旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因的表达与抗原性分析

目的 对旋毛虫新生幼虫p460 0 0抗原基因进行原核表达并检测重组抗原的抗原性。 方法 利用聚合酶链反应 (PCR)扩增目的基因 ,克隆到原核表达载体 pET 2 8a ,构建重组表达质粒 ,经酶切及测序鉴定后转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 ) ,以异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)、酶联免疫吸附测定 (ELISA)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)分析表达产物。 结果 SDS PAGE结果显示表达产物的分子量约为Mr 480 0 0 ,与理论值相符。ELISA和Westernblotting结果表明 ,重组蛋白可被旋毛虫感染的猪血清和兔抗重组蛋白血清识别 ;兔抗重组蛋白血清可识别旋毛虫新生幼虫抗原Mr 460 0 0蛋白。 结论 成功表达了旋毛虫新生幼虫p460 0 0抗原基因 ,重组抗原具有良好的抗原性。

猪流行性腹泻病毒N基因的表达及抗原性分析

为深入了解仔猪腹泻的病因,本研究在不同发病猪场采集了115份临床样品,通过RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)进行检测,结果显示总阳性率为81.7%。进一步从部分样品中对PEDV的N基因进行克隆和序列分析,结果显示采集的临床样品中各分离株之间的氨基酸同源性高达99%以上,与代表性病毒株CV777的氨基酸同源性为97.4%～98.1%,表明目前流行的PEDV其N基因仍然相对保守的。同时,构建了重组表达载体pGEX-N,经诱导表达显示该重组蛋白呈可溶性表达,重组蛋白大小约为81 ku,western blot分析结果表明该重组蛋白能够被PEDV阳性猪血清特异性识别。将纯化后的重组N蛋白作为包被抗原,对20份已知背景的临床猪血清抗体进行ELISA检测,结果显示有9份血清为抗体阳性,11份血清呈抗体阴性,与应用RT-PCR方法鉴定抗原的结果符合率为85%。本研究表达的重组N蛋白具有良好的抗原性,可以将其作为PEDV血清学诊断的候选抗原。

日本血吸虫虫卵中毛蚴抗原的融合表达及抗原性分析

目的重组表达制备日本血吸虫虫卵中毛蚴抗原(SjMP10)。方法根据日本血吸虫虫卵中毛蚴抗原SjMP10分子的读框序列设计合成1对引物,扩增SjMP10DNA片段并克隆到表达载体pGEX-4T-3中。转化BL21(DE3)后,诱导表达谷胱甘肽转移酶-虫卵中毛蚴抗原10(GST-SjMP10)融合蛋白。采用洗脱法制备GST-SjMP10融合蛋白,应用免疫印迹法(Westernblotting)和淋巴细胞增殖试验进行重组蛋白的抗原性分析。结果SjMP10基因克隆到表达质粒pGEX-4T-3后,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导能表达出Mr39000的GST-SjMP10融合蛋白,经电洗脱法纯化的上述重组融合蛋白可被血吸虫感染兔血清所识别,并能刺激血吸虫感染鼠脾淋巴细胞增殖。结论日本血吸虫虫卵中毛蚴抗原SjMP10融合表达获得成功。

H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析

采用RT～PCR技术对4株H3N2亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增，将获得的PCR产物分别与pMD18-T克隆载体连接，进行序列测定。测序结果显示，4个毒株均含有完整的开放阅读框，并且均未发现核苷酸插入或缺失现象；分离毒株间核苷酸同源性为99．4％～99．7％，氨基酸同源性为98．2％～99．3％。同源性分析表明，4个毒株与2003年的猪流感病毒广东分离株有很高同源性（均在99％以上），说明近段时间我国H3N2亚型的猪流感病毒变异不大，重组的频率不是很高，同时又与人流感病毒香港分离株有较高的同源性（均为99．4％）。交叉血凝抑制试验显示，S3株与其他3毒株抗原性差异明显。鉴于猪在流感病毒传播与复制间的特殊地位，应密切监测猪流感。

嗜水气单胞菌重组Aer毒素的纯化和抗原性分析

对原核表达的重组嗜水气单胞菌Aer毒素进行初步纯化,比较了它与天然Aer毒素的抗原性,为建立检测该毒素的免疫学方法奠定了基础。将原核表达的重组Aer毒素经SDS-PAGE后,切下目的蛋白,利用电洗脱法将蛋白洗脱出来,后经透析、PEG8000浓缩、定量,对獭兔进行免疫,采集血清,提纯IgG,在W estern b lotting试验中可与天然Aer毒素起反应,说明,体外表达的重组Aer毒素保留了天然Aer毒素所具有的抗原性。同时,将嗜水气单胞菌AHCS02菌接种于兔鲜血平板,30℃、培养15 h后,将具有β-溶血的单菌落于LB液体培养基中培养后,用饱和硫酸铵法提取上清液中的天然Aer毒素,用甲醛脱毒后,以同样免疫方法免疫獭兔,免疫结束后,采集血清提取IgG,在W estern b lotting试验中,可以检测到重组Aer毒素。试验说明:原核表达的重组Aer毒素和天然Aer毒素诱导獭兔产生的血清IgG抗体可以互相识别重组Aer毒素和天然Aer毒素,重组Aer毒素和天然Aer毒素有相似的抗原性。

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻（BVD）鉴别诊断ELISA方法，采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段，分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上，获得了重组质粒pGEX-6PI-p80A、pGEX-6PI-p80B和pGEX-6P1-p80C，将其分别转化感受态茵Rosetta和BL21，经1．0mmol／L的IPTG诱导，分别得到大小为60、47和51ku的目的蛋白。经Western-blotting分析，3个目的蛋白中，只有p80B（289～477aa）基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应，表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。

弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析

目的 构建原核重组表达质粒pET2 3a SAG2 ,并在大肠埃希菌中实现高效表达 ,以及检测表达产物的抗原性。 方法 PCR扩增SAG2编码基因目的片段 ,琼脂糖凝胶电泳回收纯化 ,克隆至 pMD18 T载体 ,转化大肠埃希菌DH5α。测序后亚克隆至表达质粒载体 pET2 3a ,构建重组表达质粒 pET2 3a SAG2 ,转化大肠埃希菌DH5α。筛选阳性克隆 ,经限制性酶切分析鉴定后 ,转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 ) ,以异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)与免疫印迹分析表达产物。 结果 PCR扩增出约 5 0 0bp的SAG2编码基因目的片段 ,与预期片段大小相符 ,经测序鉴定无基因突变 ;所构建的 pET2 3a SAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定 ,与预期结果一致 ;含有pET2 3a SAG2重组质粒的大肠埃希菌BL2 1(DE3 )诱导后得到了高效表达 ,SDS PAGE显示表达产物约Mr 190 0 0 ;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性。 结论 成功构建了pET2 3a SAG2表达质粒 ,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达 ;表达产物具有良好的抗原性。

猪细小病毒NJ-1株VP2基因克隆与抗原性分析

参考Gen Bank公布的NADL-2株序列,设计出1对引物,并利用该引物扩增了猪细小病毒NJ-1株VP2主要抗原基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体上,测序获得882 bp核苷酸序列,并推导出其氨基酸序列,共编码294aa,与NADL-2株相应的序列进行比较分析,两者核苷酸同源性为99.2%,氨基酸同源性为99%;应用DNAStar软件对氨基酸的抗原表位进行了预测,共有9个抗原表位,分别在氨基酸N端的第34-40,62-70,88-92,137-157,167-181,189-200,206-219,258-272和280-294区段,此序列具有较好的免疫原性.

副结核分支杆菌Hed蛋白的抗原性分析及在间接ELISA中的应用

从副结核分支杆菌K-10菌株克隆出840 bp的hed基因片段,插入原核表达载体pET-32a(+),转化至Escherichia coliBL21(DE3),在0.8 mmol.L-1 IPTG诱导下进行表达,纯化重组蛋白,将其进行Western-blot分析、小鼠免疫试验,包被ELISA板,建立间接ELISA方法。结果显示:重组蛋白具有良好的抗原性,方阵滴定法确定了间接ELISA方法的抗血清最佳稀释度(100倍)和抗原包被浓度(4.4μg.mL-1),该方法具有较好的特异性和敏感性。

鸡传染性支气管炎病毒Holte株S1基因在昆虫杆状病毒系统的表达及其抗原性分析

为真核表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白并鉴定其抗原性,本研究采用RT-PCR方法扩增出IBV Holte株S1基因,并将其克隆于昆虫杆状病毒转移载体pFastBacHT中,通过大肠杆菌中同源重组构建重组杆粒Bacmid-S1,将重组杆粒转染至Sf9细胞中,获得含S1基因的重组杆状病毒。将该重组杆状病毒感染Sf9细胞进行表达,经间接免疫荧光、SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明:IBV Holte株的S1蛋白能够在Sf9中以可溶形式表达,蛋白大小约为64 ku,该蛋白具有天然蛋白的抗原性。本研究为生产检测IB的诊断试剂和研制新型IB重组亚单位疫苗奠定基础。

羊痘病毒3个结构蛋白的克隆与抗原性分析

为研究羊痘病毒结构蛋白的功能,本研究将羊痘病毒的ORF57、ORF95和ORF117分别克隆至pGEX4T-1原核表达载体后转染到大肠杆菌中。重组表达菌经1 mmol/L的IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,结果显示3个重组蛋白均在原核细胞中获得有效表达。表达产物经western blot分析,羊痘病毒特异性血清只能识别融合蛋白ORF57和ORF95,不能识别ORF117。本研究为重组诊断抗原的筛选和亚单位疫苗的研制奠定了基础。

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

采用PCR方法,以牛疱疹病毒Ⅰ型基因组DNA为模板扩增gB基因,克隆至pGEM-T载体。将以克隆质粒pGEM-T-gB为模板扩增的gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段分别连接至原核表达载体pET32a。获得的重组质粒分别转化感受态细胞BL21(DE3),在IPTG诱导下表达。经SDS-PAGE鉴定,gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中以融合蛋白形式获得了表达。以磁化组氨酸蛋白纯化系统对融合蛋白纯化后,Western-blotting和ELISA分析结果表明,这些融合蛋白均与BHV-1标准阳性血清反应,可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎ELISA检测方法的建立。

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株S2蛋白的原核表达及抗原性分析

本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段(S2A),将其克隆后插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1∶32000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。

猪细小病毒HN-3株VP2基因克隆与抗原性分析

参考GenBank公布的NADL-2株序列，设计出1对引物。利用该引物扩增了猪细小病毒HN-3株VP2主要抗原基因，将其克隆到pGEM-TEasy载体上；测序获得1438bp核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。共编码475氨基酸，与NADL-2株相应的序列进行比较分析，两者核苷酸同源性为99．4％，氨基酸同源性为99．3％。应用DNAStar软件对氨基酸的抗原表位进行了预测，共有11个抗原表位，分别在氨基酸N端的11～24，81～108，121～135，139～148，150～172，221～239，241～259，316～342，344～352，390～405和426～439区段，此序列具有较好的免疫原性。

猪细小病毒Vaccine株VP2基因克隆与抗原性分析

[目的]为研制和筛选猪细小病毒核酸疫苗提供依据。[方法]对猪细小病毒Vaccine株VP2进行克隆、测序以及抗原性分析。[结果]参考GenBank公布的NADL-2株序列，设计出1对引物，并利用该引物扩增了猪细小病毒vaccine株VP2主要抗原基因，将其克隆到pGEM-T Easv载体上，测序获得656 bp核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列，共编码218氨基酸，与NADL-2株相应的序列进行比较分析，比NADL-2毒株缺失781 bp，两者核苷酸同源性为98，9％，氨基酸同源性为97，2％；应用DNAStar软件对氨基酸的抗原表位进行了预测，共有7个抗原表位，分别在氨基酸N端的第10～18、34～39、94～103、121～126、137～144、156～165和209～214区段，此序列具有较好的免疫原性、[结论]该研究为发展特异性和敏感性诊断系统和研制疫苗提供了有力的技术依据，为研究蛋白质特性分析提供了理论依据。

副溶血弧菌食物中毒菌株的质粒和抗原性分析

副溶血弧菌食物中毒菌株的质粒和抗原性分析王豫林刘衡川１安永群刘晓朋（重庆市卫生防疫站，６３００４２）１９９２～１９９３年，重庆市区发生两起由副溶血弧菌污染食物引起的食物中毒。在对两起食物中毒检品检验中，共分离到副溶血弧菌１０株，其中６株来自于病人粪便...

空肠弯曲菌FliD蛋白的原核表达与抗原性分析

为获得空肠弯曲菌FliD蛋白并分析其抗原性,研究扩增空肠弯曲菌标准菌株11168 fliD基因并构建原核表达质粒pColdⅠ-fliD和pGEX-6p-1-fliD,将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化FliD重组蛋白;纯化后的His-FliD蛋白免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后收集小鼠血清,间接ELISA结果显示小鼠多抗血清效价为25 600,Westernblot结果显示多抗血清能够与重组蛋白His-FliD特异性结合。研究成功表达空肠弯曲菌FliD蛋白并初步分析其抗原性,为进一步研究空肠弯曲菌与宿主间相互作用及FliD蛋白作为候选亚单位疫苗奠定理论基础。

1997/1998北京青年人群中6株甲1型流感流行株(H_1N_1)分离及抗原性分析

１９９７年１０月～１９９８年３月，从北京青年中分离到６株Ｈ１Ｎ１流感亚型毒株，经国家流感中心鉴定确认。将６株中的５株与１９９４～１９９７年３株（Ｈ１Ｎ１）国家代表株作血凝抑制交叉试验，５株的抗原性明显不同于Ａ／桂防／１０／９４，抗原比均≥２。５株中的４株抗原性明显不同于Ａ／京防／２５／９６；５株中的２株抗原性明显不同于Ａ／京防／５３／９７。将６株Ｈ１Ｎ１流行株送日本ＷＨＯ流感协作中心作多株Ｈ１Ｎ１毒株抗原性初步分析，６株抗原性既不同于Ａ／日本山形／１２０／８６和Ａ／日本山形／３２／８９，也不同于国际代表株德国的Ａ／拜恩州／０７／９５和南非的Ａ／约翰内斯堡／８２／９６。表明Ｈ１Ｎ１流感亚型毒株自１９９４年以来抗原变异较大。

柔嫩艾美球虫pEtK2抗原基因的克隆表达及其表达产物的抗原性分析

应用RT-PCR技术从纯化的柔嫩艾美球虫孢子化卵囊子孢子中克隆了pEtK2抗原基因,并进行了原核表达和抗原性分析,同时用MTT法检测了重组蛋白对球虫耐过鸡淋巴细胞的刺激效果。结果显示,克隆的pEtK2基因全长1464 bp,具有一个完整的开放阅读框,编码487个氨基酸,具有多个T细胞表位。重组蛋白诱导5 h后表达量最多,分子质量约55 ku,占菌体总蛋白的32%。纯化的重组蛋白能够刺激球虫耐过鸡T淋巴细胞增殖,可作为球虫基因工程疫苗或DNA疫苗的候选基因。

北京流感暴发流行前后流行株的分离和抗原性分析

目的 :为获得 1998年 12月北京流感暴发前和后的流行株 ,并了解流行株的抗原变异幅度。方法 :应用常规法进行流感病毒分离 ,应用血凝抑制免疫交叉试验 (HI) ,以 6株国际参考株和 2株国家代表株 ,对流行株作抗原性分析。结果 :共获甲 3亚型 (H3N2 )流行株 15株 ,它们的抗原性与A3/南非 / 1147/ 96、A3/悉尼 / 0 5/ 97、A3/日本 / 8/ 98、A3/智利 / 3792 / 98、A3/阿根廷 /4 13/ 98均有明显差异。它们与国家代表株A3/山东 / 9/ 93的抗原性也有差异 ,但与A3/南昌 /933/ 95和A3/汉防 / 359/ 95两株的抗原性无明显差异。结论 :所分离到的 15株均为甲 3亚型流感毒株 (H3N2 ) ,是北京 1998年的流行优势株 ;同时也证实 1998年 12月北京流感暴发流行的病毒主要也是H3N2亚型毒株。它们的抗原性与国际参考株 :南非、悉尼、日本、智利、阿根廷有明显差异。应用国际流感疫苗效果不佳的重要原因在于甲 3亚型流行株与A3/悉尼 / 0 5/