抗性湿地松体细胞胚的发育、成熟及萌发

为加快抗松针褐斑病湿地松体细胞胚胎发生技术的产业化应用进程,本文研究了肌醇浓度、脱落酸(ABA)及其添加方式、基本培养基、聚乙二醇(PEG-6000)浓度、琼脂糖种类及浓度、活性炭浓度、液体悬浮培养等因素对抗性湿地松体细胞胚的发育、成熟及萌发的影响。结果表明:添加8 g/L肌醇较适宜,过高浓度的肌醇则不利于湿地松体细胞胚发育;ABA可以采用高压灭菌;基本培养基、ABA、PEG-6000互作对湿地松体细胞胚的成熟影响很大,基本培养基以LP为最佳,ABA的最适浓度为10m g/L,PEG-6000以添加25、50 g/L为宜;在湿地松体细胞胚的成熟培养过程中,PEG-6000的浓度不能高于100 g/L;在湿地松体细胞胚的成熟培养基中,添加60 g/L蔗糖最合适;湿地松体细胞胚的成熟培养基中添加0.5 g/L或1 g/L的活性炭较适宜;培养基状态对体细胞胚的高频率诱导具有一定的影响,悬浮培养以100 mL三角瓶装培养液30 mL、摇床转速130 r/min为宜,液体转固体时吸取培养液1 mL为宜;未建立成熟的体细胞胚发生体系前,以采用固体培养为佳。最佳成熟培养基、激素及部分添加物组合为LP+10 mg/L ABA+50 g/L PEG-6000+60 g/L蔗糖+1.0 g/L活性炭。

抗性湿地松胚性愈伤组织的维持与增殖

将抗松针褐斑病湿地松愈伤组织转接至不同培养基及多种添加物中,开展了不同愈伤组织类型、不同浓度肌醇与麦芽糖、不同2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、激动素(KT)浓度组合、添加维生素(VC)、添加硝酸银(AgNO3)、不同基因型胚性愈伤组织、多次继代后胚性愈伤组织与培养基的适应性等研究。结果表明:湿地松不同愈伤组织类型在增殖过程中成活率及增殖状况都存在很大差异;当麦芽糖浓度为15 g/L,肌醇浓度为1000 mg/L时最有利于胚性胚柄细胞团(ESM)的增殖;高浓度的2,4-D、6-BA不利于湿地松胚性愈伤组织的增殖,最佳增殖培养基及激素组合DCR+1.0 mg/LNAA+0.32 mg/L6-BA+0.31 mg/LKT、DCR+1.0 mg/LNAA(萘乙酸)+1.55 mg/L6-BA+0.064 mg/LKT;添加维生素(VC)浓度为10 mg/L时,对湿地松愈伤的褐化有明显抑制作用,但浓度过高则会增加愈伤的褐化率;添加3.4 mg/L的AgNO3促进了湿地松胚性愈伤组织的增殖;湿地松不同家系不同基因型间增殖能力差异显著,20#2和10#1增殖很快明显优于10#4、10#5和20#3;湿地松胚性胚柄细胞团在同样的培养基上多次继代后,愈伤组织增殖变慢,中心褐化较多,有些还会出现水渍状,可能导致其胚性丧失。湿地松不同愈伤组织类型在增殖过程中,成活率及增殖状况都存在很大的差异。Ⅲ型、Ⅳ型愈伤可能同时含有胚性愈伤和非胚性愈伤,在培养基条件适合的情况下胚性愈伤转化成胚性胚柄细胞团,但是转化频率极低。而Ⅴ型、Ⅵ型愈伤在后期培养过程中基本褐化死亡。

抗松针褐斑病湿地松体细胞胚胎发生与植株再生

为将抗松针褐斑病湿地松(Pinus elliottii Engelm.)良种快速推广,以未成熟合子胚为外植体,研究了合子胚发育阶段对胚性愈伤组织诱导以及ABA与PEG8000对体细胞胚成熟的影响,并探讨了体细胞胚质量及干化条件对体细胞胚萌发的影响。结果表明:发育至2~4阶段的合子胚最利于胚性愈伤组织的诱导,LP+16 mg·L^(-1)ABA+180 g·L^(-1)PEG8000+2 g·L^(-1)AC适合于体细胞胚的成熟,高质量体细胞胚经"滤纸容器法"干化2周后萌发,萌发的体细胞胚于1/4WPM+0.3 mg·L^(-1)NAA+1 mg·L^(-1)IBA上培养70 d左右根部发育,转入1/2WPM中,30 d左右侧根产生发育完整的再生植株。

抗松针褐斑病湿地松组培苗生根条件的优化

以抗松针褐斑病湿地松组培苗为研究材料,对影响组培苗不定根发生的条件进行优化。结果表明:在含4.0 mg/L IBA和0.07 mg/L NAA的WPM培养基中添加0.4 mg/L多效唑对湿地松组培苗不定根的形成和再生植株的成活率有促进作用;湿地松组培苗不定根原基形成后,出瓶移至装有蛭石的穴盘中,有利于不定根的表达,且根茎连接非常好,植株成活率高达85%;基因型对苗的成活率有决定性的影响,不同家系及同一家系不同无性系间移栽成活率差异较大。

抗松针褐斑病湿地松子代组培苗瓶内菌根化研究

[目的]研究抗松针褐斑病湿地松子代组培苗瓶内菌根化。[方法]对湿地松再生植株离体条件下菌根的形成进行了研究,并对再生植株的生长状况进行了观察。[结果]菌根真菌培养基质和接种量对离体条件下菌根的形成有较大影响。湿地松丛生芽诱导出根原基后,以转接到珍珠岩为培养基质接种彩色豆马勃为最佳,有利于菌根的形成;在珍珠岩接种彩色豆马勃为2个菌块时,菌根化率高达84.4%,形成的二叉分枝状短根最多,平均每条主根上形成12.49条;菌根的形成提高了再生植株的驯化移栽成活率,菌根化再生植株在植物生长室长势良好,根系发达。[结论]为提高抗松针褐斑病湿地松组培再生植株的成活率提供了依据。

抗松针褐斑病湿地松体细胞的悬浮培养

为了获得大量的抗松针褐斑病胚性愈伤组织试验材料,完善抗性湿地松体胚发生技术,以抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织为材料,探究抗性湿地松体细胞悬浮培养的较适条件,建立抗性湿地松体细胞的悬浮培养体系。研究结果显示:悬浮培养的胚性细胞较分散,利于胚性细胞充分获取营养,可产成熟体胚153个/g,而固体培养的胚性细胞产胚仅为56个/g。抗性湿地松悬浮细胞的较佳培养周期为7-9 d,较适宜的基本培养基为1/4 DCR,麦芽糖添加量为15 g/L,NAA添加量为0.5 mg/L;较佳的继代添加比为1/2;同时研究还发现不同基因型的抗性湿地松悬浮细胞在相同的培养条件下,细胞活力有一定差异,其中无性系13#-9活力最佳。

Study on the Mycorrhizal Formation in the Offspring Tissue Culture Seedling Bottle of Pinus elliottii with Lecanosticta acicola Resistance

[Objective] The research aimed to study the mycorrhizal formation in the offspring tissue culture seedling bottle of Pinus elliottii with Lecanosticta acicola resistance.[Method] The mycorrhizal formation of Pinus elliottii regenerated plant in vitro was studied,and the growth condition of regenerated plant was observed.[Result] The culture substrate and the inoculation amount of mycorrhizal fungi had the big influence on the mycorrhizal formation in vitro.After the root primordia were induced by Pinus elliottii caespitose shoots,it was best to transplant in the perlite substrate and inoculate Pisolithus tinctorius,which was favorable for the mycorrhizal formation.When the two blocks of Pisolithus tinctorius were inoculated in the perlite medium,the mycorrhizal formation rate reached 84.4%.The dichotomous branching short root was the most,and 12.49 roots were formed in every main root.The mycorrhizal formation improved the survival rate of regenerated plant domestication transplantation.The mycorrhizal regenerated plant grew well in the phytotron,and the root system was developed.[Conclusion] The research provided the basis for improving the survival rate of Pinus elliottii tissue culture regenerated plant with Lecanosticta acicola resistance.