转抗虫基因107杨对根际和内源细菌群落的影响

为研究转抗虫基因对根际和内源细菌群落的影响,以转抗虫基因107杨田间对比试验林为对象,采用高通量测序技术对转基因株系和对照株系根际土壤细菌、树干韧皮部和根系内生细菌群落结构组成及多样性进行对比分析。结果显示:(1)土壤样品中有效序列平均在30000以上,杨树组织有效序列平均在300000以上。(2)转基因株系细菌物种组成与对照株系的极其相似,酸杆菌门与变形菌门为转基因和非转基因株系根际土壤的优势菌门,占比分别为16.6%和21.9%;蓝藻菌门和变形菌门为转基因和非转基因株系韧皮部的优势菌门,所占的比率分别为54.8%和59.2%;变形菌门为转基因和非转基因株系根部的优势菌门,所占的比率分别为40.7%和58.8%。(3)转基因和非转基因株系在细菌群落的丰富度和多样性上均没有表现出明显的差异,但不同部位之间差异显著。结果表明:转基因107杨没有对根际土壤和内生细菌造成显著影响,明确了转抗虫基因107杨不同部位细菌群落特征,为转抗虫基因107杨的生物安全评价提供了有益的参考。

转抗虫基因棉花和玉米花粉对家蚕生长发育影响的评价

苏云金杆菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)杀虫蛋白基因和蛋白酶抑制剂基因是培育转抗虫基因植物的两大类基因。为了正确评价转抗虫基因作物花粉对非靶标重要经济昆虫的安全性 ,本试验以家蚕为对象 ,研究转cry1Ac基因棉花、转cry1A +CpTI双价抗虫棉花以及转cry1Ab基因玉米花粉对家蚕生长发育的影响。结果表明 ,与非转基因常规棉花或玉米花粉以及无花粉对照相比 ,转抗虫基因棉花或转抗虫基因玉米花粉对家蚕各龄期的死亡率、蛹重、茧重、茧层重、化蛹率、羽化率和产卵量均无多大影响 ,且无明显的剂量效应。虽然取食转抗虫基因花粉后家蚕一龄历期有所延长 ,但与非转基因的花粉处理相比 ,则无显著差异 ;同样 ,家蚕三龄眠蚕体重虽与无花粉对照相比表现出较大差异 ,但其体重均大于对照。可见 ,转抗虫基因棉花和玉米花粉对家蚕的历期和体重亦无多大影响。综上所述 ,转抗虫基因棉花和玉米花粉对家蚕的生长发育不会产生明显的负面影响。

农杆菌介导法获得辣木PKM-1转双价抗虫基因(sck+Cry1-Ac)愈伤组织

[目的]辣木生产中鳞翅目害虫辣木瑙螟危害日益严重,为提高辣木抗虫性,使用农杆菌介导法将抗虫基因导入辣木,以期获得抗虫转基因转化子。[方法]利用内质网定位修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)和苏云金芽孢杆菌基因(Cry1-Ac)筛选标记基因nptⅡ;利用农杆菌EHA105介导遗传转化辣木PKM-1的叶片和茎段,以卡那霉素筛选获得抗性植株;采用PCR和NPTⅡImmunoStrip检测确定nptⅡ基因的整合与表达。[结果]辣木叶片和茎段无需预培养可直接进行农杆菌转化,最佳转化条件为:工程菌液OD_(600)值为0.2,侵染时间为2 min,共培养时间为2 d;乙酰丁香酮添加与否对获得抗性愈伤率的影响不明显;200 mg/L提门叮可有效抑制农杆菌生长;卡那霉素抗性愈伤组织PCR检测表明:标记基因nptⅡ已成功整合到辣木PKM-1基因组中;NPTⅡImmunoStrip检测表明NPTⅡ蛋白水平得以表达。[结论]获得了辣木PKM-1卡那霉素抗性愈伤组织,为辣木抗虫分子育种提供了材料。

水稻抗虫基因工程研究新进展

水稻抗虫基因工程为防治水稻害虫开辟了一条崭新的道路。尽管目前已经有许多优良的抗虫转基因水稻株系(种)被批准进入中间试验或环境释放 ,但是其抗虫水稻基因还存在着许多令人不满的缺点 ,如外源基因的表达水平不高 ,转基因植株的抗虫持久性不长等问题。因此 ,本文对近年来水稻抗虫基因工程所取得的最新研究进展进行了比较全面的综述 ,特别是对目前已广泛用于水稻抗虫基因工程的Bt杀虫晶体蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因和外源凝集素基因等单基因策略进行了一一详述 ,并对水稻抗虫基因工程中的多基因策略进行了简单的介绍。

小黑杨转双价抗虫基因的研究

用根癌农杆菌介导的叶盘法,将蜘蛛杀虫肽与Bt基因C肽序列的融合基因导入小黑杨(Populus simonii×P.nigra),所获得的3株卡那霉素抗性再生植株进行PCR和PCR-Southern杂交检测的结果均为阳性,Southern杂交检测的结果2株为阳性。抗虫试验结果显示,3个转基因株系均具有明显的抗虫效果,能显著抑制舞毒蛾幼虫的生长发育,表现出强烈的抗虫作用。

白菜抗虫基因转化受体体系的建立

就白菜基因转化受体系统的诸多因素进行了试验 。

转CryIA和CpTI双价抗虫基因大豆的获得与稳定表达

【目的】将抗虫基因转入栽培大豆中,提高大豆的抗食心虫能力。【方法】利用大豆未成熟子叶体细胞胚发生系统高效转化体系,将携带有人工合成的CryIA杀虫基因和CpTI基因的高效双价杀虫基因植物表达载体pGBI121S4ABC转化到大豆主栽品种吉林20与吉林27中。【结果】GUS活性分析、PCR、Southern blot检测证明,目的基因已整合到受体大豆基因组中。T1代转基因大豆抗虫测定表明,转基因材料虫食率比对照显著降低,抗虫能力显著提高。【结论】T3～T5连续3代接虫测定结果表明,转基因大豆株系0-195和0-150的虫食率均比对照低大约30%,其抗虫能力已基本稳定。

转抗虫基因植物生态安全性研究进展

转抗虫基因植物如Bt棉花等已在美国、中国和澳大利亚等国家大规模商业化种植 ,有关转抗虫基因植物潜在的生态风险已引起广泛的关注。该文综述了转抗虫基因植物研究应用现状与安全性研究进展。主要内容包括 :转抗虫基因植物的种类及其对靶标害虫的抗性 ,对非靶标害虫和天敌发生的影响 ,对农田生态系统生物多样性的影响 。

基因枪法转化水稻(Oryza sativaL.)获得可育的转抗虫基因水稻再生植株

应用基因枪 ( particlebombardment)转化技术成功地将豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpeatrypsininhibitor,CpTI)基因分别导入三个水稻粳稻栽培品种 (OryzasativaL .,japonica)中花 8、中花 10和中作 32 1的幼胚和胚性愈伤组织中 ,并由此获得了可育的再生植株 ,抗性植株的筛选频率为 6.1%～ 12 .2 4 %。经PCR、Southernblot分子检测和ELISA检测等证实所获得的潮霉素抗性植株为转基因植株。抗虫性分析结果表明 ,部分转基因水稻植株对玉米螟虫 (Ostrinianubilalis)

转Bt+GNA双价基因抗虫棉花中抗虫基因及其抗虫性的遗传稳定性

采用PCR和PCR Southern跟踪检测 ,Bt和GNA两个抗虫基因在转Bt+GNA双价基因抗虫棉花TL1的 3个连续世代均稳定存在 ,完全连锁遗传 ;室内棉铃虫生物测定表明 ,该转基因植株的 3个世代都高抗棉铃虫 ,各世代之间抗性水平一致 ,没有显著性差异 ;温室蚜虫抗性试验显示 3个世代均对蚜虫具有较好的抑制作用 ,且抑制效果相当。因而 ,两个抗虫基因在转Bt+GNA双价基因抗虫棉花TL1中能稳定地遗传和表达。

转抗虫基因优良籼型恢复系的获得及其外源基因的遗传稳定性研究

用基因枪法将雪花莲外源凝集素基因 (gna )转移到优良籼型杂交稻恢复系蜀恢 5 2 7中 ,通过 PCR、PCR- South-ern blotting和 Southern blotting等分子方法检测证明 ,外源基因已稳定遗传到转基因第三代 (T2 )。转基因第一代植株 (T0 )在株高和结实率上与相应的组培、种子实生苗植株相比 ,发生明显的不可遗传的变异。随着繁殖代数的增加 ,转基因植株恢复到与对照植株一致。还讨论了 DNA微量提取法在转基因后代筛选中的运用。

双价抗虫基因陆地棉转化植株的获得

利用根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＳｍｉｔｈｅｔＴｏｗｎｓｅｎｄ）Ｃｏｎｎ）介导法将含有豌豆外源凝集素（ｐｅａｌｅｃｔｉｎ，ＰＬｅｃ）基因和大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂（ｓｏｙｂｅａｎＫｕｎｉｔｚｔｒｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＳＫＴＩ）基因的双价抗虫基因植物表达载体ｐＢｉｎＬＫ用于陆地棉（ＧｏｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ．）栽培品种“新陆早１号”、“新陆中２号”、“冀合３２１”和“辽９”的转化。棉花无菌苗下胚轴经过与根癌农杆菌共培养、卡那霉素抗性愈伤组织的筛选、体细胞胚状体的诱导和植株再生等阶段成功地获得了双价抗虫基因陆地棉转化植株。ＮＰＴⅡ的ＥＬＩＳＡ检测、ＰＣＲ鉴定和ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ检测证实，两个外源抗虫基因同时存在于再生植株基因组内。抗虫测试结果表明。

白桦抗虫基因转化的初步研究

用根癌农杆菌介导法对白桦 (Betulaplatyphylla)进行转化 ,获得了转化再生植株。卡那霉素抗性愈伤组织产生率达 10 %～ 2 2 % ,抗性不定枝的生根率达 80 %以上。经分子生物学检测 ,在卡那霉素抗性转化植株中 ,有 34%检测出GUS活性 ,76 .5 %的卡那霉素抗性植株的Southern斑点杂交呈阳性反应。初步证明 。

转不同抗虫基因741杨的抗虫选择性

以转抗虫基因(BtCry3A)741杨7个株系和转双抗虫基因(BtCrylAc+API)741杨2个株系为材料,从分子生物学检测、毒蛋白的表达、抗虫性检测3个方面,研究转不同Bt基因741杨对不同类型害虫的抗虫选择性。结果表明:2种Bt抗虫基因分别在转基因741杨不同株系中稳定存在。转BtCry1Ac的2个株系毒蛋白含量分别为0.0127%和0.0099%,具高抗虫性的株系pb29的毒蛋白含量高于中等抗虫性的株系pb17。转BtCry3A基因的5个株系毒蛋白含量为0.0678%～0.1521%,不同株系间存在一定差异。BtCry3型的毒蛋白表达量非常高,是BtCry1型的10倍。用对鳞翅目害虫具高抗虫性和中等抗虫性的转双抗虫基因(BtCrylAc+API)741杨株系叶片饲养鞘翅目害虫柳蓝叶甲,幼虫死亡率达到28.4%～42.8%,转基因株系与未转基因的对照没有明显差异。用转BtCry3A基因741杨不同株系叶片饲养柳兰叶甲幼虫,均表现出高抗虫性,死亡率在2天之内均可达到100%;而饲养杨扇舟蛾幼虫,死亡率为0～42.86%,未表现出明显抗虫性,与未转基因对照没有明显差异。

利用花粉管通道法将抗虫基因(cryV)转入大豆的研究

利用花粉管通道法,在大豆的盛花期将外源抗虫基因(cry V)转入到大豆中,转化成活率达43.88%,成荚率达33.6%。将收获的的种子种植在大豆所温室中,通过卡那霉素筛选、PCR鉴定,Southern-blot检测和RT-PCR检测,共检测出5株阳性植株,确定外源抗虫基因(cry V)已转入到大豆中,转化率达1.8‰。

转两类抗虫基因棉花优良纯合品系的选育

用含合成的Cry1Ac杀虫蛋白嵌合基因 (Bt2 9K)及慈菇蛋白酶抑制剂B(API B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体 ,通过根癌农杆菌介导转化棉花生产品种冀合 32 1,获得了一批抗卡那霉素的转化再生植株。在对转化再生植株进行PCR、卡那霉素抗性和抗虫性测定的基础上 ,经 6代筛选培育出棉铃虫抗性 90 %以上且农艺性状优良的 9个转双抗虫基因棉纯合品系。各纯合株系子代植株的抗虫性及部分序列检测结果进一步表明上述Cry1Ac嵌合蛋白基因是能稳定遗传的。这些品系具有很好的农艺性状 ,其结铃性和纤维比强度明显高于转化受体冀合 32 1,这些纯合系可直接用于生产或作为双抗虫棉种质利用。

根癌农杆菌介导的转双价抗虫基因(CryIA＋CpTI)苎麻

利用苎麻下胚轴高频再生体系,将携带人工合成的CryIA杀虫基因和CpTI基因的高效双价杀虫基因的植物表达载体pGBI4ABC转化到苎麻主栽品种中苎1号中。经根癌农杆菌侵染和共培养后,用50mgL-1卡那霉素+300mgL-1头孢霉素筛选共获得32株抗性植株;PCR检测显示26株为阳性,占80%。Southern杂交结果证实,外源基因已经整合到苎麻的基因组中。这项研究为最终创造兼抗鳞翅目及鞘翅目等害虫的苎麻种质材料奠定了基础。

利用花粉管通道技术将抗虫基因导入大豆的研究

利用花粉管通道技术,将Bt基因导入大豆品种。对132株D1代植株进行PCR检测,得到5株阳性转化植株。再将获得的5株D1代阳性转化植株的种子放在温箱中发芽,提取DNA进行检测,结果得到2株D2代稳定遗传的阳性转化植株。用X-Glue溶液对转Bt基因132株D1代植株进行检测,结果没有发现阳性反应。另外,本实验还采用荧光制片方法从植物组织结构的角度证明利用花粉管通道方法导入外源基因的可行性,并提出花粉管通道方法操作的最佳时间为授粉后6～20h。

农杆菌介导抗虫基因GmCry1F转化玉米的研究

培育转基因抗虫玉米是防治玉米螟虫的有效途径之一。本研究通过对来源于苏云金芽孢杆菌Cry1F野生型基因编码区密码子优化改造获得新型抗虫基因Gm Cry1F,使用农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化法将目的基因转入玉米材料Hi-II,最后应用PCR法与蛋白免疫学法对试验结果进行鉴定检测。结果表明:成功构建了植物表达载体CUB-ubi::Gm Cry1F-35s::bar,经光照培养分化获得到转化苗25株,其中有17株的PCR和试纸条检测均呈阳性,说明Gm Cry1F基因已经整合到玉米基因组中。这一研究结果为下一步开展转基因抗虫玉米育种工作提供了较好的研究材料,也为玉米抗虫基因工程育种研究提供参考。