藏獒IFN-γ基因在毕赤酵母中的表达与抗病毒活性分析

采用毕赤酵母表达系统表达藏獒γ-干扰素(Tibetan mastiff interferon gamma,TmIFN-γ)并分析其生物活性,为抗病毒生物制品的研发与临床应用奠定基础。将构建的TmIFN-γ的真核表达质粒pPIC9k-TmIFN-γ转化至毕赤酵母GS115细胞,用不同浓度的G418筛选得到多拷贝重组菌株;利用甲醇进行诱导表达,以镍层析柱纯化目的蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定;通过CCK-8试验检测重组TmIFN-γ蛋白的细胞毒性作用,利用VSV-MDBK系统检测其抗病毒生物活性。结果显示,成功筛选得到高拷贝pPIC9k-TmIFN-γ重组转化毕赤酵母菌株,利用甲醇诱导可获得TmIFN-γ重组蛋白,该蛋白对细胞无毒性,具有显著抗病毒活性,其抗病毒生物效价为1.727×10~5IU/mL。本研究获得了具有抗病毒活性的TmIFN-γ,有助于进一步探索TmIFN-γ的功能和开发新型基因工程抗病毒药物。

重组猪干扰素α发酵纯化与抗病毒活性测定

本研究根据大肠杆菌的密码子偏好性,对UniProt数据库中的猪干扰素α序列(编号:P49879)进行优化,合成了相应的基因片段,并构建了pET-28a-INF-α原核表达载体。将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经过20 L发酵罐培养24 h,在OD 600为108时收获细胞。表达的猪干扰素α主要以包涵体的形式存在,经过变性、复性、镍亲和纯化与酶切等步骤,得到了无标签的猪干扰素α蛋白。SDS-PAGE电泳显示,该蛋白的分子量约为19 kDa,纯度高达95%。细胞病变抑制法测定表明,该蛋白的抗病毒活性为1.28×10^(7 )IU/mg。本研究成功获得了高纯度、高活性的猪干扰素α蛋白,为进一步推进蛋白药物在临床上的应用奠定了基础,为进一步重组蛋白工业化生产提供了理论依据。

铁蛋白与犬α干扰素的融合表达及抗病毒活性检测

为获得治疗犬病毒性传染病的特效药物,本研究将铁蛋白与犬α干扰素进行融合表达。首先根据GenBank中公布的犬α干扰素序列(IFN2a)合成模板,通过融合PCR连入铁蛋白编码基因的上游,并将该重组基因克隆至原核表达载体pCold-TF中,获得重组质粒pCold-TF-CaIFN2a-Fe。转化BL21后用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE),蛋白免疫印迹(Western blot)鉴定,获得约89 kDa的可溶性重组目的蛋白。重组蛋白经镍柱纯化后,使用犬肾细胞/水疱疹性口炎病毒(MDCK/VSV)微量细胞病变抑制法检测抗病毒活性,效价确定为8×104 IU/mg,显示出良好的应用前景。

羧甲基茯苓多糖对肠道病毒71型的抗病毒活性及其机制研究

为研究羧甲基茯苓多糖(CMP)对肠道病毒71型(EV71)的抗病毒活性,并探讨其作用机制,采用CCK-8法检测CMP对人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD细胞)增殖的影响;采用致细胞病变效应(CPE)法观察CMP对EV71感染引起的CPE的抑制作用;采用致半数细胞病理改变的病毒感染剂量(TCID50)法检测CMP对EV71感染性病毒颗粒的抑制水平;采用RT-qPCR法检测EV71结构蛋白VP1的表达;采用Western blotting法分析VP1、P62、LC3、Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白的表达。结果表明:不同质量浓度(0、250、500、1000μg/mL)CMP对RD细胞无明显的细胞毒性;与对照组相比,CMP在无毒性浓度范围内可有效抑制EV71的复制,且能够呈剂量依赖性地降低病毒感染引起的细胞病变效应;CMP可呈剂量依赖性地降低EV71病毒结构蛋白VP1的表达和子代感染性病毒颗粒的产生;CMP可下调EV71病毒感染的RD细胞中的LC3-Ⅱ、cleaved Caspase-3的表达。

连翘半日花烷型二萜和生物碱类化合物及其抗病毒活性

研究连翘抗炎、抗病毒活性部位中的化学成分及其抗病毒活性。通过综合运用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱及高效制备色谱等方法对连翘中的化合物进行分离纯化,并根据理化性质和波谱数据对化合物的结构进行鉴定,采用MTT法对得到的部分化合物进行抗病毒活性研究。结果表明,从连翘体积分数95%乙醇提取物的氯仿部位和乙酸乙酯部位分离得到9个半日花烷型二萜和6个生物碱类化合物。9个半日花烷型二萜分别为:19-hydroxy-ent-labda-8(17),13 E-dien-15-oic acid(1);ent-labda-8(17),13 Z-dien-15,19-dioic acid(2);ent-labda-8(17),13 E-dien-15,19-dioic acid(3);3β-hydroxy-8(17),13 E-labdadien-15-oic acid(4);enantio-labda-8(20),13 E-dien-15,18-dioic acid(5);Forsyshiyanin A(6);Forsyshiyanin B(7);18-hydroxy-7-oxolabda-8(9),13 E-diene-15-oic acid(8);3-hydroxy-8(17),13 E-labdadien-15-oic acid(9)。6个生物碱类化合物分别为:Forsyshiyanine A(10);(7 R)-6,7-dihydro-7-methyl-5H-cyclopenta[c]pyridine(11);Forsyshiyanine B(12);(-)-bicuculline(13);(-)-egenine(14);(-)-7′-O-methylegenine(15)。其中化合物10、12为首次从连翘中发现,也是首次从连翘属植物中发现。MTT结果显示,化合物1、2、10、12对于H1N1流感病毒及呼吸道合胞病毒的增长具有抑制作用。

厚朴酚对猪流行性腹泻病毒抗病毒活性研究

本研究旨在评价厚朴酚(MAG)在体外和体内对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的抗病毒活性。在体外试验中,以40.0µM的MAG处理感染PEDV后的IPEC-J2细胞系,利用实时定量PCR技术分析MAG对PEDV病毒基因及宿主炎症因子基因表达的影响。结果显示,与PEDV组相比,MAG处理显著降低了病毒相关蛋白(S、M、N)基因的表达水平,且同时抑制了多种炎症因子(IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-β、Mx1、ISG15)基因表达的上调,表明MAG不仅可直接抑制病毒,还可能通过调节宿主的免疫反应,减轻病毒感染造成的病理影响。在PED治疗试验中监测了仔猪的血清生化指标及相关细胞因子的表达水平,结果显示,相比PEDV组,MAG治疗组仔猪的血清生化指标均恢复至正常范围,同时结肠组织中S、M、N病毒基因及IL-8、IL-6、TNF-α、IFN-β和ISG15的mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)。进一步验证了MAG在体内对PEDV感染的抑制作用,提示MAG可能通过增强宿主免疫系统的调节功能来对抗病毒。综上所述,MAG的预处理可在一定程度上对抗PEDV感染,揭示了MAG作为潜在抗病毒干预策略的可能性,并为控制PEDV感染提供了新思路。

八仙草化学成分及其抗病毒活性

目的研究八仙草Galium aparine L.的化学成分及其抗病毒活性。方法八仙草60%乙醇提取物采用D101大孔树脂、硅胶、Sephadex LH-20、TLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用MTT比色法对其抗病毒活性进行测定。结果从中分离得到17个化合物,分别鉴定为槲皮素(1)、山柰酚(2)、芦丁(3)、异鼠李素(4)、香叶木素(5)、表没食子儿茶素(6)、表儿茶素没食子酸酯(7)、异牡荆素-2″-O-α-L-鼠李糖苷(8)、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷(9)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(10)、异鼠李素-3-O-芸香糖苷(11)、异鼠李素-3-O-芸香糖-7-O-β-D-葡萄糖苷(12)、β-谷甾醇(13)、β-胡萝卜苷(14)、丁香酸(15)、3,4-二羟基苯甲酸(16)、车叶草苷(17)。化合物7抗H5N1病毒半数有效浓度为(0.06±0.01)mmol/L。结论化合物12为首次从拉拉藤属植物中分离得到,化合物4~11、15~16为首次从该植物中分离得到。化合物7具有较强的抗H5N1病毒活性。

IFN-α对山羊副流感病毒3型的抗病毒活性

旨在探讨原核表达纯化的山羊α干扰素(IFN-α)对山羊副流感病毒3型(CPIV3)的抗病毒活性。通过分析山羊IFN-α的序列特点,比对不同种属IFN-α的同源性,进而构建山羊IFN-α成熟蛋白编码基因(去除信号肽基因序列)的原核表达载体pET-30a-gIFN-α,将其转化至感受态细胞Rosetta(DE3),IPTG诱导后镍柱及亲和纯化获得山羊IFN-α。利用RT-qPCR测定山羊IFN-α作用于牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cell,MDBK cell)后6种干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的相对表达水平;同时,利用TCID50及Western blot测定其对CPIV3的抗病毒活性。结果表明,原核表达的山羊IFN-α蛋白含量为0.20 mg·mL^(-1),Western blot结果表明表达产物相对分子质量约为20 ku,与预期结果相符。RT-qPCR结果显示,山羊IFN-α孵育MDBK细胞后,可显著刺激RSAD2、STAT1及ISG15等6种ISGs基因的转录上调。与对照组细胞相比,山羊IFN-α显著下调MDBK细胞中CPIV3的病毒滴度,Western blot结果显示,山羊IFN-α孵育显著下调CPIV3非结构蛋白C的表达水平。山羊IFN-α对CPIV3在MDBK细胞中的增殖具有显著抑制作用。本研究扩展了I型干扰素的研究范围,为CPIV3等反刍动物疫病的防控提供新的思路。

朱砂七化学成分及其体外细胞毒性、抗病毒活性研究

目的研究朱砂七Fallopia multiflora var.ciliinervis(Nakai)Yonekura&H.Ohashi化学成分及其体外细胞毒性、抗病毒活性。方法朱砂七75%乙醇提取物采用硅胶柱层析、半制备HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用MTT法测定体外细胞毒活性,CCK-8法测定体外抗病毒活性。结果从中分离得到20个化合物,分别鉴定为3-acetyl-4,5-dimethoxy-benzoic acid(1)、没食子酸甲酯(2)、没食子酸(3)、对羟基苯甲醛(4)、原儿茶酸(5)、3,4-二羟基苯甲醛(6)、丁香酸(7)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(8)、p-hydroxyphenethyl-O-β-D-glucoside(9)、2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-ethyl-O-β-D-glucoside(10)、反式-白藜芦醇(11)、顺式-白藜芦醇(12)、白藜芦醇-3-O-β-D-(2′-O-反式-肉桂酰基)-葡萄糖苷(13)、白藜芦醇-3-O-β-D-(2′-O-顺式-肉桂酰基)-葡萄糖苷(14)、白藜芦醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(15)、N-反式阿魏酰-3-甲氧基酪胺(16)、poke-weed cerebroside(17)、何首乌乙素(18)、9,10,13-三羟基十八烷酸(19)、正丁基-β-D-吡喃果糖苷(20)。化合物11对HCT116、SW620细胞的IC 50值分别为(30.87±2.7)、(56.11±0.49)μmol/L,化合物12对EV-A71病毒的抑制率为50.21%。结论化合物1为新天然产物,化合物9~10为首次从蓼科植物中分离得到,化合物8、12、14、17、19为首次从何首乌属植物中分离得到,化合物2、4~7、11、18为首次从该植物中分离得到。化合物11具有细胞毒性,化合物12具有抗病毒活性。

海藻多糖的抗病毒活性及其机制的研究进展

海藻多糖是海藻的主要组成成分,近年来受到国内外学者的高度重视,研究发现,海藻多糖结构复杂,具有多种生理活性,尤其具备显著的抗病毒活性。本文主要对国内外海藻多糖的抗病毒活性和相关作用机制研究进展进行总结,并对海藻多糖混合物的分离纯化方式进行总结和整理,以期为海藻多糖抗病毒活性的研究提供发展方向,并对关键性问题提供建议,促进海藻多糖在抗病毒新药研发方面发挥更重要的作用。

山羊α-干扰素基因克隆、原核表达及其抗病毒活性研究

为研究雷州山羊α-干扰素基因的遗传变异及重组α-干扰素的抗病毒活性,采用RT-PCR扩增雷州山羊α-干扰素基因,分析其核苷酸序列;采用PCR方法扩增山羊α-干扰素基因成熟肽编码序列,构建原核表达载体pET-mIFN-α,并在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达;采用SDS-PAGE和Western-blot检测重组蛋白rG-mIFN-α;通过细胞病变抑制法测定其抗小反刍兽疫病毒(PPRV)和山羊痘病毒(GPV)活性。结果表明,雷州山羊α-干扰素全基因由570个核苷酸组成,编码189个氨基酸;与GenBank上发表的山羊、林麝、弯角大羚羊、黄牛、瘤牛、绵羊、猪、人和鼠的核苷酸序列同源性分别为99.8%、95.6%、96.8%、94.7%、94.7%、96.8%、81.6%、77.8%和70.0%;氨基酸序列同源性分别为100%、92.6%、94.7%、92.1%、93.2%、93.7%、67.9%、61.6%和55.3%,提示反刍动物α-干扰素基因的核苷酸和氨基酸序列高度保守;rG-IFNα主要以包涵体形式存在,分子质量约32 ku;重组山羊α-干扰素能显著抑制PPRV和GPV感染引起的细胞病变,其抗PPRV和GPV效价分别为1.6×10^(4)U/mg和1.35×10^(4)U/mg。

大孔树脂纯化青蒿多酚的工艺设计及其体外抗病毒活性研究

本试验比较了AB-8、NKA-9、HPD-100、DM130、D101及X-5六种大孔树脂对青蒿总多酚的纯化效果,筛选出富集青蒿多酚的最佳大孔树脂型号为HPD-100。采用单因素试验确定其最佳工艺参数:上样液pH值为2.0,质量浓度为50 mg/mL,上样量为13 BV,静态吸附2 h;洗脱液是体积分数为70%乙醇溶液,用量为5 BV。纯化后的青蒿总多酚纯度较纯化前增加了1.63倍。纯化后的青蒿总多酚对RSV、HSV-1和HSV-2均表现出显著的体外抗病毒活性,而对EV71未表现出较好的抑制效果。

广谱抗病毒抗生素17997体内外抗病毒活性研究

从我国云南省土壤中分离到１株放线菌，其产生的抗生素１７９９７具有广谱抗病毒作用。在细胞培养内对单纯疱疹病毒１型、单纯疱疹病毒２型、人免疫缺陷病毒１型、水疱性口炎病毒及柯萨奇病毒Ｂ３均有显著抑制活性，ＩＣ５０在μｍｏｌ／Ｌ水平。其在小鼠体内对单纯疱疹病毒１型及２型所致疱疹性脑炎有确切治疗效果，对死亡保护率及平均生存日与对照组相比有统计意义的显著差别。

桑叶提取物的抗病毒活性检测

桑叶作为中药或功能饮品的重要成分在民间和临床上广泛应用。用70%乙醇对广东桑、白桑、鸡桑、鲁桑等桑种共20个品种的桑叶进行浸提,并依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到不同萃取组分及剩余水相组分。利用细胞病变减少法(CPE法)检测发现多个桑叶样品的萃取组分或水相组分含有抗病毒活性物质,且抗病毒活性具有选择性。其中,能有效抑制单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的样品最多,6个桑品种桑叶的乙酸乙酯萃取组分对HSV-1的半数抑制浓度(IC50)≤12.5μg/mL;广东桑品种桑叶的水相组分和石油醚萃取组分具有较高的抗甲型流感病毒(Flu A)活性;部分桑品种桑叶的萃取组分对登革病毒2型(DV2)也有一定的抑制活性;20个桑品种桑叶的4种萃取组分对柯萨奇B3病毒(CVB3)均无抑制活性。上述结果表明桑叶含有丰富、较为广谱的抗病毒活性成分,但不同桑品种间的桑叶化学成分及抗病毒活性有一定差异。

铌取代型钨硅杂多酸盐的合成及抗病毒活性研究

杂多化合物因具有独特的结构和优异的抗病毒活性［１，２］，近年来受到普遍重视，但研究的热点主要集中在抗艾滋病毒（ＨＩＶ）、疱疹病毒（ＨＳＶ）、抗肿瘤等方面［３，４］，而忽视了对植物病毒防治的研究．植物病毒对农作物的危害很大，给农业生产带来重大损失．我们...

荔枝核提取物体外抗病毒活性及其机制研究

目的:研究荔枝核提取物(LSE)的体外抗病毒活性,并初步研究其抗病毒的作用机制。方法:采用细胞病变效应(CPE)减少法和MTT法检测LSE对柯萨奇B3病毒(CoxB3)、呼吸道合胞病毒(RSV)以及单纯疱疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)的体外抗病毒活性,并通过观察直接杀病毒作用、对宿主细胞的保护作用、抑制病毒吸附作用以及在病毒感染后不同时间加入实验,对LSE抑制HSV-1的作用机制进行探讨。结果:LSE有一定的细胞毒性,它不能抑制CoxB3在宿主细胞内的增殖,但对RSV、HSV-1和HSV-2表现出明显的浓度依赖性抗病毒活性,其IC50值分别为32.3,27.9和20.4μg/mL。该提取物预培养Vero细胞后不能保护细胞免受HSV-1感染,但它对HSV-1有直接的灭活作用。LSE可影响HSV-1对Vero细胞的吸附,当浓度为31.3μg/mL时对病毒吸附的抑制率为51。LSE对HSV-1在细胞内的增殖表现出很强的抑制活性。结论:LSE具有较强的体外抗RSV和HSV活性,它对HSV的抑制作用可能通过多种方式和途径实现。

五倍子中酚性化学成分及其抗病毒活性

采用硅胶、ODS、Toyopearl HW-40(s)、制备型HPLC等多种色谱技术和波谱学方法,结合物理化学性质,从五倍子的95%乙醇提取物中分离并鉴定了7个化合物,分别为benzoic acid,3,4-dihydroxy-5-[(3,4,5-trihydroxybenzoyl)oxy]-,5-ethoxycarbonyl-2,3-dihydroxyphenyl ester(1)、trigallic acid(2)、1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose(3)、莽草酸(4)、没食子酸(5)、没食子酸甲酯(6)、没食子酸乙酯(7)。其中,化合物1为新化合物,化合物2为首次从该属植物中分离得到。对五倍子中分离得到的单体化合物进行了体外抗HSV-1、RSV A strain、RSV Long strain病毒活性测试,化合物3表现出显著的抗病毒活性,其IC50分别为13.3,3.3和3.3 mmol/L。

猪干扰素α在昆虫细胞中分泌表达及其抗病毒活性检测

【目的】为获得重组猪干扰素α。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素α基因插入供体质粒pFastBacⅠ多克隆位点,置于pH启动子控制下,昆虫可识别的蜂素信号肽(honeybeemelittinsignalpeptide,HBM)取代猪干扰素α原有信号肽以实现分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。【结果】重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性,结果表明:昆虫细胞上清的抗病毒效价达到1.07×105U·ml-1,昆虫细胞裂解液的抗病毒效价为3.15×104U·ml-1。【结论】应用蜂素信号肽实现猪干扰素α在昆虫细胞上分泌表达,为临床上防治猪病毒性疫病奠定了基础。

Keggin结构钼锗稀土杂多蓝的合成性质及抗病毒活性研究

采用电解法合成了一系列 Keggin结构钼锗稀土二电子 Ln H3 [Ge Mo12 O4 0 ]· n H2 O和四电子 Ln H5[Ge Mo12 O4 0 ]·n H2 O杂多蓝 ( Ln=La,Ce,Pr,Nd,Sm,Eu,Gd) .通过 IR,UV-Vis,DTA,XPS和 ESR等方法对产物进行了表征 ,确认杂多蓝仍保持 Keggin结构 ,但结构有轻微的畸变 .研究了 Pr( 2 )对小鼠感染FM1的治疗效果 ,并与阳性对照药物病毒唑作了比较 .结果表明 ,Pr( 2 )具有很好的抗病毒活性 ,甚至超过阳性对照药物病毒唑的抗病毒效果 ,比较两种给药途径 ,结果发现 。

鸡α干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒活性测定

通过PCR技术从罗曼鸡肝脏基因组中扩增鸡α干扰素(ChIFN-α)全基因,并克隆和测序。序列分析表明,ChIFN-α基因全长为582 bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因489 bp,利用基因重组技术构建了重组质粒,使ChIFN-α置于原核表达载体pQE30的T5启动子下并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag融合。经酶切和PCR鉴定,DNA测序证实重组质粒pQEChIFN-α构建正确;将pQEChIFN-α转化大肠杆菌M15感受态细胞,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot证实表达出分子质量为19.80 kDa的融合蛋白。表达的蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性处理后,在Vero细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为1.16×103U/mg。本研究成功表达了ChIFN-α,表达的重组蛋白具有一定的生物活性。