制消减杂交(Suppression subtractive hybridiza-tion,SSH)技术结合T/A克隆技术构建结核杆菌耐多药株与敏感株的差异表达消减cDNA文库。结果:成功构建了耐多药结核菌株差异表达消减cDNA文库,获得113个差异表达cDNA片段。结论:研究表明SSH技术是筛选新功能基因的有效方法;多种已知或未知基因均参与了结核杆菌耐多药的调节,大规模筛选与克隆这些基因为进一步研究结核杆菌耐多药机制的产生奠定了必要的理论基础。

利用抑制消减杂交筛选瘢痕疙瘩差异表达基因

目的利用抑制消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)技术,比较瘢痕疙瘩与正常皮肤组织之间基因表达差异,筛选瘢痕疙瘩特有的差异表达基因片段,为揭示瘢痕疙瘩的病因提供实验依据。方法提取瘢痕疙瘩与正常皮肤组织细胞mRNA,逆转录成cDNA。以瘢痕疙瘩cDNA为检测子,正常皮肤组织细胞cDNA为驱动子,选择四碱基内切酶Rsa将cDNA酶切;连接特殊设计的接头进行消减杂交和PCR反应,得到消减混合物,与T载体连接,转化DH5α感受态细菌,建立差异消减文库。Southern杂交筛选鉴定差异基因,进行测序和同源分析。结果经SSH筛选、Southern杂交鉴定得到13个瘢痕疙瘩差异表达基因,其中已知功能的基因11个,如TA结合因子1、E4基因转录因子1、ephrinB2型受体基因、血小板生长因子受体基因等;有与肿瘤发生有关的基因,如G抗原7基因等;未知功能基因2个。结论筛选得到的瘢痕疙瘩差异表达基因,对了解瘢痕疙瘩发生发展的病因学基础和指导临床治疗具有重要意义。

胞囊线虫侵染后小粒黑豆抑制消减杂交cDNA文库的构建及EST分析

【目的】研究胞囊线虫侵染后大豆根部早期基因表达情况,从分子水平探索大豆的抗病机制。【方法】以抗大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)3号生理小种的小粒黑豆(Glycine max)为材料,利用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建大豆胞囊线虫诱导大豆根部早期表达的SSH-cDNA文库,并结合反向Northern斑点杂交筛选阳性克隆。【结果】获得280个表达序列标签(EST),经CAP3软件聚类拼接,得到166个unique EST,在GenBank进行Blastn与Blastx同源比对,有119条EST与已知蛋白或基因具有不同程度的同源性,占全部EST的83%,已知基因功能的EST涉及信号识别和传导、能量与物质新陈代谢、膜及转运、木质素和类黄酮的生物合成、抗病防御、细胞保护和转录调控。【结论】本研究在大豆胞囊线虫侵染早期发现了表达频率较高的基因如过氧化氢酶、泛肽素、几丁质酶、脂肪氧合酶、水通道蛋白、成熟调控蛋白、金属硫蛋白、脂膜嵌入蛋白、细胞色素P450和3-磷酸甘油醛脱氢酶等,并推测这些基因在大豆与胞囊线虫的非亲和互作过程中起重要作用。