绿豆蛋白α-淀粉酶抑制肽的制备与鉴定

采用胃-胰蛋白酶水解绿豆蛋白及其分级蛋白,以水解物α-淀粉酶活性抑制率为主要指标,结合水解度、氨基酸组成及分子质量分析其抑制效果差异及原因。结果表明,绿豆蛋白肽对α-淀粉酶活性抑制率最高,为16.51%;与绿豆分级蛋白相比,绿豆蛋白的疏水氨基酸含量和水解度最高,分别为32.68%和6.28%,水解物的肽分子质量最小,均小于20kDa,因此选用绿豆蛋白制备α-淀粉酶抑制肽。然后分离鉴定绿豆蛋白肽,新发现了17条有潜在α-淀粉酶抑制效果的肽。本研究表明绿豆蛋白较其分级蛋白具有更强的α-淀粉酶抑制效果,能够用于降血糖的功能性食品或药物中。

珍珠蚌肉二肽基肽酶-IV抑制肽的制备与分离

目的:以珍珠蚌肉为原料制备对二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase,DPP)-IV具有抑制作用的生物活性肽。方法:利用两步酶解法并优化珍珠蚌肉酶解条件,筛选体外DPP-IV抑制活性较高组分进行超滤膜浓缩,Superdex^(TM) peptide 10/300 GL凝胶柱层析与反相高效液相色谱(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)技术分离纯化出酶解液中的DPP-IV抑制肽,最终通过液相色谱-串联质谱鉴定其氨基酸序列。结果:中性蛋白酶与碱性蛋白酶对珍珠蚌肉均有良好降解效果,经3 kDa超滤膜浓缩后,酶解产物的DPP-IV抑制率可达67.4%。通过凝胶过滤柱和RP-HPLC进一步分离纯化出6个活性较高的肽段,序列分别为FNAPAM、FIPNY、IYNPPTPF、LAMPYP、FFVVMP和LAGMP。进一步,以分子对接的方式分析6个肽段与DPP-IV的相互作用关系。结论:本研究利用珍珠蚌肉制备DPP-IV抑制肽,可为以水产加工副产物为原料制备功能性食品提供理论参考。

红毛藻血管紧张素转化酶抑制肽的筛选及其稳定性评价

本实验以红毛藻为原料,利用酶解法及超滤分级制备获得不同分子质量的肽组分,经高效液相色谱法测定体外血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制活性发现F2组分(800~2000 Da)的ACE抑制率最高;采用液相色谱-串联质谱技术和PEAKS Studio软件的de novo从头测序对F2组分进行氨基酸序列鉴定,并结合分子对接筛选出与ACE稳定结合的6个ACE抑制肽。利用固相合成法制备预测肽并经体外ACE抑制活性验证,发现L1(LVLLFLFGE)的ACE抑制活性最高,半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))为14.22μg/mL。分子对接结果表明,L1对ACE的抑制主要归因于其能够与ACE的活性口袋形成氢键相互作用。最后,探讨温度、pH值、金属离子、光照类型和模拟胃肠道酶系消化对L1稳定性的影响,结果表明L1具有较好的热稳定性和离子强度稳定性,pH>2时抑制活性逐步减弱,紫外光处理会影响其抑制活性,体外模拟胃肠液处理后L1的ACE抑制率虽然显著降低,但仍具有较高ACE抑制活性。

青刺果ACE抑制肽的分离纯化、结构鉴定及其体外活性评价

以具有血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的青刺果蛋白酶解物为研究对象,采用超滤、强阴离子交换层析分离纯化ACE抑制肽,液相色谱-串联质谱鉴定其肽序列。采用傅里叶红外光谱、酶反应抑制剂动力学、MTT试验和分子对接技术解析其二级结构特征、体外活性以及与ACE的结合机制。结果表明,分子质量<3 ku的超滤组分活性较好(IC50=0.380 mg/mL),离子交换层析后以F-a组分活性最好(IC50=0.159 mg/mL)。质谱鉴定出4条肽序列,通过生物信息学分析确定肽PGDVF为潜在的ACE抑制肽[IC50=(0.56±0.1)mmol/L]。二级结构分析表明PGDVF由α-螺旋(20.28%)、β-折叠(6.21%)、β-转角(31.55%)和无规则卷曲(41.85%)构成,其抑制模型为非竞争性抑制,肽质量浓度小于1 mg/mL时,对HepG2细胞无毒性。分子对接显示PGDVF可通过氢键、疏水作用与ACE紧密结合,从而有效抑制ACE活性。研究结果可为青刺果降压肽的开发利用提供参考。

超声辅助酶解制备大米蛋白黄嘌呤氧化酶活性抑制肽的工艺条件优化

以大米蛋白为原料,研究碱性蛋白酶酶解法制备黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase,XOD)活性抑制肽,并对其体外功能活性进行评价。研究了蛋白酶种类、底物质量分数、酶解温度、加酶量、酶解pH、酶解时间对大米蛋白水解度(degree of hydrolysis,DH)及酶解产物对黄嘌呤氧化酶活性抑制率的影响,探讨了不同超声处理方式对酶解过程的影响,通过响应面法对实验条件进行了优化结果为:采用碱性蛋白酶,底物质量分数5%,酶解温度为56℃,加酶量为8000 U/g,酶解pH为10,超声功率70 W,超声酶解60 min,对所制备的大米蛋白黄嘌呤氧化酶活性抑制肽的功能活性进行了评价。在最优条件下其黄嘌呤氧化酶抑制活性的IC_(50)为1.55 mg/mL,ABTS自由基清除作用、羟基自由基清除作用、DPPH自由基清除作用的IC_(50)值分别为0.49、12.48、3.88 mg/mL。

人参α-淀粉酶抑制肽的降血糖作用

通过采用高糖高脂饲料联合腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)构建小鼠2型糖尿病(Type 2 Diabetes,T2DM)模型,建模成功后连续4周给药治疗T2DM小鼠,以小鼠体质量、脏器指数、血糖、血脂、肝脏氧化应激反应、肝脏病理学检验结果作为参考指标,探究人参α-淀粉酶抑制肽对T2DM小鼠的降糖作用。结果表明,阿卡波糖阳性组和人参α-淀粉酶抑制肽各剂量组对小鼠的体重下降情况、高血糖情况均有不同程度的改善作用及调控效果,所以人参α-淀粉酶抑制肽各个剂量对T2DM小鼠具有降糖的效果。经过4周的治疗,高剂量组血糖从建模后的15.43 mmol/L下降至12.10 mmol/L与阿卡波糖阳性组血糖从建模后的15.71 mmol/L下降至10.17 mmol/L结果相近,且两组的小鼠肝脏损伤较轻,说明高剂量的人参α-淀粉酶抑制肽对2型糖尿病引发的肝脏损伤可起到明显的防护效果(P<0.01)。因此,人参α-淀粉酶抑制肽具有降血糖的作用和成为辅助治疗2型糖尿病产品或保健品的潜力。

辣木籽凝乳酶在水牛乳干酪制备中应用及产血管紧张素转化酶抑制肽分析

本实验以辣木籽凝乳酶和水牛乳为原料,以干酪感官评分和蛋白水解度为指标优化干酪加工工艺,解析其水溶性肽组成,进一步挖掘具有血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性的功能性肽及其潜在分子作用机制。结果表明,干酪最佳工艺参数为凝乳pH 5.56、凝乳酶添加量0.14%、凝乳时间32 min、热烫温度80℃,此条件下干酪水解度为12.56%,所得干酪质地均匀有弹性、口感柔软细腻、色泽均匀有光泽且香味浓郁;基于液相色谱-串联质谱在干酪中检出1600种分子质量小于3 k Da的蛋白肽段,活性预测表明613条肽段具有较好的生物活性,主要来源于β-酪蛋白和α_(S1)-酪蛋白,其中具有ACE抑制活性的肽段占比达到37.29%;通过活性肽数据库比对结合生物信息学手段筛选出兼具多重活性的已知ACE抑制肽和新型ACE抑制肽各4条,分子对接分析进一步表明4条新型肽段均可以与ACE有效结合,其中2条肽段FGGL、FSPL分别与S2活性口袋结合紧密而显示较强的ACE抑制活性。本研究可为新型植物凝乳酶资源及特色水牛乳干酪的开发利用提供科学依据。

酶解法制备核桃谷蛋白-1 ACE抑制肽的工艺优化

为获得优质的核桃蛋白血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备原料及优化其制备工艺,采用连续提取法从脱脂核桃粕中依次分离出清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-25种组分蛋白,测定5种组分蛋白的占比及ACE抑制率,以ACE抑制率最大的组分蛋白作为原料采用酶解法制备ACE抑制肽,在筛选出最适酶解用酶基础上,采用单因素试验与响应面试验优化酶解制备核桃蛋白ACE抑制肽的工艺。结果表明:5种组分蛋白中谷蛋白-1占比仅次于谷蛋白-2,且其ACE抑制率最高,以核桃谷蛋白-1为原料,在筛选出胃蛋白酶作为酶解用酶基础上,经工艺优化得到最优的酶解法制备核桃谷蛋白-1 ACE抑制肽的工艺条件为酶解温度46℃、酶解时间6 h、酶用量4.2%(以底物质量计)、酶解pH 1.6,在该条件下所得核桃谷蛋白-1酶解液的ACE抑制率为(50.08±2.34)%。因此,核桃谷蛋白-1经胃蛋白酶酶解可生产ACE抑制活性较高的核桃多肽。

大河乌猪火腿中新型α-葡萄糖苷酶抑制肽的分离、鉴定及活性研究

大河乌猪火腿在发酵和后熟过程中蛋白质降解可产生丰富的生物活性肽。为探究大河乌猪火腿中是否存在α-葡萄糖苷酶抑制肽及其活性,以大河乌猪火腿为研究对象,通过超滤分离方法制备了不同分子质量的火腿肽;以α-葡萄糖苷酶抑制率为指标,采用肽组学结合生物信息学分析方法对火腿肽进行鉴定、筛选和活性研究。结果表明:分子质量小于3 kDa的大河乌猪火腿肽具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。从大河乌猪火腿中共鉴定出143条主要来源于肌球蛋白、肌钙蛋白和β-烯醇化酶的肽序列,进一步筛选出的肽段IEEALGDK具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性(IC_(50)值为1.42 mg/mL)。BIOPE P-UWM数据库检索结果显示,肽段IEEALGDK为新型的生物活性肽。肽的稳定性研究表明,肽段IEEALGDK具有较好的热稳定性、耐酸碱性和胃肠道消化稳定性。分子对接结果显示,肽段IEEALGDK主要通过氢键和疏水相互作用占据α-葡萄糖苷酶的活性残基位点Arg594、Arg727、Arg799和Arg467发挥活性作用。大河乌猪火腿的肽段IEEALGDK为新型生物活性肽,具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,研究旨在为大河乌猪火腿肽的进一步开发和利用提供理论参考。

超声辅助酶解法制备小麦ACE抑制肽及其稳定性研究

以谷朊粉为原料,采用超声辅助酶解法制备小麦血管紧张素转换酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)抑制肽,并以该抑制肽对ACE的抑制率为主要评价指标,以谷朊粉的水解度为次要评价指标,通过单因素试验结合响应面法对制备工艺进行优化,并研究该抑制肽的稳定性。结果表明:碱性蛋白酶是适宜酶解谷朊粉制备小麦ACE抑制肽的蛋白酶。最佳超声辅助酶解法制备小麦ACE抑制肽的条件为超声时间17 min、超声功率300 W、酶解温度60℃、酶解时间2.7 h、酶用量3600 U/g和谷朊粉质量分数5.1%,在此条件下,所制备的小麦ACE抑制肽对ACE的抑制率为72.90%,疏水性氨基酸含量为29.37 g/100 g。当该抑制肽的相对分子质量<3 kDa时,具有较好的强酸环境稳定性和热稳定性,在一定浓度K^(+)、Mg^(2+)环境中的稳定性也较好,且经体外模拟消化后仍能保持原活性的79.26%。因此,超声辅助酶解法是制备小麦ACE抑制肽的有效方法。

料酒糟源新ACE抑制肽的分离纯化、活性评价与结构解析

传统料酒以大米为原料发酵生产,料酒糟作为料酒酿造的主要产物,其中含有大量的营养物质。本文以料酒糟作为原料,通过一次醇沉分离,一次制备液相色谱分离和一次分析液相分离后,得到两个高活性ACE抑制肽单体F1和F2。在相同浓度下,单体F1、F2的ACE抑制率分别高于市售降压肽产品约17%和14%。后续,利用LTQ Orbitrap Velos Pro质谱仪对两个单体的结构进行解析,结合Uniprot数据库搜索,鉴定出了多肽的序列分别为F1:LIIPQH,F2:IFSGFNNELLS。其中,F1为已报道过的降压肽序列,而F2为本实验首次报道的降压肽序列。研究为酒糟的高值化加工利用提供了理论依据,也为食源性降压肽提供了新证据。

带鱼ACE抑制肽的酶法制备及分离纯化

为有效利用带鱼资源,制备优质的血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽,以ACE抑制率和水解度为评价指标,筛选出制备带鱼ACE抑制肽的最适蛋白酶。通过单因素和响应面优化蛋白酶的酶解工艺条件,分析优化后的带鱼ACE抑制肽的分子质量和氨基酸组成。采用超滤和Prep-HPLC对ACE抑制肽分离纯化,获得具有最高ACE抑制率的活性组分。结果表明,复合蛋白酶是制备带鱼ACE抑制肽的最佳蛋白酶,优化后的最佳酶解参数为水解时间3 h,温度45℃,加酶量5000 U/g,p H 7.0。在此条件下带鱼ACE抑制肽的理论抑制率为80.15%,实际值为80.43%,IC50为0.33 mg/mL,相对分子质量主要分布在1000 u以下。带鱼ACE抑制肽的氨基酸组成模式合理,鲜味氨基酸和疏水性氨基酸含量较高。经Prep-HPLC分离得到6个组分,其中组分5的ACE抑制活性最高,IC_(50)为0.11 mg/mL。本研究为带鱼ACE抑制肽的制备提供了技术支持。

活性炭与树脂对芝麻ACE抑制肽脱苦的工艺优化及其性能比较

为改善芝麻ACE抑制肽的味道,分别采用活性炭与树脂对芝麻ACE抑制肽进行脱苦,以脱苦率、多肽损失率为评价指标,采用单因素实验和正交实验对两种脱苦工艺条件进行优化,并比较两种脱苦方法对芝麻ACE抑制肽味觉特性、活性及氨基酸组成的影响,以确定最适宜的脱苦方法。结果表明:两种方法均能使芝麻ACE抑制肽液苦味降至无法察觉,活性炭脱苦最佳工艺条件为活性炭2号添加量6%、芝麻ACE抑制肽液质量浓度10 g/100 mL、吸附温度55℃、吸附时间15 min,在此条件下脱苦率与多肽损失率分别为(96.46±0.57)%和(29.02±0.19)%(电子舌测定苦味为-0.61±0.02);AB-8大孔吸附树脂脱苦最佳工艺条件为树脂添加量12.5%、pH 7、吸附温度35℃、吸附时间15 min、芝麻ACE抑制肽液质量浓度10 g/100 mL,在此条件下脱苦率与多肽损失率分别为(95.21±0.93)%和(12.11±0.19)%(苦味为-0.03±0.08);AB-8大孔吸附树脂脱苦的芝麻ACE抑制肽活性显著强于活性炭脱苦的,这与不同脱苦方法引起的多肽组成差异有关。综合考虑,AB-8大孔吸附树脂可以更好地降低芝麻ACE抑制肽中苦味氨基酸含量,适合用于芝麻ACE抑制肽的脱苦。

如何提高食源性ACE抑制肽活性的探讨

就如何提高食源性ACE抑制肽的活性,分别对原料、蛋白酶和分离纯化方法等几方面的选择作了探讨。

固定化酶ESM-BAP酶解制备甜杏仁ACE抑制肽及其工艺优化

为优化固定化酶酶解甜杏仁蛋白制备ACE抑制肽的工艺,采用交联法固定蛋壳膜(ESM)和碱性蛋白酶(BAP)后对甜杏仁蛋白进行酶解,通过单因素试验和响应面分析法对酶解条件进行优化。得到的最佳酶解工艺参数为加酶量7200 U/g,酶解时间4.1 h,酶解温度56.1℃,pH值10.7,在此条件下甜杏仁的ACE抑制率可达65.14%。该条件适合甜杏仁蛋白ACE抑制肽的制备,为实际生产和应用提供理论依据。

杏仁蛋白源ACE抑制肽的研究进展

研究发现杏仁副产品中蛋白质含量极为丰富,功能活性物质种类齐全,其中也包括ACE抑制肽。介绍了杏仁的营养成分,ACE抑制肽的降血压机理,阐述了杏仁ACE抑制肽制备方法与分离纯化方法,介绍了几种杏仁ACE抑制肽的结构鉴定方法和构效关系研究、分析检测方法,并对以后杏仁ACE抑制肽的研究给出展望。

诱生型一氧化氮合酶特异性抑制肽的制备

目的 :通过噬菌体展示技术筛选 i NOS特异性抑制肽。方法 :将 i NOS FAD结合区及其附近序列的基因片段装入 p ET-2 8a( + ) ,在大肠杆菌 BL2 1 中表达 ,His.Bind TM亲和层析柱纯化目的蛋白 ,使用纯化蛋白筛选Ph.D.-1 2 TM噬菌体库 ,筛选 i NOS活性抑制作用较高的噬菌体克隆 ,测序并合成其中具有一致序列的短肽。结果 :得到具有较高表达量的目的蛋白 ,经 His.Bind TM柱亲和层析纯化后纯度大于 95 % ,以纯化蛋白筛选 Ph.D.-1 2 TM噬菌体库 ,经 4轮筛选获得 1 0株 i NOS活性抑制作用较高的噬菌体克隆 ,测序发现其中 5株序列完全相同 ,合成该 1 2肽 ,初步研究表明其对 i NOS表现为高浓度抑制 ,低浓度兴奋的作用 ,而对 n NOS及 e NOS则没有影响。结论 :以 i NOSFAD片段蛋白为靶蛋白筛选得到的克隆对 i NOS活性具有特异性影响 ,可根据这些特征设计合成小分子前导药物 。

超声波预处理对燕麦蛋白制备ACE抑制肽的影响

利用燕麦蛋白制备ACE抑制肽时先利用超声波对燕麦蛋白原料进行预处理研究。以ACE抑制活性和水解度为指标,考察了超声波功率、处理时间、超声波工作/间歇时间对燕麦蛋白预处理效果的影响。结果表明,超声波预处理的最佳工艺参数为:超声波功率500 W,处理时间20 min,超声波工作时间2 s、间歇时间2 s,该条件下酶解产物对ACE的半抑制浓度IC50值从0.533 mg/mL降到0.299 mg/mL,酶解时间由常规酶解的90 min缩短到60 min;超声波预处理参数变化虽然对水解度影响不显著,但对ACE抑制活性的影响显著;验证了超声波引起的蛋白疏水性增加是导致酶解产物ACE抑制活性显著改善的重要原因之一。

利用牡蛎制备ACE抑制肽的工艺优化

运用正交试验和响应面法优化牡蛎血管紧张素转换酶(angiotensin-Ⅰconverting enzyme,ACE)抑制肽的分步酶解制备工艺。采用复合蛋白酶和碱性蛋白酶对牡蛎进行分步酶解,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析和ACE抑制率为考核指标优化工艺参数。结果表明,第1步复合蛋白酶最佳工艺参数为:料液比1∶4、加酶量1.2%、pH 7.0、反应温度50℃、酶解时间1 h;第2步碱性蛋白酶最佳工艺参数为:加酶量0.42%、pH 8.3、反应温度53℃、酶解时间73 min。凝胶过滤色谱法测得牡蛎酶解液分子质量在3 000 D以下小肽所占比例为99.72%,其ACE抑制活性IC50为0.8 mg/mL。同时,氨基酸组成分析表明,牡蛎肽中Glu含量最高,Cys含量最低;必需氨基酸和疏水性氨基酸含量分别占总氨基酸的36.6%和37.2%。本研究制备的低分子质量、高ACE抑制活性牡蛎肽,可为牡蛎资源的开发利用提供理论参考。

秋刀鱼制备黄嘌呤氧化酶抑制肽的工艺优化

为探讨秋刀鱼制备黄嘌呤氧化酶(XOD,xanthine oxidase)抑制肽的最佳工艺,该文以氮回收率和体外XOD抑制活性为指标,首先通过单因素试验确定中性蛋白酶和胰酶为水解秋刀鱼制备XOD抑制肽的最佳蛋白酶。在此基础上,采用响应面分析法研究加酶量、酶解时间和中性蛋白酶所占比例对酶解氮回收率及酶解产物XOD抑制活性的影响,进一步优化并最终确定了水解秋刀鱼制备XOD抑制肽的最优工艺:料液比1∶2(g/g),总加酶量0.3%(中性蛋白酶∶胰酶质量比=6∶4),在p H值7.0和55℃条件下酶解6 h,其理论氮回收率和酶解产物XOD抑制率分别为72.69%和30.32%,对应实际值分别为72.03%和30.96%,预测模型可靠性高,可用于秋刀鱼XOD抑制肽的酶法制备,为工业化利用秋刀鱼生产降尿酸肽提供一定的理论和技术指导。